2023, Vol. 50
2. 上海呼吸物联网医学工程技术研究中心 上海 200032;
3. 上海市呼吸病研究所 上海 200032;
4. 青岛大学青岛医学院附属烟台毓璜顶医院病理科 烟台 264000;
5. 同济大学附属第十人民医院肿瘤科-同济大学癌症中心 上海 200072
2. Shanghai Engineering Research Center of Internet of Things for Respiratory Medicine, Shanghai 200032, China;
3. Shanghai Respiratory Research Institute, Shanghai 200032, China;
4. Department of Pathology, Yantai Yuhuangding Hospital, Qingdao Medical College, Qingdao University, Yantai 264000, Shandong Province, China;
5. Department of Oncology, Tenth People's Hospital of Tongji University-Tongji University Cancer Center, Shanghai 200072, China
肺癌是发病率高、预后差的恶性肿瘤，在2022年最常见的癌症中，前列腺癌、肺癌和大肠癌占男性新增病例的48%，乳腺癌、肺癌和大肠癌占女性新增病例的51%[1]。在肺癌的两种类型中，小细胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)的发病率低于非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)。NSCLC进一步划分为肺腺癌(lung adenocarcinoma，LUAD)和肺鳞癌(lung squamous cell carcinoma，LUSC)，其中LUAD是最常见的亚型。NSCLC早期症状不明显，大多患者在晚期才被诊断出来，因此迫切需要可靠的生物标志物来评估诊断和监测进展[2]。
氨基酰-tRNA合成酶(aminoacyl-tRNA synthetase，AARS)在生物体内普遍存在，其主要功能是催化氨基酸与相应的tRNA之间发生酯化反应形成氨基酰-tRNA，为蛋白质生物合成提供原料，确保遗传信息准确传递[3]。线粒体天冬氨酰-tRNA合成酶2(aspartyl-tRNA synthetase 2，mitochondrial，DARS2)负责翻译启动及蛋白质合成[4]，其突变多与线粒体疾病的发生发展密切相关。已有文献报道DARS2在肺癌、胰腺癌和膀胱癌的预后评估模型中表现出良好预后预测意义[5-8]，这些模型以RNA结合蛋白(RNA binding protein，RBP)为基础构建。RBP对转录后调控至关重要，其表达异常是促癌网络的重要一环[9]。本研究选取NSCLC的两个不同亚型，采用多种数据库比较和细胞功能实验相结合的方法，以期揭示DARS2在NSCLC发生发展中的作用。
材料和方法细胞培养和转染 复旦大学附属中山医院实验研究中心负责培养细胞，培养基和血清以9∶1制备成完全培养基，在25 T培养瓶中正常培养，并储存于标准培养箱。取40%的H1299细胞铺于6孔板上，次日每孔添加0.5 mL感染增强液、0.5 mL培养基、1 μL聚凝胺和14 μL shDARS2慢病毒液进行转染。
Western blot实验 取适当RIPA裂解液，使用前添加蛋白酶抑制剂，6孔板每孔加入80~100 μL裂解液，吹打数下，促进细胞裂解。在冰上裂解15 min后枪头刮至EP管，4 ℃下18 407×g离心10 min，取上清。BCA法定量蛋白浓度，5×上样缓冲液按4∶1稀释，后续以电泳转膜曝光等标准流程进行。
细胞实验 增殖实验：将慢病毒转染的H1299细胞以5×103/孔的密度接种至96孔板，在培养箱孵育72 h，每孔加入100 μL含有10 μL CCK-8试剂的培养基，继续孵育4 h，用多功能酶标仪检测吸光度，并评估对细胞增殖能力的影响。划痕实验：将慢病毒转染的H1299细胞接种于6孔板中直至长满，枪头垂直于6孔板底部划一条直线，PBS清洗后悬浮细胞，倒置显微镜在12 h和24 h时拍照记录划痕宽度，使用ImageJ软件分析划痕的相对宽度，并评估对细胞迁移能力的影响。
qRT-PCR实验 使用Trizol提取H1299细胞RNA，以10 μL为逆转录体系制备cDNA，加DEPC水5倍稀释。按照TAKARA试剂盒说明书，qRT-PCR按照10 μL体系预混并加样。DARS2正向引物序列：5'-AAGATGTGGTCCTACTAACTGC-3'，反向引物序列：5'-TGTTTCTAGAAGGTCAG-CACAT-3'。
数据库分析 通过数据库分析DARS2在LUAD及LUSC中的相关生物信息学(表 1)。
| Database | Function | Website |
