2022, Vol. 49
肥胖已成为世界性公共卫生问题[1]。肥胖患者常合并2型糖尿病、脂肪肝、高血压、阻塞性睡眠呼吸暂停、神经退行性疾病等，影响生活质量甚至预期寿命，节食、运动和药物治疗是常用的治疗方法[2-3]。近年来，随着减重代谢外科手术的发展，腹腔镜胃袖状切除术得到广泛应用，约占减重手术的60%，且临床治疗效果显著[4-6]。然而，减重手术改善肥胖及其相关疾病的分子机制还有待进一步研究。有研究通过腹腔注射戊巴比妥钠的麻醉方式建立减重手术模型[7]，本研究通过高脂饮食喂养C57BL/6J小鼠来诱导肥胖模型；同时创新性使用吸入麻醉药物进行动物的麻醉诱导和维持，以建立胃袖状切除术小鼠模型，从而为研究肥胖人群及吸入麻醉药物相关机制提供安全有效的动物模型。
资料和方法实验动物及分组 40只3周龄雄性SPF级C57BL/6J小鼠，体重为（17.17±1.16）g，购于北京斯贝福实验动物技术有限公司。本研究通过复旦大学附属中山医院动物伦理委员会审批（批准号：2020-035）。
适应性喂养1周后，采用随机数字表法将小鼠分为两组：普通饮食（standard diet，SD）组和高脂饮食（high-fat diet，HFD）组，每组20只。普通饮食组喂养普通饲料，高脂饮食组喂养脂肪供能比为60%的高脂饮食（D12492）。SPF环境饲养，恒温、恒湿，12 h光照-黑暗循环，自由饮水，每笼3~5只。每日观察动物一般情况，每2周测量1次体重及空腹血糖。饲养20周，两组各取5只小鼠进行相关检测，其余小鼠再分为4个亚组，分别为普通饮食假手术（SD+sham）组（n=5）、普通饮食手术（SD+SG）组（n=10）、高脂饮食假手术（HFD+sham）组（n=5）、高脂饮食手术（HFD+SG）组（n=10）。
检测指标及方法 饲养20周，普通和高脂饮食组各取5只小鼠，进行葡萄糖耐量试验（glucose tolerance testing，GTT）、血脂及肝组织病理学检测。
GTT小鼠禁食16 h，不禁水，腹腔注射葡萄糖溶液2 g/kg，注射后0、15、30、60、120 min，尾静脉取血测定血糖值。
血清血脂水平 腹腔注射戊巴比妥钠麻醉小鼠，1 mL无菌注射器心尖部取血0.5~1 mL，室温静置1 h后离心（4 ℃，1 000×g，15 min），取上清液，放入‒80 ℃冰箱保存，用于测定血脂水平。采用酶标仪比色法检测血清总胆固醇及三酰甘油水平，操作流程遵照试剂盒说明书（南京建成生工有限公司）。
肝组织病理学 腹腔注射戊巴比妥钠麻醉小鼠，开腹取出肝脏，用生理盐水冲去表面血液，放于标尺盘上拍照（生理解剖位）。取肝左叶进行油红O染色及HE染色。
胃袖状切除术
术前准备 术前禁食12 h，自由饮水。为避免术中脱水，术前皮下注射20 mL/kg生理盐水。
麻醉方案 麻醉诱导采用3%异氟醚+氧气（2 L/min），维持期间异氟烷挥发罐设置为2%，氧流量为1 L/min。
手术步骤 参考文献[7]。小鼠仰卧位，固定于75%乙醇消毒的35 ℃恒温加热手术台上。备皮，碘伏消毒手术区域，铺无菌单。剑突下沿腹正中线做1~2 cm切口，分离肌肉层，打开腹腔，注意分离过程，切勿伤及腹腔脏器。放置一个固定撑开器以充分暴露腹部视野，用两根湿棉签轻轻推开肝脏，暴露胃部。使用眼科镊将胃提出腹部，仔细分离胃周疏松的结缔组织以游离胃。用小型电凝刀离断肝胃韧带、胃脾韧带、胃网膜右动脉，充分止血。沿着胃大弯，用动脉夹对口夹闭胃壁，从胃食管连接处5 mm到距幽门5 mm处，切掉约80%胃组织，留下与胃食管连接处与幽门连续的狭窄胃组织，清除胃内容物，碘伏消毒残端，6-0带线缝针间断垂直内翻缝合切口，确认缝合，彻底止血。将胃轻轻还纳腹腔并取出牵开器，充分冲洗手术部位周围的肌肉和皮肤。使用4-0带针缝线缝合腹膜、肌肉、皮肤，伤口局部涂抹组织胶（图 1）。残胃缝合后密切观察吻合口是否有液体渗出，一旦发现渗漏，再缝一层。
|
| Representative steps of sleeve gastrectomy.A midline abdominal incision of length 1.0-2.0 cm was made below the xiphoid process to expose the stomach.Remove approximately 80% of the stomach.The incision in the stomach was closed to reconstruct the gastric sleeve.The abdominal muscle and skin were closed. 图 1 C57BL/6J小鼠胃袖状切除术示意图 Fig 1 Schematic diagram of sleeve gastrectomy in C57BL/6J mice |
