不同细胞消化方式对靶向CD3L1的抗体结合肿瘤细胞的影响

张远, 邓守言, 许杰

复旦学报(医学版) ›› 2025, Vol. 52 ›› Issue (03) : 429-436.

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复旦学报(医学版) ›› 2025, Vol. 52 ›› Issue (03) : 429-436. DOI: 10.3969/j.issn.1672-8467.2025.03.014
方法技术

不同细胞消化方式对靶向CD3L1的抗体结合肿瘤细胞的影响

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The impact of different cell digestion methods on the binding of an anti-CD3L1 antibody to tumor cells

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摘要

目的: 探讨不同的细胞消化方式对靶向CD3L1的人源化单克隆抗体(代号:5H)结合肿瘤细胞的影响。方法: 使用胰蛋白酶溶液或胶原酶与中性蛋白酶混合液,在室温和37 ℃两种消化温度下对不同贴壁肿瘤细胞系进行离解、传代和收集。随后,通过流式细胞术和共聚焦显微镜成像,比较不同消化条件下肿瘤细胞与5H抗体的结合差异。结果: 使用胰蛋白酶溶液在室温离解和传代的细胞仅表现出与5H抗体的微弱结合,而相同的细胞系用胶原酶与中性蛋白酶混合液在室温消化后,则显示出与5H抗体的明显结合,两组之间抗体结合信号及抗体染色阳性细胞比例的差异有统计学意义(P < 0.01)。胶原酶与中性蛋白酶混合液处理的细胞与抗体的结合信号呈现出抗体浓度依赖性,可用于受体占位分析。相比室温,37 ℃的条件下消化后略微削弱了靶细胞与5H抗体的结合,但该差异无统计学意义。结论: 胰蛋白酶溶液消化方式显著削弱了抗CD3L1抗体与肿瘤细胞的结合,而胶原酶与中性蛋白酶混合液的消化方式能有效保护该结合。在选择适宜的消化酶处理细胞的前提下,消化温度的影响相对次要。在研究抗体药物与细胞表面抗原相互作用时,应采用合理且经过优化的细胞消化方案。

Abstract

Objective: To investigate the impact of different cell digestion methods on the binding of a humanized monoclonal antibody targeting CD3L1 (designated as 5H) to tumor cells. Methods: Trypsin solution and a collagenase/neutral protease cocktail, combined with two digestion temperatures (room temperature and 37℃), were used to dissociate, passage, and collect various adherent tumor cell lines. Flow cytometry and confocal microscopy were then employed to compare differences in 5H antibody binding under different cell digestion conditions. Results: Cells dissociated and passaged with trypsin solution at room temperature exhibited only weak binding to the 5H antibody, whereas those treated with the collagenase/neutral protease cocktail at room temperature showed significantly stronger binding. There were notable differences in the binding signal and the proportion of antibody-stained positive cells between the two groups (P < 0.01). Additionally, cells treated with the collagenase/neutral protease cocktail exhibited antibody binding signals that were dependent on the concentration of the 5H antibody, enabling receptor occupancy analysis. Compared to digestion at room temperature, treatment at 37℃ resulted in a slight reduction in the binding of target cells to the 5H antibody, however, this difference was not statistically significant. Conclusion: Trypsin digestion significantly reduces the binding of the anti-CD3L1 antibody to tumor cells, whereas the collagenase/neutral protease cocktail effectively preserves it. With an appropriate choice of digestion enzymes, the impact of digestion temperature is relatively minor. These findings suggest that optimized cell digestion protocols should be employed when studying interactions between antibody drugs and cell surface antigens.