| GEPIA | Gene expression profiling interactive analysis | http://gepia.cancer-pku.cn |
| GEO | Query and download experiments and curated gene expression profiles. | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ |
| HPA | Open access resource for human proteins | https://www.proteinatlas.org |
| UALCAN | Web resource for analyzing cancer OMICS data | https://ualcan.path.uab.edu |
| cBioPortal | Interactive exploration of multidimensional cancer genomics data sets | https://www.cbioportal.org |
| Linkedomics | Analyze and compare cancer multi-omics data within and across tumor types | http://www.linkedomics.org/login.php |
| Metascape | A gene annotation and analysis resource | https://metascape.org/gp/index.html |
统计学分析 使用GraphPadPrism Version 9.00软件进行统计分析，两组数据之间差异分析采用独立样本t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
结果DARS2在NSCLC中表达及与NSCLC患者生存预后的关系 通过GEO (GSE19804、GSE18842和GSE21933)数据库分析发现，在NSCLC组织中DARS2 mRNA的表达水平均明显高于正常组织(P < 0.001，图 1A~C)；GEPIA数据库结果进一步证实，在LUAD和LUSC组织中DARS2 mRNA的表达水平均显著上调(P < 0.001，图 1D)。在HPA数据库检索界面输入“DARS2”，并在“Tissue Atlas”和“Pathology Atlas”模块分别选择“Lung”和“Lung cancer”，生成正常肺组织、LUAD和LUSC组织中DARS2蛋白表达水平的免疫组化图(图 1E~G)，结果显示DARS2蛋白在LUAD与LUSC组织中均高表达。GEPIA数据库病理分期分析结果显示，DARS2 mRNA表达水平在不同病理分期的LUAD组织中明显不同(P < 0.001，图 1H)，且与LUAD的病理分期呈正相关。预后分析模块结果显示，以中位数为截断值，DARS2表达水平仅与LUAD患者总生存期呈负相关(P < 0.001，图 1J)。
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| A-D: DARS2 mRNA expression analysis in NSCLC and normal tissues in GEO (GSE19804, GSE18842 and GSE21933) and GEPIA; E-G: Representative IHC images of DARS2 expression of normal, LUAD and LUSC in HPA (HPA026506) database; H-I: Expression of DARS2 mRNA in different stages of LUAD and LUSC in GEPIA; J-K: Correlation between DARS2 expression and prognosis of LUAD and LUSC in GEPIA. 图 1 DARS2在NSCLC和正常组织中的表达与预后 Fig 1 Expression and prognosis of DARS2 in NSCLC and normal tissues |
DARS2在NSCLC中的基因变异及甲基化水平分析 利用cBioPortal数据库分析DARS2在NSCLC中基因变异情况，结果显示：在503例LUAD患者中有81例(16%)发生基因变异，变异类型主要包括错义突变、基因扩增和mRNA高表达；在466例LUSC患者中有83例(18%)发生基因变异，变异类型主要包括错义突变、剪接突变、截短突变、结构变异、基因扩增和mRNA高表达(图 2A)。UALCAN数据库甲基化分析结果显示：在LUAD组织中，DARS2基因启动子甲基化水平明显降低(P=0.004 9，图 2B)，而在LUSC组织中，DARS2基因启动子甲基化水平明显升高(P=0.020 6，图 2B)。
