2023, Vol. 50
2. 复旦大学肿瘤研究所 上海 200032
2. Fudan University Shanghai Cancer Institute, Shanghai 200032, China
RNA修饰在基因表达调控中扮演重要角色，哺乳动物中最丰富的mRNA内部修饰是m6A修饰。m6A修饰参与RNA的转录、加工、剪切、翻译和降解过程[1-4]，研究显示m6A RNA甲基化与多种癌症的发生发展以及人类多种复杂疾病密切相关[5-7]。
在近年的研究中，最常用的鉴定m6A甲基化方法是m6A免疫沉淀测序（methylated RNA immunoprecipitation sequencing，MeRIP-Seq）和免疫沉淀定位法（m6A individual-nucleotide-resolution cross-linking and immunoprecipitation，miCLIP）[8-9]。然而，这些基于抗体的方法有一些显著的局限性，包括重复性不高[10]、分辨率较低、需要大量样本以及在不同条件下比较m6A甲基化的能力有限，无法精确检测m6A甲基化的变化。
为了在单核苷酸分辨率上检测和量化转录组中m6A的水平，本文根据参考文献[11]进行改进，建立了m6A特异性烯丙基化学标记测序（m6A-selective allyl chemical labeling and sequencing，m6A-SAC-seq）体系，并且保持较好的稳定性和重复性。该方法使用甲基转移酶MjDim1，替换常规的辅酶S-（5’-腺苷）-L-同型半胱氨酸（S-（5′-Adenosyl）-L-homocysteine，SAM）为烯丙基-S-（5’-腺苷）-L-同型半胱氨（allyl-S-（5′-Adenosyl）-L-homocysteine，Allyl-SAM），从而将RNA m6A加上烯丙基，成为am6A，通过I2处理将am6A进行环化，成为N1，N6环化A衍生物，HIV逆转录酶识别该环化产物并在逆转录时引入突变，构建文库，进行高通量测序后通过数据分析来鉴定m6A位点。
材料和方法合成Allyl-SAM 向100 mg SAM中加入1 mL乙酸、1 mL甲酸、52.0 mg高氯酸银和2.125 mL烯丙基溴，20 ℃搅拌8 h。加入20 mL 0.1%三氟乙酸，使反应淬灭。转移水相，用乙醚洗涤，使用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）（型号：176803000，美国Waters公司）纯化Allyl-SAM，-80 ℃保存。
m6A RNA探针混合液的制备 设计和合成修饰含有m6A修饰的内参RNA探针。该内参探针由上海捷瑞生物工程有限公司合成，序列中含有NNm6ANN（N为A，U，C和G的混合物）的核心基序，以及特定的8个核苷酸序列构成的“条形码”，分别代表m6A含量为0、25%、50%、75%和100%。由含有m6A修饰的RNA探针和相同序列的未修饰的RNA探针按照特定比例混合而成（附件：表1）。
甲基转移酶MjDim1的制备 合成MjDim1并将其克隆到pET-His-SUMO质粒载体中，转化到T7感受态细胞（编号：C2566I，美国New England BioLabs公司）中，活化菌种过夜，将活化的菌种接种到灭菌的2×YT培养基中，37 ℃培养4 h，降温到16 ℃，继续培养2 h，加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG诱导表达，16 ℃培养16~18 h。收集细胞，在裂解缓冲液（1×PBS+150 mmol/L NaCl）中，用高压细菌破碎仪裂解细胞。使用镍柱亲和纯化后加Ulp1酶，4 ℃过夜，以去除SUMO标签。用洗脱缓冲液[含20 mmol/L Tris-HCl（pH=7.5）、150 mmol/L NaCl和20 mmol/L咪唑]洗脱MjDim1酶。使用AKTA蛋白纯化仪，经阴离子交换色谱（型号：Source15-Q，美国General Electri公司）和阳离子交换色谱（型号：Source15-S，美国General Electric公司）纯化，将蛋白梯度洗脱，采集蛋白峰并浓缩至1.2~2.0 mmol/L，加入终浓度为30%的甘油，于‒80 ℃分装保存。
MjDim1活性测试 将3 μL 20 mmol/L Allyl-SAM，0.6 μL 1 mol/L Tris HCl（pH=8.3）和3 μL纯水混匀，配置成中和Allyl-SAM。用1×结合/清洗缓冲液[含10 mmol/L Tris-HCl（pH=7.5）、1 mmol/L EDTA和2 mol/L NaCl]，清洗并重悬磁珠（Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads）（美国Thermo Fisher Scientific公司），混匀后对照组和实验组每管分装50 μL。