关键词

CD3L1 / 胞膜蛋白 / 细胞消化 / 抗体-抗原结合 / 肿瘤免疫治疗

Key words

CD3L1 / cell membrane proteins / cell digestion / antibody-antigen binding / cancer immunotherapy

引用本文

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张远 , 邓守言 , 许杰. 不同细胞消化方式对靶向CD3L1的抗体结合肿瘤细胞的影响[J]. 复旦学报(医学版), 2025, 52(03): 429-436 https://doi.org/10.3969/j.issn.1672-8467.2025.03.014
Yuan ZHANG , Shou-yan DENG , Jie XU. The impact of different cell digestion methods on the binding of an anti-CD3L1 antibody to tumor cells[J]. Fudan University Journal of Medical Sciences, 2025, 52(03): 429-436 https://doi.org/10.3969/j.issn.1672-8467.2025.03.014
中图分类号: R730.3   

肌醇1,4,5-三磷酸受体相互作用蛋白样1(inositol 1,4,5 triphosphate receptor interacting protein like 1,ITPRIPL1)是一种单次跨膜蛋白,在既往研究中[1-2]该蛋白被鉴定为CD3ε的天然配体,因此也被称为CD3L1。CD3L1在多种肿瘤细胞表面异常高表达,通过抑制T细胞功能,促进肿瘤的免疫逃逸及肿瘤细胞的增殖[1]。CD3L1在肿瘤中的特异性高表达,使其成为肿瘤靶向治疗的理想靶标。
针对CD3L1这一新发现的肿瘤相关抗原,可通过查询TCGA和Protein Atlas数据库,了解其在不同类型肿瘤中的RNA表达水平;也可通过Western blot实验检测其在多种肿瘤细胞中的蛋白表达水平(这一水平为胞浆蛋白和胞膜蛋白的总和)。然而,作为CD3ε的配体,CD3L1主要通过其分布在胞膜的部分发挥作用,因此更为重要的是确认CD3L1在肿瘤细胞表面的表达水平,通常采用流式细胞术实现这一目的[3-4],在此过程中,抗体与肿瘤细胞的结合信号能够反映细胞表面靶抗原的表达水平。此外,在研发靶向细胞表面受体的抗体药物时,为建立量效关系、构建药代动力学-药效学模型、指导临床前和早期临床试验的剂量设计,并评估用药安全性,有必要分析给药后的受体占位情况[5-6],这一重要指标的确立同样依赖于抗体与抗原结合信号的精确测定[7]。因此,检测抗体与抗原的结合对于新靶点的探索及抗体药物的开发具有重要意义。然而,该检测结果的可靠性往往受制于样品制备的各个环节,其中对于组织或者贴壁细胞而言,细胞消化过程可能是最为关键的步骤,粗糙的、未经过优化的细胞离解方式很可能损伤细胞,进而影响实验结果的准确性[8-9]。消化酶在细胞消化过程中扮演关键角色,但在促进细胞离解的同时,其可能损伤细胞及其表面蛋白。因此,研究不同消化酶及其他消化条件对抗体结合胞膜靶蛋白的影响,有利于确保实验结果的准确性和可靠性。
本研究采用两类含酶消化液,即胰蛋白酶溶液或胶原酶与中性蛋白酶混合液,并在室温和37 ℃两种温度下对贴壁肿瘤细胞进行离解、传代和收集。随后,将靶向CD3L1的人源化单克隆抗体(代号:5H)与不同消化条件下收集的细胞进行结合,并通过流式细胞术和共聚焦显微镜成像分析抗体与细胞的结合情况。研究旨在明确不同细胞消化方式是否影响5H抗体与CD3L1抗原的结合,并进一步优化贴壁肿瘤细胞的消化流程,以支持后续的CD3L1相关研究。同时,通过对比不同消化酶和消化温度下抗体与抗原结合信号的差异,在方法学层面为膜蛋白检测、新型抗体药物的筛选及受体占位率分析提供可借鉴的技术策略。