术后护理 将小鼠放置于加热毯上，密切观察意识状态及呼吸，直至麻醉苏醒。术后第1天禁食禁水，皮下注射糖盐水20 mL/kg；术后第2~3天流质饮食；术后第4天各组恢复普通饮食；术后连续3天肌肉注射青霉素（30 000 U/kg）预防感染；术后每日观察小鼠一般情况并及时对症处理。术后每周称量1次体重。
假手术 假手术组所有小鼠开腹后仅进行胃组织游离，其他步骤及麻醉方式均同胃袖状切除术组。
统计学分析 用GraphPad Prism 7.0软件对数据进行统计学分析及作图。符合正态分布的计量资料以x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，3组及以上比较采用单因素方差分析，并采用LSD法进行两两比较；体重及血糖比较采用两因素重复测量方差分析。P < 0.05为差异有统计学意义。
结果小鼠体重变化 适应性喂养1周后，普通饮食组及高脂饮食组小鼠的体重分别为（17.16±1.06）g和（17.19±1.25）g，差异无统计学意义。高脂饮食喂养4周后，高脂饮食组小鼠体重显著高于普通饮食组（P < 0.05），并一直持续至喂养结束（图 2A）；喂养20周后，普通饮食组及高脂饮食组小鼠的体重分别为（32.23±1.73）g和（42.71±2.30）g（图 3A），高脂饮食组小鼠体重比普通饮食组增加20%以上。
|
| A: Before the operation (n=20 per group); B: Effects of SG on body weight.SD: Standard diet; HFD: High-fat diet; SG: Sleeve gastrectomy. (1) vs. SD group, P < 0.05. 图 2 各组小鼠体重变化 Fig 2 Changes of body weight of mice in different groups |
|
| A: Diet-induced obesity in C57BL/6J mice; B: Liver of mice.SD: Standard diet; HFD: High-fat diet. 图 3 普通饮食和高脂饮食小鼠及其肝脏比较 Fig 3 Comparison of the mice fed by SD and HFD and their liver |
高脂饮食手术组和假手术组小鼠术前体重分别为（43.82±1.76）g和（42.25±1.64）g，差异无统计学意义。高脂饮食手术组及假手术组小鼠术后第1周体重均显著下降（P < 0.05，图 2B）；接下来3周，高脂饮食假手术组小鼠体重逐渐恢复，术后第3周已恢复至术前体重，而高脂饮食手术组小鼠术后体重持续下降；术后第4周，高脂饮食手术组小鼠体重为（35.63±1.86）g，较术前下降约20%，显著低于假手术组[（42.68±1.95）g]（P < 0.01）。普通饮食组小鼠术后体重变化趋势与高脂饮食组一致。
血糖及葡萄糖耐量 普通饮食组和高脂饮食组小鼠适应性喂养1周后基础血糖分别为（5.61±0.86）mmol/L和（5.58±0.36）mmol/L，差异无统计学意义。喂养16、18及20周后，高脂饮食组小鼠血糖均显著高于普通饮食组小鼠（P < 0.05，图 4A）。喂养20周后，两组小鼠血糖分别为（6.74±0.31）mmol/L和（8.82±0.51）mmol/L。喂养20周后，高脂饮食组小鼠GTT 0、15、30、60、120 min血糖均高于普通饮食组小鼠，且AUC高于普通饮食组（P < 0.01，图 4B、4C）。
|
| A: Fasting blood glucose level (n=20 per group); B: Blood glucose levels after glucose injection (2 g/kg); C: AUC.SD: Standard diet; HFD: High-fat diet. vs. SD group, (1)P < 0.05, (2)P < 0.01. 图 4 普通饮食和高脂饮食小鼠的血糖及葡萄糖耐量比较 Fig 4 Blood glucose and glucose tolerance testing of the mice fed by SD and HFD |
血脂水平 喂养20周后，高脂饮食组小鼠血清总胆固醇显著高于普通饮食组，分别为（4.40±0.57）mmol/L和（2.31±0.35）mmol/L（P < 0.01，t=6.24）；血清三酰甘油显著高于普通饮食组小鼠，分别为（2.26±0.25）mmol/L和（1.11±0.24）mmol/L（P < 0.01，t=6.72）。
