毒驾是造成机动车交通事故的一项重要原因，在不同的人口群体和地理区域中，司机使用大麻、兴奋剂、镇静剂等毒品，发生致命车祸的风险会显著增加，尤其是很多年轻人使用大麻后驾车导致的交通事故率较高^[1-3]。在亚洲、美国和欧洲等地不断报道包括死亡在内的毒驾案件，药物滥用被认为对驾驶具有重大的危害性^[4]。吸食兴奋剂的驾驶人员常会有激进不安、定向障碍、冒险意愿增强、闯红灯等行为^[5-6]，吸食镇静剂、大麻的驾驶人员会表现为嗜睡头晕、精神错乱、共济失调、视力障碍，并出现判断力减弱、反应迟钝、误判交通信号灯等危险驾驶行为^[7]，重者会出现四肢痉挛、视幻觉、听幻觉等精神病性症状，并降低了对身体和认知功能的控制^[8]，使用致幻剂等毒品的人员更容易在驾驶中有高风险的行为^[9]，从而导致众多严重危害公共安全驾驶事件的发生^[10]。

毒驾的社会危害性巨大，因此，为了管控药物滥用及预防相关毒驾案件的发生，有必要对驾驶员进行监测。公安部2017年5月颁布了《车辆驾驶人员体内毒品含量阈值与检验》（GA1333—2017）^[11]，该标准规定了11种毒品在血液中的含量阈值。但是，现行的标准还不能满足同时检测血液中11种传统毒品及其代谢物的需求，且现存的方法采用液液萃取法^[12]、固相萃取法^[13]和氮吹法^[14]等对目标物进行提取，前处理方法步骤较为繁琐、耗时长，取样量相对较大，开发一种高效便捷并基于毒驾阈值标准的检测方法极为必要。本研究旨在开发一种基于毒驾阈值标准且前处理方法简单快速的液相色谱-串联质谱检验方法，以期为法医毒驾案件的鉴定提供一种高效便捷的检测方法。

材料和方法

实验仪器  SCIEX ExionLC^TM AC高效液相色谱仪（美国AB公司），API 4500 Q TRAP四级杆-线性离子阱质谱仪（美国AB公司），BSA124S电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]，Milli-Q超纯水制备系统（美国Millipore公司），IKA MS 3 digital圆周振荡器（德国艾卡仪器设备有限公司），Centrifuge 5424R台式离心机（德国Eppendorf公司）。

试剂  6-单乙酰吗啡（O₆-acetylmorphine，6-MAM）、吗啡（morphine，MOR）、可卡因（cocaine，COC）、苯甲酰爱康宁（benzoylecgonine，BZE）、四氢大麻酚（Δ₉-tetrahydrocannabinol，Δ₉-THC）、甲基苯丙胺（methamphetamine，MAMP）、苯丙胺（amphetamine，AMP）、3，4-亚甲二氧基甲基苯丙胺（3，4-methylenedioxymethamphetamine，MDMA）、3，4-亚甲二氧基苯丙胺（3，4-methylenedioxyamphe-tamine，MDA）、氯胺酮、甲卡西酮（methcathinone），其中四氢大麻酚质量浓度为100 μg/mL，其他对照品溶液质量浓度为1 mg/mL，均购自美国Cerilliant公司。内标6-单乙酰吗啡-d₆（6-MAM-d₆）、吗啡-d₃（MOR-d₃）、可卡因-d₃（COC-d₃）、苯甲酰爱康宁-d₈（benzoylecgonine-d₈）、四氢大麻酚-d₃（Δ₉-THC-d₃）、甲基苯丙胺-d₅（MAMP-d₅）、苯丙胺-d₅（AMP-d₅）、3，4-亚甲二氧基甲基苯丙胺-d₅（MDMA-d₅）、3，4-亚甲二氧基苯丙胺-d₅（MDA-d₅）、氯胺酮-d₄（ketamine-d₄）、甲卡西酮-d₃（methcathinone-d₃），甲氧那明，其中氯胺酮-d₄、甲卡西酮-d₃、四氢大麻酚-d₃内标品溶液质量浓度为100 μg/mL，其他内标溶液质量浓度为1 mg/mL，均购自美国Cerilliant公司，置于冰箱中冷冻保存，有效期为12个月。甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）购自美国Sigma-Aldrich公司；乙酸铵（色谱纯）、98%甲酸（优级纯）购自瑞士Fluka公司；超纯水由Milli-Q Advantage A10超纯水系统制得。