在实验组中，4 μL中和Allyl-SAM、1 μL m6A RNA探针混合液（30 ng RNA）、4 μL RNA酶抑制剂（美国Thermo Fisher Scientific公司）、2 μL 10× MjDim1反应缓冲液[含400 mmol/L HEPES（pH=8.0）、400 mmol/L NH4Cl和40 mmol/L MgCl2]、4 μL MjDim1酶和7 μL纯水配置成20 μL反应体系，放入PCR仪中，50 ℃反应1 h。期间每隔20 min，在实验组中加入2 μL 10×MjDim1反应缓冲液、2 μL RNA酶抑制剂、8 μL纯水、4 μL Ally-SAM和4 μL MjDim1酶，50 ℃反应1 h。
在对照组中，将1 μL m6A RNA探针混合液（30 ng RNA）、5 μL RNA酶抑制剂、5 μL 10×MjDim1反应缓冲液和39 μL纯水配置成50 μL反应体系，50 ℃反应2 h。
每组加入1 μL 100 U/μL核酸酶（美国New England BioLabs公司）、2 μL 10×核酸酶缓冲液和14 μL纯水，37 ℃反应过夜。再加入2 μL 1 U/μL碱性磷酸酶（美国Thermo Fisher Scientific公司）和2.4 μL 10× CIP脱磷酸缓冲液，37 ℃反应2 h。使用LC-MS/MS质谱系统进行活性测试。
构建文库
提取样品mRNA 对于细胞系和新鲜冷冻的组织样本，用Trizol法或提取试剂盒纯化全转录组RNA。用Dynabeads mRNA DIRECT试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司）提取mRNA，用于检测mRNA m6A修饰。
拆卸Poly A并连接接头片段 用oligo-dT与RNA样本的poly A尾巴进行退火，用RNase H（美国New England BioLabs公司）消化，去除poly A尾巴，然后用DNase Ⅰ（美国New England BioLabs公司）去除多余的oligo-dT，用RNA纯化试剂盒（美国Zymo Research公司）纯化。纯化后超声将RNA片段化，37 ℃下用PNK酶（美国New England BioLabs公司）末端修复RNA 30 min，释放3’羟基，以便下一步进行连接反应。在反应中加入m6A RNA探针混合液。使用截短型T4 RNA连接酶2（美国New England BioLabs公司），25 ℃下将RNA片段与3’接头（附件：表1）连接。在混合液中添加1 μL 5’去腺苷化酶（美国New England BioLabs公司），30 ℃反应1 h，去掉多余3’接头上的腺苷化修饰，添加1 μL RecJf（美国New England BioLabs公司），37 ℃孵育1 h，消化剩余的RNA接头片段。加入1 μL 50 μmol/L逆转录引物（附件：表1），75 ℃退火5 min，37 ℃退火15 min，25 ℃退火15 min。
标记m6A位点并进行逆转录 在反应溶液中加入15 μL磁珠纯化RNA。洗净磁珠，用6 μL H2O重悬，RNA在70 ℃ 30 s变性后4 ℃冷却，消除RNA二级结构。添加2 μL 10×MjDim1反应缓冲液（含2 μL RNA酶抑制剂、6 μL Allyl-SAM和4 μL 1.44 mmol/L MjDim1酶），50 ℃反应1 h。
取上清，加入4 μL H2O、1 μL 10×MjDim1反应缓冲液、1 μL RNA酶抑制剂、2 μL Allyl-SAM和2 μL酶，50 ℃孵育20 min。重复以上步骤7次，标记大多数m6A位点。用25 μL水清洗并重悬，在反应体系中加入1 μL 125 mmol/L I2，充分混合。室温暗反应1 h后，加入1 μL 40 mmol/L Na2S2SO3，使I2淬灭。用9 μL纯水清洗并重悬，加入2 μL 10×AMV-RT缓冲液（美国New England BioLabs公司）、2 μL 10 mmol/L dNTP 2、2 μL 25 mmol/L MgCl2、1.25 μL 0.1 mol/L DTT、2 μL RNA酶抑制剂、2 μL HIV-RT酶（美国Worthington Biochemical公司），37 ℃进行3 h的逆转录反应（图 1）。用8 μL纯水清洗并重悬。
