胶质瘤是最常见的颅内肿瘤，占颅内原发肿瘤的60%~80%^[1-2]，发病率高、容易复发且难以治愈^[3]。胶质瘤治疗以手术为主，辅以术后放化疗^[4]，故肿瘤的病理分类、分级对患者的个体化治疗和预后判断非常重要。病理诊断结果与免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)技术密不可分，但在实际工作中发现IHC结果的稳定性和准确性受到很多因素影响，如组织处理、染色方法、判读标准等^[5-6]。其中，组织固定是影响组织标本形态结构、细胞抗原保存及检测结果的重要因素。组织固定是固定液中甲醛的醛基与组织抗原决定簇的蛋白及侧链上的氨基起缩合反应，封闭细胞内抗原的活性，这是固定剂对抗原的交联封闭作用^[7]。目前，国内外关于人脑标本经不同固定时间处理后IHC结果的研究报道较少见，国外研究主要为动物脑组织^[8]和死亡后的人脑标本^[9]。本研究以胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)和增殖指数(proliferation index，Ki67)为目标抗原，对不同固定时间处理后的脑胶质瘤标本行IHC染色，探讨脑肿瘤标本固定时长对IHC结果的影响，确定使脑肿瘤标本IHC结果稳定准确的固定时长范围，从而为脑肿瘤IHC的质量控制提供参考依据。

资料和方法

病例资料  回顾性收集2018年1月至2019年12月上海市静安区中心医院71例脑胶质瘤标本，其中男性38例，女性33例，年龄15~78岁，平均年龄49岁。71例脑胶质瘤的病例中，低级别胶质瘤17例，其中节细胞胶质瘤(Ⅰ级)3例、毛细胞型星形细胞瘤(Ⅰ级)1例、CD34阳性的低级别胶质瘤(Ⅰ级)3例、星形细胞瘤(Ⅱ级)9例、少突星形细胞瘤(Ⅱ级)1例；高级别胶质瘤54例，其中间变性星形细胞瘤(Ⅲ级)17例、胶质母细胞瘤(Ⅳ级)37例。

纳入标准：(1)年龄 < 80岁；(2)一般情况良好；(3)原发性脑肿瘤；(4)影像学(MRI)资料显示肿瘤直径≥2 cm；(5)病理常规石蜡证实为胶质瘤。排除标准：(1)脑以外的胶质瘤；(2)合并严重的内科疾病；(3)合并其他恶性肿瘤；(4)术前接受过靶向、放射、化学药物、伽马刀等医学治疗方式。在神经外科医师的协助下，获得患者知情同意。

取材方法  将手术切除的标本立即固定于4%甲醛(本院中心实验室配置)中，送至病理科，即刻取材，每例标本取6块含肿瘤的组织，大小为1.0 cm×1.0 cm×0.2 cm，尽量附带周围脑组织，固定时间依次为4 h、24 h、48 h、96 h、7 d和14 d。

制片方法  固定后的标本经脱水、石蜡包埋和切片。切片分为常规HE切片和IHC防脱切片，厚度为3 μm。HE切片染色后确定为目标标本，再对IHC防脱切片进行GFAP、Ki67 IHC染色。用于IHC的切片在65 ℃烤箱中烤片过夜，采用SP法，由Dako Link48自动免疫组化机进行染色。染色所用的抗体均经过质量控制；标本在染色过程中设立阳性、阴性对照。GFAP阳性对照选择正常脑组织，阴性对照选择自淋巴组织；Ki67阳性对照选择自淋巴组织，阴性对照选择正常脑组织。二氨基联苯胺(DAB)显色，阳性细胞呈黄褐色，苏木精复染，背景阴性细胞呈蓝色。脱水、透明、封片后，Nikon光学显微镜不同倍数物镜下观察。固定液为4%甲醛，一抗选用长岛生物技术有限公司的工作液：鼠抗GFAP(克隆号：GA-5)、Ki67(克隆号：SP6)；二抗选用Dako公司自动免疫组化仪器的配套抗体。

结果判读依据  IHC阳性细胞按阳性程度不同呈现黄色、棕黄色、褐色。免疫标记物GFAP和Ki67的着色部位分别是细胞质和细胞核。

IHC染色结果分析参考Allred score标准^[10]，这一评分标准的优点在于最大程度去除主观判断误差：首先对阳性细胞数量与阳性强度分别评分，再将二者分值相加为Allred评分(0~8分)。细胞阳性表达强度：无着色、黄色、棕黄色和褐色分别设定为0、1、2和3分。GFAP阳性细胞数目：无、< 1%、1%~10%、11%~33%、34%~66%和67%~100%分别设定为0、1、2、3、4和5分；Ki67阳性细胞数目：无、< 1%、1%~4%、5%~10%、11%~20%和 > 20%分别设定为0、1、2、3、4和5分。将以上两项分数分别相加，结果0分为(-)，2~4分为弱阳(+)，5~6分为中阳(++)，7~8分为强阳(+++)，阳性结果(++)及以上作为GFAP、Ki67有效阳性表达。所有结果均采用人工计数，由两位资深的病理科医师在光镜下独立完成并记录，最后进行综合评估，分组计算有效阳性率(即有效阳性表达所占比例)。