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| A: Alteration of DARS2 gene in LUAD and LUSC (cBioPortal); B: Promoter methylation level of DARS2 in LUAD and LUSC (UALCAN). 图 2 NSCLC中DARS2的基因变异和启动子甲基化改变 Fig 2 Genetic alteration and promoter methylation of DARS2 in NSCLC |
DARS2敲低对H1299细胞增殖和迁移的影响 qRT-PCR实验结果表明，DARS2在LUAD细胞(H1299)中的表达量明显高于正常支气管上皮细胞(BEAS-2B和HBE)(P=0.02，图 3A)，故选择在H1299细胞中敲低DARS2基因的表达并用qRT-PCR与Western blot检测转染效率(图 3B)。CCK-8实验结果显示，DARS2基因敲低组在培养72 h后OD值明显降低(P < 0.001，图 3C)，与正常组相比增殖能力明显削弱。细胞划痕实验结果显示，敲低DARS2基因后12 h和24 h，H1299细胞的迁移能力均显著低于正常组(P < 0.001，图 3D)。这些结果表明DARS2表达水平下降有助于抑制LUAD细胞的增殖和迁移。
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| A: Expression level of DARS2 in cell lines identified by qRT-PCR; B: Transfection rate identified by qRT-PCR and Western blot; C-D: CCK-8 and wound healing were performed to identify the proliferation and migration rate after DARS2 knockdown in H1299 cells. 图 3 下调DARS2对NSCLC细胞增殖和迁移影响 Fig 3 Interference of DARS2 expression impaired proliferation and migration of NSCLC cells |
DARS2在LUAD与LUSC中共表达基因分析 通过LinkedOmics数据库对DARS2在LUAD与LUSC中相关基因进行分析，结果显示：LUAD中有4 180和6 135个基因分别与DARS2表达呈正相关和负相关(图 4A)，而LUSC中有3 767个和5 293个这样的基因(图 4B)。在LUAD和LUSC中，与DARS2正负相关性排名前50的基因如图 4C~4F所示。在LUAD中，DARS2的表达与NDUFS1(r=0.638 1)、UCHL5(r=0.629 8)和WDR12(r=0.619 2)等基因呈显著正相关，与LTC4S(r=‒0.491 0)、FCGBP(r=‒0.488 9)和TLR2(r=-0.486 6)等基因呈显著负相关。在LUSC中，DARS2的表达与CENPL(r=0.620 5)、FAM72D(r=0.607 2)和NUF2(r=0.605 6)等基因呈显著正相关，与RRAS(r=-0.445 7)、LDLRAD2 (r=‒0.441 6)、IL34 (r=‒0.441 0)等基因呈现显著负相关。使用Metascape数据库，参数模块选择种属“人类”(H. sapiens)，列表中输入与DARS2正负相关性排名前100的基因，进行通路功能富集分析。结果显示，在LUAD中主要富集在ncRNA代谢、细胞周期和线粒体基因表达等环节(图 5A)，在LUSC中主要富集在有丝分裂细胞周期、细胞周期和纺锤体组装等环节(图 5B)。这些结果提示DARS2可能通过参与调控细胞周期信号通路促进NSCLC进展。
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| A-B: Volcano map of the distribution of DARS2 co-expressed genes in LUAD and LUSC; C-F: Heat maps showed the top 50 significant genes positively or negatively correlated with DARS2 in LUAD (C-D) and LUSC (E-F), in which the blue part stands for positively correlated genes and the red part stands for negatively correlated genes (Linkedomics). 图 4 NSCLC中与DARS2共表达的基因 Fig 4 Genes in association with DARS2 in NSCLC |