标准品溶液配制  分别取适量甲基苯丙胺等11种标准品溶液，用甲醇溶液制备成质量浓度为10 μg/mL的混标工作液。

内标溶液配制  分别取适量甲氧那明及甲基苯丙胺-d₅等11种氘代内标物，加乙腈溶液配制成混合内标溶液，其中，四氢大麻酚-d₃质量浓度是1 ng/mL，吗啡-d₃质量浓度是2 ng/mL，其他内标质量浓度均为0.5 ng/mL，对于每一种目标物均使用了2个内标，11种氘代标准品分别作为对应11种目标物的内标，甲氧那明作为11种目标物的共同内标物，置于冰箱中冷冻保存，有效期12个月。

质谱条件  电喷雾离子源采用正离子模式（electron spray ionization，ESI+）离子喷射电压（ionspray voltage，IS）：5 000 V；碰撞活化参数（collisionally activated dissociation，CAD）：9 psi；气帘气（curtain gas，CUR）：35psi；雾化气（ion source gas1，GS1）：55psi；辅助气（ion source gas2，GS2）：55psi；离子源温度（ion source tempreture，TEM）600 ℃。采用多反应监测（MRM）模式，各化合物质谱参数和保留时间见表 1。

液相色谱条件  液相色谱柱为菲罗门，Phenomenex Kinetex Biphenyl 100 Å（100 mm×3.0 mm×2.6 µm），柱温40℃；流动相A相为5 mmol/L乙酸铵缓冲溶液（含0.01%甲酸），流动相B相为乙腈；流速为0.45 mL/min；采用梯度洗脱，液相梯度初始有机相比例为5%，维持1 min，在4 min内提高至95%，保持95%有机相比例2 min后在0.1 min内恢复至初始流动相比例，柱子平衡时间大致3 min，共用时10 min。进样量为5 μL。

样品处理  取血液样品100 μL置于2 mL EP管中，加入含有内标的乙腈溶液900 μL，在振荡器上充分涡旋1 min，离心机21 131×g离心3 min，提取上清液后直接进仪器分析。必要时可取适量上清液氮气流挥干后用定量乙腈复溶上样分析。

方法学验证  本文对所建立方法有效性考察的选择性、检出限、定量下限、线性、精密度和准确度采用行业准则^[15-16]，提取回收率和基质效应采用AAFS标准委员会制定的方法验证行业标准^[17]。

选择性  分别采用10个不同来源的空白血液样品，按已建立的方法分析，考察血液中内源性物质对11种目标物是否有干扰。

检出限、定量限和线性  取空白血液100 μL，加入11种目标物的混合标准溶液，配制成浓度为0.1、0.5、1、5、10、15、50、150、200 ng/mL的加标样品，加入900 μL含有内标的乙腈溶液，按照本文样品处理方法进行提取。以每个目标物血液浓度为横坐标（X），目标物与对应内标的峰面积比值为纵坐标（Y），用加权（W=1/X）最小二乘法进行回归运算，求得线性方程。以信噪比（S/N）≥3的浓度为检出限（limit of detection，LOD），以S/N≥10的浓度为定量限（limit of quantitation，LOQ）。

准确度和精密度  取空白血液100 μL，加入11种目标物的混合标准溶液，配制成浓度为1、5、10、15、50、150 ng/mL的加标样品，按照样品前处理方法进行样品制备。每个浓度点制备6份平行样品，按所建立的方法进样并计算日内精密度和准确度。连续测定4天，计算日间精密度和准确度。QC样品的日内、日间精密度相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）值不能超过±15%，LOQ的RSD值不能超过±20%；QC样品的日内、日间准确度在85%~115%，LOQ样品在80~120%。

提取回收率和基质效应  选取低、高2个浓度血液样品，按本文样品方法处理后进样的峰面积设为A，空白样品按方法处理后，加入相应浓度的对照品溶液进样后的峰面积设为B，对照品进样的峰面积设为C。提取回收率=A/B×100%，基质效应=B/C×100%。

结果

选择性  10份空白血液样品经处理后，其中的内源性物质不干扰目标物测定。并且11种目标物的特征离子及保留时间均有差异，化学性质稳定，因此组分之间不存在干扰。

检出限、定量限和线性  各目标物检出限、定量限和线性结果如表 2。图 1为目标物在定量限浓度下以及内标物在配制混标浓度下的提取离子色谱图。结果表明，血液样品中11种目标物在相应的浓度范围内线性良好，相关系数（r）＞0.995。11种目标物的LOD为0.5~2.0 ng/mL，LOQ为1~5 ng/mL范围内，可以满足实践工作中的检测需要。

准确度和精密度  各目标物准确度和精密度结果见表 3。方法日内和日间精密度分别为0.84%~10.39%、3.37%~12.06%。准确度为92.25%~109.56%。QC样品的日内和日间精密度的RSD值在±15%内，LOQ样品的RSD值在±20%内；QC样品的准确度为85%~115%，LOQ样品为80%~120%。该方法精密度和准确度均满足要求。

