2023, Vol. 50
宫颈癌目前是全球女性第四大恶性肿瘤，在我国女性生殖系统肿瘤中高居第二[1-2]，且国内其发病率和死亡率都呈逐年增长趋势[3-4]，严重增加社会经济负担。宫颈癌的治疗往往存在术后转移，对化疗耐药，对放疗不敏感等问题，免疫治疗和靶向治疗成为近年的研究热点[5-8]。
整合素家族是一类由α和β两个亚基通过非共价形成的异二聚体跨膜蛋白，在不同细胞或细胞中充当细胞表面黏附受体介导细胞之间或者细胞与细胞外基质（extracellular matrix，ECM）之间的双向信号转导[9-10]。ITGA5是整合素α链家族的成员，位于人染色体12q13.13上，主要通过与整合素β1形成α5β1异二聚体跨膜蛋白发挥功能[11-12]。研究表明ITGA5在多种肿瘤中显著上调，通过调节肿瘤细胞的生长、迁移、侵袭和上皮间质转化参与肿瘤进展[13-14]。进一步研究表明，ITGA5还与肿瘤细胞的干细胞特性相关，并能维持化疗抵抗[15-16]。这些研究结果提示ITGA5可作为肿瘤转移和化疗抵抗的潜在治疗靶点。然而，ITGA5在宫颈癌中的表达和生物学功能仍然未知。本研究通过数据库分析ITGA5在宫颈癌中的表达，并从细胞水平探讨ITGA5对宫颈癌细胞生长和侵袭的影响。
材料和方法主要实验试剂 永生化的宫颈上皮细胞NC104以及人宫颈癌细胞系CaSki、ME-180、SiHa、HeLa和C-33A购自上海生科院细胞所并保存于液氮中；胎牛血清（FBS）与DMEM高糖培养基购自美国HyClone公司；青霉素-链霉素购自北京天根生物科技有限公司；Cell Counting Kit-8试剂盒购自日本Dojindo Molecular Technologies公司；Transwell基质胶以及AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自美国BD Biosciences公司；兔抗鼠c-Myc多克隆抗体（1∶1 000）、E-cadherin多克隆抗体（1∶1 000）、Vimentin多克隆抗体（1：1000）、BCL-2多克隆抗体（1∶1 000）购自美国Cell Signaling Technology公司；Bax多克隆抗体（ab32503，1∶1 000）、兔抗鼠ITGA5多克隆抗体（1∶1 000）购自美国Thermo Fisher Scientific公司；GAPDH内参抗体以及二抗购自北京康为世纪生物科技有限公司。
数据分析 分别使用TNMplot数据库（https://tnmplot.com/analysis/）评估ITGA5mRNA的表达；Human Protein Atlas数据库（HPA，https://www.proteinatlas.org/）评估ITGA5在宫颈癌组织中的蛋白表达及预后；Kaplan-Meier Plotter数据库（https://kmplot.com/analysis/）评估ITGA5的mRNA水平与预后的相关性。
细胞培养 人宫颈癌细胞系HeLa与C-33A用含有10%FBS的DMEM高糖培养基置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养。每隔一天更换新鲜培养基。
干扰序列 两条靶向ITGA5的特异性siRNA和非特异性siRNA均购自上海吉玛基因股份有限公司。
实验分组 实验分为3组：siITGA5#1干扰组、siITGA5#2干扰组和阴性对照组（非特异性siRNA）。
siRNAs转染HeLa/C-33A细胞 对数期生长的细胞约1×106个接种于直径10 cm的细胞培养皿中，待细胞融合度达到40%~60%时瞬时转染阴性对照（Control）或ITGA5 siRNAs，转染过程参照lipofectamine RNAiMAX（美国Thermo Fisher Scientific公司）说明书。转染48 h后收集蛋白验证干扰效率以及后续实验。
RNA的提取以及实时定量PCR 根据Trizol说明书提取细胞总RNA，引物序列如下：内参GAPDH引物序列，上游5'-ACAACTTTGGT ATCGTGGAAGG-3'，下游5'-GCCATCACGCC ACAGTTTC-3'，片段长度101 bp；ITGA5引物序列，上游5'-GGCTTCAACTTAGACGCGGAG-3'，下游5'-TGGCTGGTATTAGCCTTGGGT-3'，片段长度140 bp。反应程序：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性30 s，60℃退火以及延伸1 min，40个循环。以GAPDH作为参照分析目的基因的表达差异。