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| Metascape analyses of the top 100 genes positively or negatively correlated with DARS2 in LUAD (A) and LUSC (B). 图 5 相关基因富集分析 Fig 5 Enrichment analysis of correlated genes |
我国统计结果显示，2020年全国新增肺癌诊断病例约82万例，相关死亡病例约71.5万例[10]。由于其复杂的生物过程且缺乏有效的生物标志物，肺癌患者的5年存活率较低(约20%)。AARS在生物体内广泛存在，其中37种AARS均由核基因组编码，主要参与细胞质和线粒体的蛋白质生物合成，此外还参与小分子代谢、细胞凋亡、肿瘤发生、组织发育、血管生成和免疫应答等[11]。研究结果表明，AARS的功能与癌症调控有关[12]。AARS通过调节肿瘤细胞生长、分化、细胞周期、细胞因子活性、RNA剪接、细胞黏附和血管生成等，在肿瘤发病机制中发挥重要作用。既往研究表明，异亮氨酰-tRNA合成酶2(isoleucyl-tRNA synthetase 2，IARS2)沉默可抑制A549和H1299细胞的活性，导致A549细胞的G0/G1停滞和线粒体凋亡，并通过AKT/MTOR途径调节肺癌细胞的增殖[13]。还有研究发现蛋氨酸-tRNA合成酶(methionyl-tRNA synthetase，MRS)在肺癌组织中的表达量增加且与细胞周期的进展密切相关[3]。
DARS2属于AARS家族，组织特异性DARS2缺失导致线粒体功能紊乱，进而导致心肌和骨骼肌的线粒体呼吸功能缺失[14]。研究发现，DARS2与神经系统疾病发生发展密切相关[15-16]，如其突变可致涉及脑干和脊髓的脑白质病，并伴随过量乳酸堆积。目前DARS2在癌症方面相关研究较少。在乙肝病毒感染所致的肝癌中，转录因子NFAT5的表达被该病毒抑制进而会导致DARS2的表达水平上升，肝癌细胞凋亡率下降[17]。
本研究通过多种公共数据库进行比对分析，发现DARS2在NSCLC的两种亚型LUAD与LUSC中均高表达，且高表达DARS2的LUAD患者具有更短的生存期。为了探究DARS2在LUAD中生物学作用，构建了DARS2基因敲低的H1299细胞株，通过细胞增殖与划痕实验发现DARS2可以促进H1299细胞增殖迁移。通过cBioPortal数据库评估DARS2在肺癌中的变异模式，结果发现，DARS2在LUAD与LUSC中均发生了突变，错义突变是两者最普遍的突变模式。低甲基化作为一种刺激癌基因的机制，可促进肿瘤的发生，我们对DARS2进行了甲基化分析，与正常组织相比，在LUAD组织中DARS2表现出明显低甲基化。对与DARS2相关基因进行分析，Linkedomics显示LUAD中正相关性排名前3位的基因是NDUFS1、UCHL5和WDR12，LUSC中正相关性排名前3位的基因是CENPL、FAM72D和NUF2。NDUFS1是线粒体复合体Ⅰ的最大亚单位，先前研究显示NDUFS1是由2q33-miR-3130-5p轴靶向的一个潜在的肿瘤抑制因子，影响LUAD的侵袭性[18]。UCHL5在NSCLC组织中高表达，在LUAD细胞中敲除UCHL5能明显抑制细胞增殖并减少关键细胞周期蛋白的表达[19]。WDR12是一个癌基因，在多种人类恶性肿瘤中过表达，其过表达与不良的预后相关[20]。敲除CENPL可明显抑制CDK2和CCNE2的表达，并诱导LUAD的G0/G1停滞和凋亡[21]。FAM72D是控制细胞增殖和生存的FOXM1转录因子网络的一部分[22]。敲除NUF2能抑制LUAD细胞的增殖、迁移、侵袭、上皮-间质转化和集落形成[23]。富集分析结果显示，在LUAD与LUSC中，与DARS2相关的基因在细胞周期通路高度集中。关于DARS2调控细胞周期，有研究结果指出，ADP-DnaA转化为ATP-DnaA需要DARS2参与，并通过一个负反馈环以细胞周期依赖性方式进行调节[24]。
综上所述，本研究发现DARS2在NSCLC组织中高表达，DARS2过表达与LUAD患者不良预后相关，且与病理分期正相关。在LUAD细胞中敲低DARS2基因后，细胞的迁移和侵袭能力明显降低，DARS2可能以参与细胞周期通路的方式调控NSCLC进展。本研究局限性在于，相关分析结果多来自公共数据库，缺乏实验研究及临床样本分析，且未能补充DARS2过表达实验，后续将进一步明确DARS2在NSCLC中分子机制及作用。
作者贡献声明 艾尼瓦尔·肉孜 实验操作，数据分析，论文撰写。韩林晓，吴圆圆，朱文思 实验设计和指导。刘静，刘尽国 论文修订。周建 研究设计，论文修订。
利益冲突声明 所有作者均声明不存在利益冲突。
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