材料和方法

实验试剂与仪器   DMEM细胞培养基、RPMI-1640细胞培养基、PBS溶液、100×青霉素/链霉素双抗溶液(Penicillin-Streptomycin,PS)以及胰蛋白酶溶液(0.25%胰酶浓度)均购自大连美仑生物公司,胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)购自美国Gemini公司,胶原酶与中性蛋白酶混合液(Accutase溶液[10-11])购自美国Sigma公司,4%多聚甲醛购自北京索莱宝科技公司,牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)购自上海生工生物公司,早期内体标记EEA1抗体购自美国CST公司,对照IgG1抗体购自上海百英生物公司,支原体检测试剂盒购自美国InvivoGen公司,细胞染色缓冲液、TritonX-100、羊抗人IgG-AF488荧光二抗、驴抗兔IgG-AF594荧光二抗均购自美国Thermo Fisher公司。流式细胞仪购自美国BD公司,共聚焦荧光显微镜购自德国徕卡公司。
细胞株与细胞培养   实验所用4种贴壁细胞为人黑色素瘤细胞系A375、人横纹肌肉瘤细胞系RD、人乳腺癌细胞系MCF7、人结直肠癌细胞系RKO,均购自中科院细胞库。A375、RD、MCF7细胞均培养在含10% FBS和1% PS的DMEM细胞培养基中;RKO细胞培养在含10% FBS和1% PS的RPMI-1640细胞培养基中。细胞株均常规使用支原体检测试剂盒进行支原体污染检测,确认未受支原体污染。
细胞消化   吸去培养瓶内细胞培养基,加入3 mL PBS洗涤1遍。随后,根据实验目的,采用不同的消化方式对各细胞系进行消化,第一组细胞使用1 mL胰蛋白酶溶液在室温消化,第二组细胞使用1 mL胶原酶与中性蛋白酶混合液在37 ℃消化,第3组细胞使用1 mL胶原酶与中性蛋白酶混合液在室温消化。3组细胞的消化时间统一设定为3 min。该消化时间既能确保大部分肿瘤细胞被吹打脱落,也能避免过度消化对细胞的影响。
流式细胞术
不同细胞消化方式下的肿瘤细胞与5H抗体结合检测  将各肿瘤细胞系分别经上述3种不同的消化方式处理后收集,分配至1.5 mL离心管中,每管约1×106个细胞,后续操作过程均在冰上进行。首先,使用预冷的细胞染色缓冲液洗涤细胞2次。随后,将抗CD3L1抗体5H与阴性对照IgG1抗体分别用细胞染色缓冲液稀释至20 μg/mL(1 μg/mL=1 mg/L,下同),每管取100 μL相应抗体稀释液重悬细胞,每种抗体染色设置3个重复。重悬后,将样品置于冰上孵育1 h。孵育结束后使用细胞染色缓冲液洗涤细胞2次。随后,将羊抗人IgG-AF488荧光二抗按1∶200比例稀释至细胞染色缓冲液中,每管取100 μL二抗稀释液重悬细胞。重悬后,将样品置于冰上孵育30 min。孵育结束后使用细胞染色缓冲液洗涤细胞2次。使用300 μL细胞染色缓冲液重悬细胞并检测样品的几何平均荧光强度(geometric mean fluorescence intensity,GMFI)。
5H抗体结合肿瘤细胞的受体占位分析  使用胶原酶与中性蛋白酶混合液在室温消化RD和RKO细胞,收集细胞并分配至1.5 mL离心管中,每管约1×106个细胞。首先,使用细胞染色缓冲液洗涤细胞2次。随后,将各管细胞重悬于500 μL细胞固定液(4%多聚甲醛),于室温下固定15 min。固定结束后使用细胞染色缓冲液洗涤细胞2次。将抗CD3L1抗体5H用细胞染色缓冲液从40 μg/mL开始进行4倍梯度稀释,最终形成7个浓度梯度,分别是40、10、2.5、0.625、0.156 25、0.039 063、0.009 766 μg/mL。每个浓度梯度设置3个重复。每管取100 μL相应抗体稀释液重悬细胞,对照管则直接用100 μL细胞染色缓冲液重悬细胞,重悬后将样品置于冰上孵育1 h。孵育结束后使用细胞染色缓冲液洗涤细胞2次。将羊抗人IgG-AF488荧光二抗按1∶200比例稀释至细胞染色缓冲液中,每管取100 μL二抗稀释液重悬细胞,重悬后将样品置于冰上孵育30 min。孵育完成后使用细胞染色缓冲液洗涤细胞2次。使用300 μL细胞染色缓冲液重悬细胞并检测样品的GMFI值。根据样品测得的GMFI值计算出各浓度一抗下的受体占位率,计算公式为:受体占位率(%)= GMFIGMFIGMFIGMFI×100%[12]
细胞免疫荧光染色  通过上述3种不同的消化方式收集RD细胞,将各组收集的细胞分别以每皿1×105个细胞铺板于20 mm共聚焦培养皿中,置入37 ℃细胞培养箱培养一夜。次日将培养皿取出,置于冰上。使用预冷的PBS轻柔清洗细胞2遍。将5H抗体用预冷的PBS稀释至20 μg/mL,每皿加入200 μL 5H抗体稀释液,置于冰上孵育1 h。孵育结束后,用预冷的PBS轻柔清洗细胞2遍。随后每皿加入200 μL细胞固定液(4%多聚甲醛),于室温下固定30 min。固定结束后用PBS洗涤细胞2遍。随后每皿加入200 μL透膜封闭液(含有3% BSA和0.3% Triton X-100的PBS溶液),于室温孵育1 h。孵育结束后,将兔源早期内体标记EEA1抗体以1∶100的比例稀释至透膜封闭液中,并向每皿中加入200 μL抗体稀释液,置于4 ℃环境孵育过夜。次日,用PBS轻柔清洗细胞后,将羊抗人IgG-AF488荧光二抗以及驴抗兔IgG-AF594荧光二抗用透膜封闭液以1∶500的比例稀释至同一管,每皿加入200 μL混合二抗稀释液,于室温孵育2 h。孵育结束后用PBS洗涤细胞2遍。随后,每皿加入200 μL DAPI染色液,于室温孵育5 min。孵育结束后用PBS清洗细胞,并往每皿加入500 μL PBS溶液,置于共聚焦显微镜下观察。
统计学方法   使用GraphPad Prism 10.1.1软件对数据进行统计和分析,数据用x¯±s表示。多组单因素比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。P < 0.05为差异有统计学意义。通过ImageJ 2.0.0对所拍摄的图片进行荧光共定位分析。