统计学方法  研究结果采用SPSS 19.0软件进行数据处理，组间比较采用χ²检验或Fisher精确检验法，P < 0.05为差异有统计学意义。

结果

肉眼观察  71例标本均为灰白灰褐色，组织最大径2~9 cm，质地偏韧，其中3例有囊变，1例有沙砾感。

IHC镜检  脑胶质瘤标本经不同固定时间处理后，GFAP、Ki67的阳性表达情况见图 1~2。固定时间不同，GFAP、Ki67阳性染色有差异，直接影响病理诊断中阳性判读结果。

在4%甲醛固定液中固定4 h、24 h、48 h、96 h、7 d和14 d的脑胶质瘤标本，经过组织处理后，进行免疫标记物染色，GFAP有效阳性率分别为63.38%、97.18%、95.77%、92.95%、90.14%和77.46%，Ki67有效阳性率分别为87.32%、100%、100%、100%、98.59%和90.14%(表 1~2)。

GFAP、Ki67有效阳性结果统计分析

GFAP  脑胶质瘤标本固定4 h、24 h、48 h、96 h、7 d和14 d后，比较GFAP的有效阳性率，差异有统计学意义(χ²=51.802，P < 0.001)。两两组间比较发现，固定24 h、48 h、96 h和7 d的GFAP有效阳性率差异无统计学意义；固定24 h、48 h、96 h和7 d的GFAP有效阳性率显著高于固定4 h和14 d，组间差异有统计学意义(P < 0.05)，说明固定时间过短或太长都会影响GFAP染色结果(表 3)。

Ki67  脑胶质瘤标本固定4 h、24 h、48 h、96 h、7 d和14 d，比较Ki67的有效阳性率，差异有统计学意义(χ²=30.450，P < 0.001)。进一步进行两两组间比较发现，固定24 h、48 h、96 h和7 d，Ki67有效阳性率差异无统计学意义；固定24 h、48 h、96 h和7 d的Ki67有效阳性率高于固定4 h和14 d，组间差异有统计学意义(P < 0.05)，说明固定时间过短或太长都会影响Ki67染色结果(表 4)。

讨论

研究发现，组织标本在固定过程中，抗原活性与固定时间直接相关，固定时间过短会造成固定不均匀，固定液不能完全渗透到组织内部，部分抗原失活；固定时间过长会使组织变得脆硬，抗原减少或定位不准^{[7, 11]}。本研究中组织样本固定24 h、48 h、96和7 d后GFAP、Ki67的IHC染色结果较好，固定4 h的标本IHC染色阳性率明显低于固定24 h、48 h、96 h和7 d的标本，与何蕾蕾等^[11]在不同固定时间对乳腺浸润性癌ER、PR免疫组化染色影响的研究结果基本一致；固定24 h~14 d的标本IHC染色阳性结果呈下降趋势，与Aniol等^[8]延长鼠海马固定时间对PCNA和DCX免疫染色结果的影响相符，两种抗原在组织固定7 d或更长时间后免疫阳性下降。张共和等^[12]在神经元-nAchR免疫反应的研究中发现，固定时间过长直接影响免疫组化结果。不同器官组织在不同固定时长下的IHC染色结果有差异，乔秀玲等^[13]研究了不同固定液和不同固定时间对大肠癌淋巴结免疫组化染色的影响，指出淋巴结最佳免疫组化染色效果的固定时间为6~12 h，固定时间越长，免疫染色效果越差。Kai等^[14]发现不同固定时间处理的相同外科手术胃癌标本在7 d内Her-2和PD-L1表达无明显差异。因此认为，组织的固定时长对IHC染色结果有重要影响，不同组织器官最佳IHC染色效果的固定时长也不同。

本研究中，固定24 h、4 h、96 h和7 d的GFAP和Ki67的IHC染色结果优于固定4 h和14 d。固定4 h的GFAP和Ki67阳性率明显低于固定24 h、48 h、96 h和7 d，组间差异有统计学意义(P < 0.05)，说明新鲜标本的固定时间太短，肿瘤组织内部固定不充分，抗原活性减低，导致免疫标记物的阳性表达率下降。固定14 d的GFAP和Ki67阳性率低于固定24 h、48 h、96 h和7 d，组间差异有统计学意义(P < 0.05)，说明新鲜标本的固定时间过长，会导致组织内抗原活性减低，免疫标记物的阳性率下降。

本次研究的不足之处在于：(1)单中心实验，样本量较小，还需要更多样本量来验证；(2)在4 h和24 h之间以及14 d之后未设观察组，设立的组别越多，实验结果的准确性越高；(3)仅选择2种免疫标记物进行研究，今后的研究范围可扩大到更多肿瘤相关抗原，以了解不同抗原表达与固定时长的关系，更有利于辅助病理诊断。

综上所述，人脑胶质瘤标本的固定时间对GFAP和Ki67表达有影响，为脑肿瘤标本的IHC室内质量控制提供了参考。在病理工作中要控制好标本的固定时间，避免固定不足或过度，从而提高免疫组化染色质量，得出准确可靠的判读结果，以辅助病理诊断。

作者贡献声明  韩春  病例收集，切片判读，论文构思、撰写和修订。唐峰  论文设计和指导，切片判读，结果分析。项耀钧  论文指导和修订。

利益冲突声明  所有作者均声明不存在利益冲突。