细胞活力测定 收集对数期生长的细胞，将大约800个细胞接种到96孔板每孔，分别于24、48、72 h时将10 μL的CCK 8试剂添加到每个孔中，在37 ℃下孵育2 h。用酶标仪（Bia-Rad）在450 nm处检测各孔的吸光度值，描述细胞生长曲线。
流式细胞仪检测细胞凋亡 转染48 h后的细胞使用不含EDTA的胰酶消化细胞并收集，并根据AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒（美国BD Biosciences公司）说明书染色，标记早期和晚期凋亡细胞并通过流式细胞仪检测样品的凋亡水平。
Transwell检测 将融化的Matrigel基质胶（美国BD Biosciences公司）用预冷无血清培养基按1∶5稀释，加入Transwell小室，放入细胞培养箱中孵育2 h。收集细胞，约2×104个（100 μL无血清培养基）细胞接种到上层Transwell上层，并将600 μL含20% FBS的培养基添加到下室中。细胞培养箱中继续培养24~36 h，然后将细胞在4%多聚甲醛中固定20 min，用0.1%结晶紫染色15 min。使用棉棒去除未穿透的上部细胞后，对侵袭的细胞进行拍照和计数。
Western blot检测 将含有蛋白酶抑制剂PMSF的RIPA细胞裂解液（美国CST公司）溶解细胞提取蛋白，冰上裂解30 min后，4 ℃ 11 000×g离心后取上清测定蛋白浓度。加入上样缓冲液（北京索莱宝科技有限公司）100 ℃加热10 min，在10%的SDS-PAGE凝胶中分离、转膜、5%脱脂奶粉封闭30 min，根据目的蛋白的相对分子质量裁剪条带并与相应的抗体在4 ℃孵育过夜，洗膜后使用山羊抗兔IgG-HRP二抗60 min，随后显色、曝光。GAPDH作为管家基因标准化蛋白质表达。
统计学分析 采用GraphPad Prism 5.0软件进行统计学分析并制图，数据以x±s表示。组间数据差异使用t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
结果ITGA5在宫颈癌患者中的表达水平以及生存分析 为了阐明ITGA5在宫颈癌中的作用，我们先应用依赖于肿瘤基因组图谱（TCGA）的GEPIA2和UALCAN数据库分析平台，发现缺少足够的对照病例，分析结果不可靠。因此我们换用TNMplot数据库分析了ITGA5 mRNA在正常组织以及肿瘤中的表达，发现ITGA5的mRNA水平在宫颈癌组织中显著升高（图 1A）。Kaplan-Meier分析表明，ITGA5呈高表达的宫颈癌患者5年以及5年以上总体生存率较低（图 1B）。Human Protein Atlas数据库显示：宫颈癌组织中的ITGA5蛋白表达水平与宫颈癌患者总体生存率呈负相关（图 1C~D）。上述分析表明ITGA5在宫颈癌中呈高表达并可能作为原癌基因促进宫颈癌进展。
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| A: Differential expressions of ITGA5 between cervical cancer tissues and normal tissues were analyzed by TNMplot.B: Overall survival and 5 years overall survival were analyzed by Kaplan-Meier Plotter.C: IHC analysis of the tissue microarray by staining the ITGA5 antibody (×100).The typical image of ITGA5 in the cervical cancer tissue was shown.D: The ITGA5 related overall survival in cervical cancer was analyzed by Human protein atlas. 图 1 ITGA5在宫颈癌组织中的表达以及患者的生存分析 Fig 1 ITGA5 expression in cervical cancer tissues and the survival analysis of the patients |