手术成功率及存活率 各组手术均顺利完成（图 5A）。假手术组小鼠存活率为100%。高脂饮食手术组小鼠存活率为70%（7/10）：术后死亡1只（麻醉未苏醒）；术后第1天死亡1只（腹腔内出血）（图 5B）；术后第3天死亡1只（吻合口瘘及腹腔感染）（图 5C）。其余小鼠均在术后第2天恢复流质饮食；术后第4天正常饮食。普通饮食手术组小鼠存活率为80%（8/10）；术后第1天死亡1只（腹腔内出血）；术后第3天死亡1只（腹腔感染）。
|
| A: Incision healed well; B: Intra-abdominal bleeding; C: Intra-abdominal infection. 图 5 高脂饮食小鼠术后情况及并发症 Fig 5 Postoperative state and complications of the mice fed by HFD |
组织病理学结果 高脂饮食组小鼠肝脏肉眼可见脂肪肝改变（图 3B）。肝脏组织HE染色后镜下示：高脂饮食小鼠肝脏呈现明显脂肪浸润及肝细胞脂肪变性；普通饮食小鼠肝小叶结构清晰完整，肝细胞呈多边形，细胞核圆且位于细胞中央（图 6）。肝脏组织油红O染色后镜下示：高脂饮食小鼠肝脏出现大片脂质沉积；普通饮食小鼠肝脏无明显脂质沉积（图 6）。
|
| 图 6 普通饮食和高脂饮食小鼠肝脏HE染色及油红O染色 Fig 6 Representative microphotographs of HE and oil red O-stained liver section of the mice fed by SD and HFD |
肥胖是一个世界性的健康问题。1990年至2015年，高体质指数已导致全球400万人死亡[8]，预计到2025年全球肥胖患病率将在男性中达18%，在女性中超过21%[9]。众所周知，肥胖会增加多种疾病的患病风险，包括血脂异常、2型糖尿病、高血压及多种癌症[8, 10-12]。肥胖患者更易发生中枢神经系统疾病，如阿尔茨海默症、中风、痴呆、抑郁症[10, 13]。
肥胖是遗传基因和环境因素相互作用的结果。遗传性肥胖相对罕见。环境因素可引起肥胖，如饮食类型或运动水平。啮齿动物遗传模型（ob/ob和db/db小鼠或Zucker大鼠）已用于肥胖的机制研究。饮食诱导的肥胖模型（diet-induced obesity，DIO）能更好地代表肥胖及相关病理生理学变化，便于进行时间相关性研究，并可用于比较不同类型饮食对肥胖的影响。啮齿动物的饮食主要包括标准饮食、西方饮食、高糖饮食、高胆固醇饮食、高脂饮食等，其中高脂饮食是最常用的DIO饮食类型。本研究采用高脂饮食喂养20周成功建立了肥胖小鼠模型，喂养4周后开始出现差异，最终组内所有小鼠体重均比普通饮食小鼠平均体重增加20%以上，且高脂饮食组血脂水平及血糖水平均较普通饮食组显著升高。
近年来，我国的减重手术日益增加，由2014年的4 000例增长至2019年的1万例以上[14]。减重手术主要术式包括腹腔镜胃袖状切除术（laparoscopic sleeve gastrectomy，LSG）、腹腔镜Roux-en-Y胃旁路术、胆胰转流十二指肠转位术。其中，LSG因术式简单、疗效好且并发症少而被较多应用[15]。肥胖相关的基础研究也越来越多，主要集中于代谢、能量平衡、炎症等方面，这些都可能是减重手术治疗效果的潜在机制[16-17]。一个安全有效的肥胖小鼠模型和胃袖状切除术模型有利于减重手术治疗肥胖相关疾病的机制研究，进而应用于临床肥胖症患者的诊疗。本研究在既往研究的基础上加以创新与改进，比如麻醉方式、缝合线的选择、术后镇痛、术后抗感染方案等，成功建立了胃袖状切除术的小鼠模型，存活率高且术后小鼠体重下降明显。胃袖状切除术为一项侵袭性手术操作，术中需要对小鼠的消化系统进行重建，主要难点在于提高围术期存活率，主要与术后出血及腹腔感染相关。小鼠因为体型特点，手术操作空间小，手术难度进一步增加。术后出血及术后感染是小鼠死亡的主要原因，因此手术区域彻底止血及围术期应用抗生素预防感染十分重要。高脂饮食手术组中1只小鼠麻醉未苏醒且体温较低，腹部手术创面大，散热多，故围术期保温十分重要。
本研究不足之处在于：（1）由于建模时间长，饲养笼位有限，故样本量较少；（2）仅在术后使用抗生素，如果手术前后均使用抗生素，可能降低术后腹腔感染，降低手术组小鼠死亡率。
高脂饮食喂养20周可诱导C57BL/6J小鼠肥胖，并成功实施胃袖状切术。本研究为减重手术改善肥胖相关疾病的机制研究提供了一个可行且有效的模型。
作者贡献声明 马媛媛 文献调研和整理，数据采集和分析，论文构思、设计、撰写和修订。葛圣金 研究构思和指导，论文指导和修订。
利益冲突声明 所有作者均声明不存在利益冲突。
| [1] |
BLUHER M. Obesity: global epidemiology and pathogenesis[J]. Nat Rev Endocrinol, 2019, 15(5): 288-298.