结果

细胞消化方式影响肿瘤细胞与5H抗体的结合信号   本研究采用3种不同的细胞消化方式处理贴壁肿瘤细胞。各种消化方式的处理时间保持一致,以排除消化时间对实验结果的影响。图 1A展示了在不同消化条件下,使用抗CD3L1抗体5H染色后各细胞的GMFI相对于阴性对照IgG1抗体染色的偏移情况,图 1B统计了5H抗体结合细胞的GMFI相对于阴性对照IgG1抗体的倍数。偏移程度或比值越大,表明5H抗体与细胞表面CD3L1抗原特异性结合的信号越强。结果显示,当消化温度和消化时间一致时,相较于胶原酶与中性蛋白酶混合液,胰蛋白酶溶液显著削弱了肿瘤细胞与5H抗体的结合强度(RKO细胞:F(2,6)=32.8,P=0.000 5;MCF7细胞:F(2,6)=20.55,P=0.001 8;RD细胞:F(2,6)=30.9,P=0.000 7;A375细胞:F(2,6)=68.7,P < 0.000 1)。此外,使用胶原酶与中性蛋白酶混合液在37 ℃消化的细胞同样表现出与5H抗体的明显结合,尽管相应的结合信号略弱于室温条件下的混合酶液消化,但这一差异并无统计学意义(RKO细胞:F(2,6)=32.8,P=0.064 5;MCF7细胞:F(2,6)=20.55,P=0.150 5;RD细胞:F(2,6)=30.9,P=0.298 4;A375细胞:F(2,6)=68.7,P=0.093 6)。以上结果表明,酶的种类是影响肿瘤细胞与5H抗体结合的关键因素,而在选择合适的消化酶进行细胞离解的前提下,温度的影响则较为次要。此外,当使用胶原酶与中性蛋白酶混合液消化细胞时,不同的细胞系表现出与5H抗体的不同结合强度,这一结合程度可以反映不同肿瘤细胞表面CD3L1抗原的相对表达水平。其中,RD细胞和MCF7细胞呈现出相对更高水平的CD3L1表达,而RKO细胞和A375细胞则呈现出相对更低水平的CD3L1表达。
图 1 细胞消化方式影响肿瘤细胞与5H抗体的结合信号