敲低ITGA5的表达抑制宫颈癌细胞增殖和诱导细胞凋亡 鉴于ITGA5在宫颈癌组织中呈高表达，我们进一步在细胞水平做功能研究。首先检测了ITGA5的mRNA及蛋白水平在正常宫颈上皮细胞NC104和宫颈癌细胞CaSki、ME-180、SiHa、HeLa、C33A中的表达。与NC104细胞比较，内源性ITGA5的mRNA及蛋白水平在多类宫颈癌细胞中呈高表达，尤其在HeLa及C-33A细胞中高表达最为显著（图 2A），故选择这两种细胞用于敲低ITGA5做后续实验。采用ITGA5特异性siRNAs转染HeLa/C-33A细胞，Western blot检测显示siRNAs可有效下调HeLa/C-33A细胞内ITGA5的表达；干扰ITGA5后，细胞裂解液中增殖基因蛋白c-Myc、抗凋亡因子BCL-2显著下调，促凋亡因子Bax明显增加（图 2B）。CCK-8实验结果显示，与对照组相比，ITGA5干扰组的细胞生长明显受抑（图 2C，P < 0.01，t=7.932）。流式细胞术分析结果显示，干扰ITGA5后，HeLa/C-33A细胞凋亡水平显著升高（图 2D，P < 0.01，t=8.908）。上述结果表明ITGA5是影响宫颈癌细胞生长的重要基因，ITGA5对宫颈癌细胞生长的抑制作用可能是通过调控增殖和凋亡相关蛋白来实现的。
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| A: The mRNA and protein of ITGA5 incervical cancer cells determined by qRT-PCR and Western blot, respectively.(1)vs. NC104, P < 0.05. B: HeLa/C-33A cells were transfected with Control, siITGA5#1, or siITGA5#2 for 48 h. Cells were collected for Western blot analysis.C: Cell proliferation was analyzed by CCK-8 assay. (1)vs. Control, P < 0.05.D: Cell apoptosis was detected by flow cytometry. Data presents as mean±SD with 3 replicates. (1)vs. Control, P < 0.01. 图 2 干扰ITGA5的表达抑制宫颈癌细胞增殖并促进凋亡 Fig 2 Interference with the expression of ITGA5 inhibits cervical cancer cell proliferation and promotes apoptosis |
体外敲低ITGA5的表达抑制宫颈癌细胞的侵袭以及相关基因 肿瘤细胞的迁移是肿瘤转移的直接原因，而细胞迁移的前提取决于细胞的侵袭能力。因此我们应用Transwell小室侵袭实验评估ITGA5对宫颈癌细胞的侵袭能力影响。结果显示干扰内源性ITGA5的表达大大降低了宫颈癌细胞的侵袭能力（图 3A，P < 0.01，t=8.248）。Western blot进一步检测上皮细胞间质化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）标记物，发现下调内源性ITGA5能显著抑制间质性标记物波形蛋白（Vimentin），并上调上皮细胞标记物E-钙黏蛋白（E-cadherin）的表达（图 3B）。
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| A: Cell invasion assessed by Transwell assay. The number of migrated or invaded cells were presented as the mean±SD of three independent experiments.B: Western blot reveals the change of main proliferation markers and apoptosis markers after ITGA5 knockdown. 图 3 干扰ITGA5的表达抑制宫颈癌细胞的侵袭以及影响相关基因 Fig 3 Interference with ITGA5 expression suppressed the invasion of cervical cancer cells and affected related genes |
