2021, Vol. 48
2. 复旦大学公共卫生学院闵行分院 上海 201101;
3. 上海市疾病预防控制中心微生物实验室 上海 200336
2. Minhang Branch, School of Public Health, Fudan University, Shanghai 201101, China;
3. Department of Microbiology, Shanghai Municipal Centre for Disease Control and Prevention, Shanghai 200336, China
菌落是单个菌体或孢子在一定的固体培养基上生长繁殖后形成的肉眼可见的微生物聚集体，菌落形态（大小、形状、边缘、颜色等）是辨认和鉴定菌种的重要标志。研究表明菌落特征与细菌表型和分子特征相关[1-2]，基因水平的变化会导致菌落形态的改变[2-4]，同一种属的病原菌基因型不同，菌落形态往往也不同，区别菌落形态有助于快速鉴别细菌种属，甚至辅助鉴别基因型。
化脓性链球菌属A群β溶血链球菌，能引起猩红热、丹毒、新生儿败血症、脑膜炎、产褥热以及链球菌变态反应性疾病等。菌落形态是实验室初步判断化脓性链球菌的重要依据，化脓性链球菌在37 ℃培养18~24 h后，在血琼脂平板上一般形成直径约0.5 mm、圆形凸起、边缘整齐、表面光滑或略粗糙、半透明或透明、β溶血的灰白色菌落[5]。表型由基因型决定，研究表明一些细菌基因的变化会导致同一种属细菌的菌落形态变化[6-7]。目前微生物实验室对菌落的观察多停留在传统的认知阶段，未能更进一步区分菌落形态的细微差异，我们在对化脓性链球菌分离培养鉴定的过程中发现不同emm基因型分离株的菌落形态存在明显差异，各亚菌落特点具有emm基因型特异性，总结如下。
资料和方法菌株来源 来源于上海市闵行区疾病预防控制中心微生物实验室2019年1—12月自上海市闵行区猩红热监测点儿童咽拭子标本中分离培养的化脓性链球菌菌株。
菌落形态观察 菌株划线接种于含5%无菌脱纤维羊血的琼脂平板（上海科玛嘉微生物技术有限公司），37 ℃培养18~24 h，观察并记录菌落形态（形状，大小，溶血等）。
生化确认实验 用化脓性链球菌的纯培养物配置0.5麦氏浓度菌悬液，加入Vietek GP生化鉴定卡（生物梅里埃）进行生化鉴定，ID%为99%鉴定为化脓性链球菌。
emm基因测序及分型 emm基因扩增、测序和比对按照美国CDC网站化脓性链球菌测序方案进行（https://www.cdc.gov/streplab/groupa-strep/emm-typing-protocol.html）。以DNA为模板，用通用引物PCR扩增，上游引物：5′-TATT（C/G）GC-TTAGAAAATTAA-3′，下游引物：5′-GCAAGTT-CTTCAGCTTGTTT-3′。反应体系为qPCR Mix 15 μL，Mg2+（25 mmol/L）上下游引物各0.5 μL，DNA模板2 μL，补充ddH2O至30 μL。PCR扩增程序：94 ℃ 1 min；94 ℃ 15 s×15；47 ℃ 30 s×15；72 ℃延伸1 min 15 s×15；94 ℃ 15 s×15；47 ℃ 30 s×15；72 ℃延伸1 min 15 s，每个循环递增10 s×15；72 ℃延伸7 min；4 ℃保持。委托上海生物人技术有限公司完成PCR扩增产物纯化及测序。测序序列提交至数据库比对（https://www2a.cdc.gov/ncidod/biotech/strepblast.asp），序列同源性99%判为同一emm基因型。
结果菌落形态 179株化脓性链球菌在血平板上菌落大小、表面特征和溶血情况存在肉眼可见的差别，据此分为A、B、C、D 4种菌落形态（图 1）。A：灰白色，约0.5 mm，表面光滑或粗糙，β溶血；B：灰白色，约1 mm，比A菌落大，表面光滑，β溶血；C：3~4 mm，为所有菌落里最大的，黏液型（这是明显不同于其他3种菌落的特点），β溶血；D：约0.5 mm，表面光滑或粗糙，溶血现象不同于其他3种菌落，介于α溶血和β溶血之间。
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| A: emm12 type and subtypes; B: emm1 type and subtypes; C: emm3 type; D: emm4 type. 图 1 化脓性链球菌的4种菌落形态图谱 Fig 1 Distinctive colony morphology categorized by emm genotypes of S. pyogenes |