Fig 1 Cell digestion methods influence the binding signal of tumor cells with the 5H antibody

A: Representative images showing the fluorescence signal shift of various tumor cell lines stained with the 5H antibody versus those stained with the control-IgG1 antibody under different digestion methods. B: Comparing the fold change in GMFI of cells stained with the 5H antibody relative to cells stained with the control-IgG1 antibody under different digestion methods. Trypsin digestion significantly weakened the binding between cells and the 5H antibody, whereas the effect of digestion temperature on this binding signal was minimal (n=3 for each group, One-way ANOVA, (1)P < 0.05, (2)P < 0.01, (3)P < 0.001, (4)P < 0.000 1). Ab: Antibody; Accutase: The collagenase/neutral protease cocktail; GMFI: Geometric mean fluorescence intensity; ns: Not significant; RT: Room temperature.

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细胞消化方式影响5H抗体染色阳性RD细胞的占比   在通过流式细胞术分析了不同消化条件下肿瘤细胞与5H抗体的结合信号之后,进一步借助共聚焦荧光显微镜观察3种消化条件下RD细胞与5H抗体的结合情况。如图 2所示,细胞核被DAPI染液染成蓝色,当5H抗体与细胞膜表面的CD3L1抗原结合时,细胞附着上绿色荧光。鉴于抗体与膜表面抗原结合后会诱导抗体-抗原复合物内吞[13],将早期内体标志物EEA1抗体标记上红色荧光,以进一步验证5H抗体的定位,如果5H抗体被内吞入细胞,则会转运至早期内体[14],表现为绿色荧光和红色荧光的共定位,融合为黄色荧光。对于每一种消化条件下的RD细胞,均观察了多个视野。结果表明,当使用胰蛋白酶溶液在室温消化时,平均每个视野中标记了绿色荧光的细胞占总细胞数的12%;当使用胶原酶与中性蛋白酶混合液在37 ℃消化时,该比例升至48%;当使用胶原酶与中性蛋白酶混合液在室温消化时,该比例进一步增加至53%。相较于胶原酶与中性蛋白酶混合液,胰蛋白酶溶液消化显著降低了5H抗体染色阳性RD细胞的占比(F(2,12)=75.63,P < 0.000 1),而消化温度不同对结果产生的差异无统计学意义(F(2,12)=75.63,P=0.498 1),该结果与流式细胞术检测结果相符。此外,为量化5H抗体与早期内体的共定位程度,分析了各消化条件下各视野的tM1值(Manders共定位系数,表示绿色荧光与红色荧光共定位的比例[15])。结果显示,各视野的tM1均为0,提示5H抗体未被内吞入胞内,而是结合在胞膜上。已有的研究[16-17]表明,抗体与抗原结合后诱发的内吞通常需要在37 ℃条件下进行,在冰上或4 ℃条件下则难以发生。在本研究中,5H抗体与细胞的共孵育过程均在冰上进行,且孵育结束后立即进行固定处理,这些要素的控制有助于准确观察抗体结合细胞表面抗原后的初始状态。
图 2 细胞消化方式影响5H抗体染色阳性RD细胞的占比

Fig 2 Cell digestion methods affect the percentage of 5H-stained positive RD cells

A: Representative images showing the binding between RD cells and the 5H antibody under different cell digestion conditions. Blue fluorescence indicates the cell nuclei, with green fluorescence representing the 5H antibody and red fluorescence marking the early endosomes. There was no colocalization between the green and red fluorescence. B: Comparison of the percentage of 5H-stained positive RD cells in each field of view under various digestion conditions. Trypsin digestion significantly reduced this percentage, while the impact of digestion temperature was insignificant (n=5 views for each group, One-way ANOVA, (1)P < 0.000 1). Accutase: The collagenase/neutral protease cocktail; ns: Not significant; RT: Room temperature.