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| m6A-SAC-seq utilizes MjDim1 and Allyl-SAM as a co-factor to convert m6A to am6A, followed by cyclization upon I2 treatment. Mutations are introduced upon reverse transcription at m6A sites. We could identify m6A sites by specific A to C/T mutation locations and the stoichiometry could be quantified by addition of spike-in calibration probes. 图 1 m6A-SAC-seq实验原理图 Fig 1 Schematic diagram of m6A-SAC-seq |
连接cDNA 3'接头片段和构建文库 将1 μL RNase H缓冲液和1 μL RNase H加入逆转录产物中，37 ℃恒温反应30 min。清洗反应液体，用不含核酸酶的H2O重悬，95 ℃反应10 min洗脱cDNA。用DNA纯化试剂盒（型号：D4030，美国Zymo Research公司）纯化到10 μL。向cDNA溶液中添加2 μL 10×T4 RNA连接酶缓冲液、2 μL 10 mmol/L ATP、10 μL 50% PEG8000、1 μL 50 μmol/L cDNA 3’接头片段（附件：表1）和1 μL T4 RNA连接酶1（美国New England BioLabs公司），25 ℃反应过夜（12 h）。用DNA纯化试剂盒纯化cDNA，用21 μL H2O洗脱cDNA。
取1 μL cDNA溶液用于qPCR检测，取15 μL cDNA溶液用作建立文库。qPCR反应体系：1.25 μL 10 μmol/L Universal PCR引物（美国New England BioLabs公司），12.5 μL 10 μmol/L PCR Index引物，1 μL cDNA溶液，1 μL 25×SYBR Green Ⅰ，12.5 μL 2×NEB Next Ultra Ⅱ Q5 Master Mix（美国New England BioLabs公司），加纯水补至25 μL。PCR反应条件：98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s，65 ℃ 75 s，40个循环；65 ℃ 5 min；恢复至4 ℃。通过qPCR的ΔCt值确定最佳建库周期数。
用于建立文库的50 μL PCR反应体系：5 μL 10 μmol/L Universal PCR引物，5 μL 10 μmol/L PCR Index引物，15 μL纯化后的cDNA溶液，25 μL 2×NEB Next Ultra Ⅱ Q5 Master Mix。PCR反应条件：98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s，65 ℃ 75 s，循环数由qPCR结果决定；65 ℃ 5 min；恢复至4 ℃。
使用AMPure XP磁珠（型号：A63880，美国Beckman公司）纯化DNA文库，按照Illumina HiSeq X Ten with paired-end 2×150 bp标准（美国Illumina公司）进行测序。
数据处理
原始序列数据的准备和质量控制 从UCSC基因组浏览器（https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg38/bigZips/）下载人类hg38参考基因组和转录组文件，从UCSC基因组数据库（https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTables）下载ncbiRefSeq GTF文件，建立参考基因组（附件：数据1）。从GitHub（https://github.com/CTLife/m6A-SAC-seq）下载脚本，通过FASTQC检查原始FASTQ文件的质量（附件：数据2）。
通过内参探针的标准曲线来换算m6A含量 根据内参探针的m6A含量和测序得到的突变率计算标准曲线（附件：数据3）。换算得到转录组中m6A的含量，检测每个样本的碱基突变率（附件：数据4）。
预处理和序列比对 使用Trimmomatic拆卸低质量的接头和碱基，删除无接头的序列（附件：数据5）。将序列比对到参考基因组，质检后删除低质量序列（附件：数据6）。
突变调用和m6A位点识别 通过SAMtools和VarScan调用每个BAM文件的突变（附件：数据7）。从VarScan的输出中，通过确定最大背景突变率、P值、最小突变率和覆盖率参数来识别m6A位点（附件：数据8）。
结果甲基转移酶MjDim1的制备 用HPLC法纯化MjDim1蛋白，经过离子交换柱Source-15 Q柱后，使用Source-15 S柱纯化，收集MjDim1蛋白峰（图 2）。SDS-PAGE电泳凝胶显示的纯化蛋白的条带大小符合MjDim1的相对分子质量（32 000，图 3）。最终得到蛋白浓度为1.44 mmol/L的MjDim1酶。