菌落形态与emm基因型的关系 不同emm基因型的菌落特征明显不同，同一基因型亚型的菌落特征相同。4种基因型的菌株有与之对应的4种不同的菌落形态（图 1），分别称之为emm12，emm1，emm3和emm4型菌落（表 1）。
| Category | Size（mm） | S/R | Hemolytic | emm genotypes |
| Colony A | 0.5 | Smooth /Rough | β | emm12.0（97），emm12.19（15），emm12.21（n=1），emm12.37（1），emm12.40（2），emm12.66（1），emm12.67（2），emm12.68（1），emm12.69（4） |
| Colony B | 1 | Smooth | β | emm1.0（49），emm1.25（2），emm1.75（1） |
| Colony C | 3-4 | Mucoid | β | emm3.0（1） |
| Colony D | 0.5 | Smooth | NA | emm4.0（2） |
表型由基因型决定，表型差异源于基因水平的差异，菌落形态的不同也有其分子生物学基础。化脓性链球菌emm基因编码膜表面M蛋白，不同emm基因5’端的高变区碱基组成不同，根据这一结构特点把化脓性链球菌分成不同的emm基因型，也造成了菌落形态的不同。
化脓性链球菌流行emm基因型存在国家/地区差异[8-12]。本研究中化脓性链球菌emm基因型和国内外其他学者的研究结果相符[13-16]，主要为emm12型和emm1型（80%~97%），因此就我国大部分地区而言，化脓性链球菌的菌落形态也以这两种常见。这两个基因型的菌落形态的明显区别在于菌落大小，emm1型（包含3种亚型）菌落较大，约为emm12型（包含9种亚型）菌落的2倍大小，虽然两种菌落只有0.5 mm的差异，但在血平板上肉眼非常容易观察出差别，emm1型菌落溶血环比emm12型菌落大，因此可以凭借菌落大小区别这两种常见的emm基因型菌株。除此之外，emm1型均为光滑型，而emm12型有光滑型和粗糙型两种。
与emm12和emm1不同，emm3和emm4型在我国少见报道。和其他emm基因型菌落不同，emm3型菌落属于黏液型菌落，半透明水滴状，且菌落是所有化脓性链球菌中最大的，约是其他的3倍以上，容易辨别，与Tamayo等[17]对130株emm3型黏液型菌落的描述相符。黏液型化脓性链球菌的这一特征具有时效性，Crater等[18]研究表明其在对数生长初期菌落特征最明显，到生长平台期这一特征容易消失。我们在研究中也发现这种菌落在培养16~18 h黏液型最明显，超过24 h则不明显。因此我们在化脓性链球菌分离培养18 h时观察一次。emm3型菌落属于黏液型，但并不是所有黏液型都是emm3型，个别黏液型化脓性链球菌属于emm6型[19]。emm3型是欧洲某些国家比较常见的基因型[10]，我国少见报道，也有可能是因为该菌菌落形态比较特殊，不符合典型的化脓性链球菌的菌落形态特征，在实验室检测中易被忽略。
emm4型菌落不同于其他化脓性链球菌的特征是溶血环，介于α溶血和β溶血之间。emm4型菌落的溶血特征可能是由于emm4型菌株编码溶血素的基因发生改变所致。本研究只分离到2株emm4型化脓性链球菌，国内也鲜有报道emm4型分离株，部分原因可能是其非典型的菌落特点导致漏检。韩国学者曾报道2017年韩国emm4型化脓性链球菌突然增多[20]，在化脓性链球菌的鉴定过程中应注意观察具有该特征的菌落，防止emm4型菌落漏检。
菌落形态是细菌鉴定过程中最早观察到的特征，根据特有的菌落特征可以初步鉴别种属。随着分子生物学技术的发展和认知水平的提高，可以进一步细分同一种属细菌不同基因型的菌落特点。本研究中检测出4种emm基因型，菌落特点各有不同。由于我国目前常见的化脓性链球菌基因型为emm12和emm1型[13-14]，因此我们在初步鉴别化脓性链球菌时，可根据两种基因型不同的菌落特点早期辨别emm12和emm1型。
综上所述，化脓性链球菌菌落有明显的emm基因型特异性，不同emm基因型菌落形态不同，同一基因型的各亚型菌落特征相同，可根据菌落形态的基因型特异性辅助早期辨别化脓性链球菌的emm基因型。
作者贡献声明 欧阳霖 emm基因测序，论文撰写。王小光，宋驰萍，张颖华 菌株分离培养。陈明亮，张颖华 研究设计，论文撰写。
利益冲突声明 所有作者均声明不存在利益冲突。
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