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胶原酶与中性蛋白酶混合液结合室温消化细胞辅助受体占位分析   为进一步验证胶原酶与中性蛋白酶混合液在室温消化细胞的可行性,将经此方法处理后的细胞用于受体占位分析。受体占位率是评价抗体药物与靶点作用水平的重要指标,其通常有2种测定模式,即游离受体测定模式和药物结合受体测定模式[18]。本研究采用更为直接的药物结合受体测定模式评估受体占位率。为确保研究的全面性,分别选用CD3L1表达水平相对更高的RD细胞和CD3L1表达水平相对更低的RKO细胞进行受体占位分析。如图 3所示,给予细胞的最低抗体浓度为0.009 766 μg/mL,最高抗体浓度为40 μg/mL,在此浓度范围内,随着抗体浓度的增加,受体占位率逐渐升高。对于RD细胞,当抗体浓度升至0.461 9 μg/mL时,即可达到50%的受体占位率;对于RKO细胞,当抗体浓度升至0.814 6 μg/mL时,也可达到50%的受体占位率。此外,5H抗体结合两种肿瘤细胞的饱和浓度(即受体占位率趋于100%时的抗体浓度)均约为10 μg/mL。实验结果表明,使用胶原酶与中性蛋白酶混合液在室温消化的细胞呈现出与5H抗体的抗体浓度依赖性结合,通过该抗体浓度依赖的结合信号可以分析受体占位率及抗体结合的饱和浓度。并且,在5H抗体浓度低于1 μg/mL时,两种细胞均已达到50%的受体占位率,说明在该消化方案下,细胞表面CD3L1抗原与5H抗体之间保留了高亲和力。
图 3 胶原酶与中性蛋白酶混合液结合室温消化细胞辅助受体占位分析

Fig 3 Receptor occupancy analysis of cells digested with the collagenase/neutral protease cocktail at room temperature

The receptor occupancy curve of RD and RKO cells digested with the collagenase/neutral protease cocktail at room temperature when incubated with serially diluted 5H (n=3 for each antibody concentration). RO: Receptor occupancy.