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| 图 2 MjDim1酶的Source 15-S离子交换纯化曲线 Fig 2 Source 15-S ion exchange purification curve of MjDim1 enzyme |
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| MjDim1 was purified by Source 15-S resin. Lane 1:A bclonal RM19001 Protein marker; Lane 2-7: Purified MjDim1 enzyme. 图 3 纯化MjDim1酶的SDS-PAGE凝胶电泳照片 Fig 3 SDS-PAGE gel electrophoresis map of purified MjDim1 enzyme |
MjDim1活性测试结果 m6A探针经过MjDim1酶在20 μL反应体系中进行烯丙基标记后，生成am6A。am6A的保留时间约为5.5 min（图 4）。统计峰面积得到碱基含量，计算m6A的转换率。m6A的转换率计算公式为：转换率={1-[（Aream6A，treated/AreaG，treated）/（Aream6A，control/AreaG，control）]}×100%。
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| A: UHPLC-MS/MS quantitation of the m6A probe after allyl labeling using the fresh MjDim1 enzyme. The acquisition time of am6A (N6-allyl, N6-methyladenosine) is around 5.5 min. B: UHPLC-MS/MS quantitation of G after using the fresh MjDim1 enzyme as control. 图 4 m6A探针的质谱结果检测MjDim1活性 Fig 4 Results of MjDim1 activity measured by UHPLC-MS/MS quantitation of the m6A probe |
经过MjDim1酶处理不同次数后的m6A转换率随MjDim1酶处理次数增加而上升（图 5），经过4轮MjDim1酶处理，活性检测探针中含有100% m6A的转换率为92.8%（> 90%），说明MjDim1酶的活性处于较高水平，可以在样品反应中使用。
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| RNA probes with m6A are treated with MjDim1 and Allyl-SAM cofactor for multiple rounds labeling. The conversion rates of m6A to am6A are calculated from three independent biological replicates. 图 5 经MjDim1酶处理不同次数后的m6A转换率 Fig 5 Results of m6A conversion rate after different rounds of treatments with MjDim1 enzyme |
测序分析结果 经过m6A-SAC-seq处理后，逆转录酶会在m6A位点引入突变，但不会在附近的未修饰位点产生突变，可以通过特定的A突变成U或者C的位点来识别m6A位点。在HeLa细胞系中总共检测出10 958个m6A位点（图 6）。以其中4个m6A位点为例，除m6A位点以外，m6A位点附近碱基均未产生突变，并且可以得到该m6A位点的突变率（图 7）。
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| A: Numbers of m6A sites between biological repeats identified by m6A-SAC-seq using the same RNA sample from HeLa cells; B: Calibration curve for each GGACU motif is generated by linear regression. Goodness of fit (R2) of linear regression was also shown. 图 6 m6A-SAC-seq识别m6A位点并测量m6A含量 Fig 6 Identification of m6A site and measurement of m6A fraction using m6A-SAC-seq |