[DOI]
|
| [2] |
MASSETTI GM, DIETZ WH, RICHARDSON LC. Excessive weight gain, obesity, and cancer: opportunities for clinical intervention[J]. JAMA, 2017, 318(20): 1975-1976.
[DOI]
|
| [3] |
BRAGG F, TANG K, GUO Y, et al. Associations of general and central adiposity with incident diabetes in Chinese men and women[J]. Diabetes Care, 2018, 41(3): 494-502.
[DOI]
|
| [4] |
ANGRISANI L, SANTONICOLA A, IOVINO P, et al. IFSO worldwide survey 2016:primary, endoluminal, and revisional procedures[J]. Obes Surg, 2018, 28(12): 3783-3794.
[DOI]
|
| [5] |
AFFINATI AH, ESFANDIARI NH, ORAL EA, et al. Bariatric surgery in the treatment of Type 2 diabetes[J]. Curr Diab Rep, 2019, 19(12): 156.
[DOI]
|
| [6] |
WAN B, FANG N, GUAN W, et al. Cost-fffectiveness of bariatric surgery versus medication therapy for obese patients with Type 2 diabetes in China: a markov analysis[J]. J Diabetes Res, 2019, 2019: 1341963.
|
| [7] |
江多斯·帕依孜吾拉, 赵培吉, 李涛, 等. DIO小鼠袖状胃切除术与改良Roux-en-Y胃旁路术模型建立[J]. 中华肥胖与代谢病电子杂志, 2018, 4(4): 212-217. [CNKI]
|
| [8] |
COLLABORATORS GBDO, AFSHIN A, FOROUZANFAR MH, et al. Health effects of overweight and obesity in 195 countries over 25 years[J]. N Engl J Med, 2017, 377(1): 13-27.
[DOI]
|
| [9] |
COLLABORATION NCDRF. Trends in adult body-mass index in 200 countries from 1975 to 2014:a pooled analysis of 1698 population-based measurement studies with 19.2 million participants[J]. Lancet, 2016, 387(10026): 1377-1396.
[DOI]
|
| [10] |
O'BRIEN PD, HINDER LM, CALLAGHAN BC, et al. Neurological consequences of obesity[J]. Lancet Neurol, 2017, 16(6): 465-477.
[DOI]
|
| [11] |
TOBIAS DK, PAN A, JACKSON CL, et al. Body-mass index and mortality among adults with incident type 2 diabetes[J]. N Engl J Med, 2014, 370(3): 233-244.
[DOI]
|
| [12] |
HRUBY A, MANSON JE, QI L, et al. Determinants and consequences of obesity[J]. Am J Public Health, 2016, 106(9): 1656-1662.
[DOI]
|
| [13] |
FARRUGGIA MC, SMALL DM. Effects of adiposity and metabolic dysfunction on cognition: A review[J]. Physiol Behav, 2019, 208: 112578.
[DOI]
|
| [14] |
王勇, 王存川, 朱晒红, 等. 中国肥胖及2型糖尿病外科治疗指南(2019版)[J]. 中国实用外科杂志, 2019, 39(4): 301-306. [CNKI]
|
| [15] |
KARADAG C, DEMIRCAN S, CALISKAN E. Effects of laparoscopic sleeve gastrectomy on obstetric outcomes within 12 months after surgery[J]. J Obstet Gynaecol Res, 2020, 46(2): 266-271.
|
| [16] |
STOICA L, DOBRESCU A, ISAIC A, et al. Metabolic and hormonal changes after sleeve gastrectomy and mini gastric bypass in a rat model of induced type 2 diabetes mellitus and obesity[J]. Chirurgia (Bucur), 2019, 114(6): 732-738.
[DOI]
|
| [17] |
GUILLEMOT-LEGRIS O, MUCCIOLI GG. Obesity-induced neuroinflammation: beyond the hypothalamus[J]. Trends Neurosci, 2017, 40(4): 237-253.
[DOI]
|