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讨论

本研究探索了不同的细胞消化方式对靶向CD3L1的抗体5H结合肿瘤细胞的影响。发现使用胰蛋白酶溶液在室温消化的细胞均表现出与5H抗体的微弱结合,而使用胶原酶与中性蛋白酶混合液在室温消化的细胞表现出与5H抗体的明显结合,且不同的肿瘤细胞呈现出不同强度的结合信号。当消化酶保持不变,仅将消化温度从室温升高至37 ℃时,细胞与5H抗体的结合信号被轻微削弱。这些研究结果揭示,不恰当的细胞消化方案可能削弱甚至消除抗体与靶细胞之间的结合。由于该结合信号反映靶抗原的表达水平,采用未经优化的细胞消化方式可能导致对靶抗原表达程度的误判。既往的研究也描述了类似的现象。PANCHISION等[19]的研究表明,相较于胶原酶与中性蛋白酶混合液,使用木瓜蛋白酶消化胶质瘤组织会显著降低其表面CD24水平,而CD24表达情况的正确评估有助于判断预后。Quan等[11]的研究表明,使用胰蛋白酶溶液在室温消化会令部分CD44+ CD24-的肿瘤干细胞亚群转变为CD44- CD24-细胞,而使用胰蛋白酶溶液在37 ℃消化会加剧这一转变,这是因为CD44的胞外域含有胰蛋白酶的剪切位点,胰蛋白酶在独特的氨基酸序列处切割,促使CD44胞外域断裂[11, 20-21],而温度的升高进一步增强了胰酶的酶解活性;相反,使用胶原酶与中性蛋白酶混合液在室温消化能够较好地保存肿瘤干细胞的抗原性,有利于流式细胞分选。Lai等[22]和Chen等[23]的研究表明,相较于不含酶的EDTA溶液,使用胰蛋白酶溶液消化巨噬细胞会显著降低其表面CD14水平,而使用胶原酶与中性蛋白酶混合液消化则能保护巨噬细胞表面CD14的表达,但胶原酶与中性蛋白酶混合液会降低巨噬细胞表面FAS-L的水平,这源于其对FAS-L胞外段的切割。总体而言,相较于胶原酶与中性蛋白酶混合液这类作用温和的酶溶液,木瓜蛋白酶和胰蛋白酶具有更强的蛋白水解活性和消化效力,同时也更容易对胞膜蛋白产生损伤。不含酶的消化液,如EDTA溶液,能够更大程度地保护胞膜蛋白不被酶解,但由于其消化效力低下,在处理贴壁牢固的肿瘤细胞时,它们不能有效离解细胞,需要辅助细胞刮刀等机械方式,这一操作通常会损伤细胞并降低其活性。因此,为了平衡消化效力和细胞活性,以及保护胞膜蛋白完整性,使用作用温和的含酶消化液可能是更合适的选择。此外,不同胞膜蛋白具有不同的特性,它们对消化酶及其他消化条件的敏感性也会存在差异,因此,针对不同的靶抗原和应用场景,仍需细致地探索消化酶类型、消化温度等多种消化条件对实验结果的影响,以确定最优的细胞消化方案。
正确的细胞消化方式能够有效辅助研究人员进行受体占位分析。本研究为了进一步验证胶原酶与中性蛋白酶混合液结合室温消化的可行性,采用梯度稀释的抗体孵育经此处理方式收集的细胞。与预期一致,不同CD3L1表达水平的肿瘤细胞均表现出与5H抗体的抗体浓度依赖性结合。通过分析相应的结合曲线,可准确评估不同抗体浓度下的受体占位率、抗体对抗原的亲和力以及抗体结合抗原的饱和浓度。
综上所述,当研究的目标抗原位于胞膜表面时,不恰当的细胞消化方式可能会损伤靶蛋白,进而影响抗体的结合,导致对靶抗原表达情况及抗体给药后受体占位情况的误判,这不仅会阻碍靶点的探索和抗体的开发,还可能在目标抗原作为生物标志物时,干扰临床诊断和预后评估。因此,比较不同消化方式下抗体与靶细胞结合情况的差异,并探索最优的细胞消化方案至关重要。本研究发现使用胶原酶与中性蛋白酶混合液在室温消化细胞,可以较好地保留抗CD3L1抗体与靶细胞表面CD3L1抗原的结合,而使用胰蛋白酶溶液消化细胞则会破坏这一结合。胰酶消化方式对靶向CD3L1的抗体结合肿瘤细胞的影响机制仍需进一步探索。综合CD3L1胞外域的氨基酸序列分析,这一现象可能与胰蛋白酶对CD3L1胞外域的切割有关。然而,具体的切割位点及其产生的裂解片段仍需进一步鉴定。未来在与CD3L1相关的研究中,应避免使用不恰当的消化条件,并且对于其他新发现的靶点,也应更加注重细胞消化方式对其表达水平检测的影响。