提取回收率和基质效应  本方法提取回收率和基质效应结果见表 4。各目标物经本方法提取后，提取回收率为54.21%~101.86%，说明乙腈沉淀蛋白提取方法可以达到较好的提取效果。基质效应为79.60%~111.12%，没有明显的基质影响。

讨论

方法优化

色谱柱选择  实验分析的11种目标物的质量范围在136.1~334.2，其中包括吗啡和四氢大麻酚两种极性相差较大的化合物，在控制其他方法条件一致的情况下，通过检测同一浓度的四氢大麻酚样品比较Acquity TM UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm×1.8 µm）色谱柱和Phenomenex Kinetex Biphenyl 100 Å（100 mm× 3.0 mm × 2.6 µm）色谱柱发现，Kinetex Biphenyl色谱柱对四氢大麻酚的保留效果更好，Δ9-THC提取离子色谱峰响应值更高，噪音低，因此本实验选用此色谱柱。

色谱流动相优化  缓冲液盐浓度优化：本实验水相分别采用1、2、5、10mmol/L的乙酸铵溶液作为流动相，观察目标物在不同条件下的响应情况。11种化合物定量离子和定性离子的响应值中吗啡、单乙酰吗啡、四氢大麻酚偏低，列为图 2，其他化合物列为图 3。

结果表明，吗啡和单乙酰吗啡两种物质的响应值会随盐浓度增加呈上升趋势，其他化合物响应值随盐浓度增加呈下降趋势。本次所建方法优先考虑响应较低的化合物，吗啡和单乙酰吗啡在低盐浓度水相条件下响应较差、四氢大麻酚随盐浓度升高响应会降低，故折中考虑选用5 mmol/L乙酸铵溶液。

缓冲液酸浓度优化：在5 mmol/L乙酸铵缓冲液中添加0.01%、0.02%、0.05%、0.1%的甲酸，比较不同酸浓度条件下目标物吗啡、四氢大麻酚正模式和负模式的响应情况（图 4）。

结果表明，在正离子模式下，响应值较低的吗啡和四氢大麻酚在加入0.01%甲酸后，响应增强。然而甲酸的加入抑制了负模式下四氢大麻酚的响应且影响其稳定性，故选择正模式扫描，并以5 mmol/L的乙酸铵（含0.01%甲酸）作为最终的水相条件。

前处理方法的优化：在其他实验条件保持一致的情况下，我们对样品分别进行超声与不超声处理，并比较了两种条件下11种目标物的提取回收率与基质效应，如图 5。

结果可见，与不超声处理方法比对，超声的处理方法对于氯胺酮、6-单乙酰吗啡、可卡因等大部分物质的检测产生了较明显的基质抑制，然而提取回收率却并未明显提高，因此，前处理方法不进行超声。

由于目标物四氢大麻酚的吸附性比较强，本文比较了样品上清液过滤膜与不过滤膜对检测四氢大麻酚物质的影响。实验发现，样品过滤膜之后对于四氢大麻酚的检测会受到影响，其响应值降低，低浓度时更容易受到杂峰的干扰。因此对于四氢大麻酚的提取，建议采用不过滤膜直接提取的前处理方法。

案例应用

案例1  张某，男性，26岁，在某路口闯红灯且超速驾车行驶，撞到路边隔离带发生交通事故。交警抓获后，此人表现为情绪激动，精神兴奋，声称自己在玩游戏飞车。警方认为此人有吸毒嫌疑，提取张某血液后委托本单位进行鉴定。运用本文方法对送检血样进行检测，在血样中检出甲基苯丙胺、苯丙胺成分，其中，甲基苯丙胺测定浓度为148.1 ng/mL，苯丙胺测定浓度为15.4 ng/mL（图 6）。

案例2  吴某，男性，31岁，从某娱乐场所停车场驾车行驶，路途中因超速行驶与前车追尾。交警查办时此人神情紧张，情绪暴躁，表达含糊不清。警方委托本单位对吴某血液进行鉴定。按照本研究创建方法对送检血液进行检测后发现血液中检出氯胺酮成分，测定浓度为38.8 ng/mL（图 7）。

结论  综上所述，本文通过建立一种液质联用方法同时测定了甲基苯丙胺等11种传统毒品及代谢物在血液中的含量，经考察和验证，此方法学的选择性、精密度、准确度、基质效应、提取回收率、线性范围均满足分析要求，该方法对于样品的前处理方式简单快捷且取用样量少、稳定性好、选择性好，可适用于法医毒物司法鉴定实践中11种传统毒品及代谢物在血液中的测定。

作者贡献声明  武丽娜  论文构思和撰写，实验执行，数据收集与分析。施妍  论文构思与设计，技术指导，获取资助。向平，贠克明  监督指导，论文审阅。林佳曼，李天乐  文献调研，数据分析、整理和保存。刘耀  论文构思和指导。

利益冲突声明  所有作者均声明不存在利益冲突。