ITGA5是整合素α链家族的成员，与整合素β形成异二聚体跨膜受体参与细胞与细胞外基质的附着和细胞与细胞外基质的双向信号传导[9]。ITGA5在多种肿瘤中呈高表达，Zhou等[17]使用GEO数据库以及TCGA数据库分析了ITGA5在喉鳞状细胞癌中的表达，发现ITGA5在喉鳞状细胞癌组织中的表达上调，高表达ITGA5的喉鳞状细胞癌患者总生存率以及无复发生存率显著降低。Pantano等[18]通过分析大数据标本，发现早期乳腺癌患者原发性肿瘤中ITGA5的高表达与乳腺癌骨转移正相关，可作为乳腺癌溶骨性病变的治疗靶点。Zhu等[19]通过分析Oncomine与Tumor Immune Estimation Resource（TIMER）数据库，发现ITGA5是胃肠道肿瘤免疫细胞浸润的重要调节因子，是有价值的预后生物标志物。越来越多的研究表明ITGA5的上调与肿瘤侵袭和进展密切相关。Fan等[20]报道了ITGA5在口腔鳞状细胞癌上调，干扰口腔鳞状细胞癌细胞系的内源性ITGA5表达，可以通过调节PI3K/AKT信号通路抑制肿瘤细胞的生长与侵袭。另有研究表明，ITGA5通过诱导肿瘤细胞发生EMT来促进口腔鳞状细胞癌的侵袭[11]。靶向下调ITGA5可通过降低β-catenin入核，调节下游原癌基因的转录，从而实现体内抑制乳腺癌的生长[21]。Yu等[13]发现O-（连接）-N-乙酰葡糖胺（O-GlcNAc）糖基化修饰（O-GlcNAcylation）的ITGA5在促进肿瘤的生长以及转移等恶性生物学功能中具有很好的临床学意义。最近的研究表明ITGA5的上调还与肿瘤的耐药性有关，Kuninty等[16]发现仅仅干扰胰腺星状细胞中内源性的ITGA5表达，就能有效抑制胰腺细胞结缔组织增生，增强胰腺化疗效果。同样，ITGA5的高表达是胶质瘤患者抵抗Temozolomide与Bevacizumab治疗效果的关键因素[22]。
然而，ITGA5在宫颈癌的研究报道较为罕见。为了探索ITGA5在宫颈癌中可能的生物学功能，我们首先使用数据库查询发现ITGA5在宫颈癌组织中亦显著上调，且ITGA5高表达的宫颈癌患者总生存率显著下降。蛋白水平数据亦支持ITGA5作为一个原癌基因参与宫颈癌的进程。这个分析与ITGA5在其他肿瘤中的报道一致。
在后续细胞实验中，我们发现靶向ITGA5的siRNAs敲低内源性ITGA5的表达后，宫颈癌细胞系的增殖能力显著降低，凋亡水平增加，表明ITGA5对宫颈癌细胞的生长有促进作用。ITGA5作为整合素家族的重要成员，可为细胞的机械黏附提供桥梁，并增加肿瘤细胞转移和侵袭的能力[19]。因此，我们进一步检测了ITGA5对宫颈癌细胞侵袭能力的影响，结果显示干扰ITGA5后，宫颈癌细胞的侵袭能力明显降低。
上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型的细胞即EMT，这个生物学过程赋予了细胞入侵和转移的能力。通过EMT，上皮细胞失去了细胞极性，缺失了与基底连接等上皮表型，从而获得了较高的侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质的能力等间质表型。因此，EMT是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得侵袭和迁移能力的重要生物学过程。Vimentin和E-cadherin是EMT过程中两个主要的分子标记物。Vimentin是存在于间充质细胞中的一种中间丝蛋白，能使上皮细胞失去极性、破坏细胞间紧密连接结构，改变细胞骨架，减弱黏附力、促进肿瘤细胞侵袭和远处转移。相反，E-cadherin可维持细胞间紧密连接，阻止细胞活动侵袭及转移扩散。本研究敲低ITGA5表达后，宫颈癌细胞侵袭能力显著下降，同时Vimentin表达下降、E-cadherin表达上调，提示ITGA5对宫颈癌细胞侵袭能力的影响可能是通过调控EMT实现的。
综上所述，我们使用数据库分析了ITGA5作为宫颈癌原癌基因的可能性，并通过细胞实验证实了ITGA5对宫颈癌细胞的生长和侵袭能力发挥重要的作用。但是阐明其分子机制还需要更深入的研究，其作为治疗靶点的可能性有待于进一步探索。
作者贡献声明 董晶 数据采集，论文构思、撰写和修订。商双 辅助数据采集和论文修订。谢锋 数据统计和分析，模型运算，论文修订。
利益冲突声明 所有作者均声明不存在利益冲突。
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