参考文献

1
DENG S, ZHANG Y, WANG H, et al. ITPRIPL1 binds CD3ε to impede T cell activation and enable tumor immune evasion[J]. Cell, 2024, 187(9): 2305- 2333.
2
DENG S, SHI J, SUN Y, et al. Development of a monoclonal antibody to ITPRIPL1 for immunohistochemical diagnosis of non-small cell lung cancers: accuracy and correlation with CD8(+) T cell infiltration[J]. Front Cell Dev Biol, 2023, 11: 1297211.
3
ARLINDO EM, MARCONDES NA, FERNANDES FB, et al. Quantitative flow cytometric evaluation of CD200, CD123, CD43 and CD52 as a tool for the differential diagnosis of mature B-cell neoplasms[J]. Rev Bras Hematol Hemoter, 2017, 39(3): 252- 258.
4
DOGAN A, SIEGEL D, TRAN N, et al. B-cell maturation antigen expression across hematologic cancers: a systematic literature review[J]. Blood Cancer J, 2020, 10(6): 73.
5
AUDIA A, BANNISH G, BUNTING R, et al. Flow cytometry and receptor occupancy in immune-oncology[J]. Expert Opin Biol Ther, 2022, 22(1): 87- 94.
6
HOSONUMA M, HIRASAWA Y, KURAMASU A, et al. Nivolumab receptor occupancy on effector regulatory T cells predicts clinical benefit[J]. Cancer Sci, 2024, 115(3): 752- 762.
7
ROBERS MB, FRIEDMAN-OHANA R, HUBER KVM, et al. Quantifying target occupancy of small molecules within living cells[J]. Annu Rev Biochem, 2020, 89: 557- 581.
8
CLISTER T, FEY RM, GARRISON ZR, et al. Optimization of tissue digestion methods for characterization of photoaged skin by single cell RNA sequencing reveals preferential enrichment of T cell subsets[J]. Cells, 2024, 13(3): 266.
9
SHI W, WANG Y, ZHANG C, et al. Isolation and purification of immune cells from the liver[J]. Int Immunopharmacol, 2020, 85: 106632.
10
MARKOSSIAN S, GROSSMAN A, ARKIN M, et al. Assay guidance manual[M]. Bethesda (MD): Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences, 2004.
11
QUAN Y, YAN Y, WANG X, et al. Impact of cell dissociation on identification of breast cancer stem cells[J]. Cancer Biomark, 2012, 12(3): 125- 133.
12
JUNKER F, GULATI P, WESSELS U, et al. A human receptor occupancy assay to measure anti-PD-1 binding in patients with prior anti-PD-1[J]. Cytometry A, 2021, 99(8): 832- 843.
13
DEAN AQ, LUO S, TWOMEY JD, et al. Targeting cancer with antibody-drug conjugates: promises and challenges[J]. MAbs, 2021, 13(1): 1951427.
14
YAO H, LAN J, LI C, et al. Inhibiting PD-L1 palmitoylation enhances T-cell immune responses against tumours[J]. Nat Biomed Eng, 2019, 3(4): 306- 317.
15
PERRIGUE PM, MURRAY RA, MIELCAREK A, et al. Degradation of drug delivery nanocarriers and payload release: a review of physical methods for tracing nanocarrier biological fate[J]. Pharmaceutics, 2021, 13(6): 770.
16
PEREZ BAY AE, FAULKNER D, DASILVA JO, et al. A bispecific METxMET antibody-drug conjugate with cleavable linker is processed in recycling and late endosomes[J]. Mol Cancer Ther, 2023, 22(3): 357- 370.
17
PERERA RM, ZONCU R, JOHNS TG, et al. Internalization, intracellular trafficking, and biodistribution of monoclonal antibody 806: a novel anti-epidermal growth factor receptor antibody[J]. Neoplasia, 2007, 9(12): 1099- 1110.
18
STEWART JJ, GREEN CL, JONES N, et al. Role of receptor occupancy assays by flow cytometry in drug development[J]. Cytometry B Clin Cytom, 2016, 90(2): 110- 116.
19
PANCHISION DM, CHEN HL, PISTOLLATO F, et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24[J]. Stem Cells, 2007, 25(6): 1560- 1570.
20
ZOLLER M. CD44: can a cancer-initiating cell profit from an abundantly expressed molecule?[J]. Nat Rev Cancer, 2011, 11(4): 254- 267.
21
TAKEDA M, OGINO S, UMEMOTO R, et al. Ligand-induced structural changes of the CD44 hyaluronan-binding domain revealed by NMR[J]. J Biol Chem, 2006, 281(52): 40089- 40095.
22
LAI TY, CAO J, OU-YANG P, et al. Different methods of detaching adherent cells and their effects on the cell surface expression of Fas receptor and Fas ligand[J]. Sci Rep, 2022, 12(1): 5713.
23
CHEN S, SO EC, STROME SE, et al. Impact of detachment methods on M2 macrophage phenotype and function[J]. J Immunol Methods, 2015, 426: 56- 61.

脚注

作者贡献声明  张远  实验实施,数据采集和整理,论文撰写。邓守言  实验指导。许杰  实验设计和指导,论文修订。

利益冲突声明  所有作者均声明不存在利益冲突。

基金

国家自然科学基金(82030104)

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版权所有,未经授权,不得转载。
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