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| 图 7 使用m6A-SAC-seq后m6A位点及其附近碱基的突变率 Fig 7 Misincorporation rate of specific m6A sites and the adjacent bases with m6A-SAC-seq |
通过LC-MS/MS检测不同RNA起始量的条件下，使用MjDim1标记HeLa mRNA m6A效率（图 8）。RNA起始量在30~100 ng，检测结果的差异不显著。RNA起始量低于30 ng，构建文库需要的PCR循环数比较多，测序的冗余度也会比较高。RNA起始量 > 100 ng，MjDim1酶无法充分标记RNA样本中的m6A。
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| 图 8 m6A-SAC-seq使用不同RNA起始量的m6A检测效率 Fig 8 Conversion rate of m6A site using different amounts of input RNA by m6A-SAC-seq |
m6A-SAC-seq还可以通过校准探针来量化突变率，从而得到该位点m6A的含量。Chr1：28769034+的YTHDF2 3’UTR上的m6A位点经过m6A-SAC-seq处理后的突变率是17.39%（图 7）。序列中腺嘌呤的突变率和线性相关性可以采用线性回归模型为：Y=aX+b。其中Y为观察到的突变率，X为m6A含量比例，得到相关系数R2=0.9726（图 6B）。经过标准曲线对照后，可得到该位点m6A含量均在25%以上。综上，m6A-SAC-seq仅需30 ng的mRNA样本就可以实现m6A位点在单核苷酸分辨率上的检测。
讨论m6A是真核生物中最常见的一种RNA修饰，富集在终止密码子附近的3'非翻译区[12]。近年来，越来越多的研究发现m6A与癌症相关，能促进癌细胞增殖，并对放疗或化疗产生耐药性[13-15]。m6A甲基化在哺乳动物发育过程中发挥着重要作用，包括胚胎发育、神经发生、性别决定等[16-18]。m6A-SAC-seq具有以下优势。
单核苷酸分辨率，检测精度高 目前普遍使用的MeRIP-Seq技术利用特异性抗体选取携带m6A修饰的RNA片段的免疫沉淀来检测m6A位点，但MeRIP-seq不能达到单碱基分辨率。
m6A-SAC-seq则能通过特异性甲基转移酶，将样品mRNA上的m6A标记上烯丙基形成am6A，通过I2处理生成N1，N6环化的A的衍生物，通过逆转录引入突变，测序后能在单碱基分辨率水平检测整个转录组中的m6A位点，并对其进行定量。相比于依赖抗体的检测方法，m6A-SAC-seq的分辨率高，并且可以精确定量。
送检样本量要求低，检测样本多样 miCLIP技术是目前常用的达到单核苷酸分辨率水平的检测方法，可通过在结合位点交联抗体，在逆转录过程中诱导突变再测序。但是该方法需要更复杂的操作和更多的测序材料，并且在检测峰值和峰值变化方面的可重复性不高。
相比之下，m6A-SAC-seq只需约30 ng mRNA或去除了rRNA的总RNA，突破了样本的取样量瓶颈。通过RNA内参探针绘制标准曲线，可以准确比较不同条件下的m6A含量水平，增加了临床疾病样本取样来源的灵活性。
检测步骤简便，重复性良好 PA-m6A-seq[19]和m6A-CLIP[20]等多种改良的方法提高了m6A位点的检测精度，但上述方法都依赖于m6A特异性抗体，灵敏性、重复性和准确性相对较差。
m6A-SAC-seq中建立文库的操作都在磁珠固相上进行，方便进行多次清洗纯化，减少污染概率。m6A-SAC-seq对m6A的标记依赖于酶的特异性识别，比抗体拥有更好的灵敏性、重复性和准确度。
然而，m6A-SAC-seq技术也存在不足和局限性：由于MjDim1酶偏向于Gm6AC基序，对于Am6AC基序活性较低，未来拟通过改造目前版本的MjDim1甲基转移酶，以期减少其对特定碱基序列检测时的偏好性。
本文描述了m6A-SAC-seq技术的实验操作和数据分析流程，m6A-SAC-seq拥有对各种癌细胞以及临床样本中全转录组m6A进行定位和定量的潜力。我们认为m6A-SAC-seq将有助于更多RNA m6A功能方面的研究，并且在临床上对特定基因的m6A修饰含量进行定量检测，为癌症的早期诊断、治疗和预后提供新的研究策略。
作者贡献声明 孟瀚哲 实验操作，数据统计和分析，论文撰写。何维志 论文指导和修订。胡璐璐 研究构思和设计，论文指导和修订。
利益冲突声明 所有作者均声明不存在利益冲突。
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