Ⅰ期临床试验是药物有效性和安全性评价的重要环节，采集自受试者的生物样本是后续检测分析的基础，因生物样本是有限而宝贵的样本资源，所以对生物样本进行有效管理是临床试验质量控制的重要环节^[1-2]。然而在生物样本采集的过程中，难免出现标识信息不清楚或者标签脱落的情况，时常因无法识别生物样本的个体来源而将其销毁处理，这不仅造成了资源的浪费，而且试验数据的缺失在一定程度上导致了临床试验结果的偏倚^[3-5]。我院开展的一项Ⅰ期临床试验中，研究护师在采集10号和22号受试者血液样本时（10号受试者为女性，22号受试者为男性），因采血管负压出现问题而紧急更换了两支空白标签的备用采血管，导致血液样本送到实验室后，实验室工作人员无法判定这两个样本来自哪个个体。研究报道Y染色体短串联重复序列（Y-chromosomal short tandem repeat，Y-STR）是位于男性Y染色体上的人类多态性短串联重复序列（short tandem repeats，STR）位点，一般情况下，只有男性个体才有Y染色体，因此，Y-STR具有男性遗传、男性特异性的特点，Y-STR可作为性别鉴定的依据，在标准常染色体DNA谱分析不能提供信息的情况下常被法医用于DNA分析^[6]，如在调查性侵案件的司法取证和父系谱系分化中非常有用^[7]。但是，至今国内外未有将Y-STR检测运用于Ⅰ期临床试验的研究报导。为了保证临床试验数据的完整性，本文首次创新性地将Y-STR检测方法运用于Ⅰ期临床试验中，以探讨该方法在Ⅰ期临床试验生物样本来源识别中的应用。

资料和方法

样本来源   某生物等效性实验空腹试验部分第一周期第13个采血点因标签标识不清而无法辨别的10号和22号受试者全血样本（6 mL EDTA抗凝采血管）2管，实验时分别编号为：A和B。已知男性全血样本1管，作为阳性对照，编号为P。已知女性全血样本1管，作为阴性对照，编号为N。

仪器与试剂   血基因组DNA小量试剂盒和D15000 Marker（美国Axygen公司），Trans2K Plus DNA Marker（北京全式金生物技术有限公司），琼脂糖和6×加样缓冲液（美国Genview公司），2×PCR buffer Mix、Ex Taq HS和ddH₂O（日本TaKaRa公司），电泳仪（美国Bio-Rad公司），低温离心机（美国Thermo Fisher Scientific公司），PCR扩增仪（德国Eppendorf公司），紫外凝胶成像仪（北京天根生化科技有限公司）。引物合成由美国Invitrogen公司完成。

DNA抽提   将P、N、A和B 4支采血管放于低温离心机中，4 ℃、1 200×g离心10 min，分别分离血浆和血细胞沉淀，留作备用，离心操作在采血后2 h内完成。按照血基因组DNA小量试剂盒说明书分别提取200 μL血浆和200 μL血细胞沉淀中的DNA。

基因座选择和引物设计   根据Y-STR基因座DYS460^[8]的序列特征，设定所选目标基因座的片段大小，用Primer 5.0软件分别设计正反引物序列（表 1）。DYS513^[9]和DYS570^[10]的引物序列来源于参考文献（表 1）。

PCR扩增基因片段   将引物稀释成浓度10 mol/L，每对正反引物各取10 μL混合，形成PCR引物混合液。DNA模板分别吸取A和B的血浆和血细胞样本中提取的DNA。制备25 μL的PCR反应液为：12.5 μL 2×PCR buffer Mix、2 μL Ex Taq HS、6 μL ddH₂O、2 μL PCR引物混合液和2.5 μL DNA模板，将PCR反应液放于PCR扩增仪中扩增（反应条件见表 2）。

DNA检测   各取5 μL DNA模板，加入1 μL 6×加样缓冲液混匀。制备1%琼脂糖凝胶，将混合液加入凝胶孔中，D15000 Marker作为参照，于120 V电压下电泳15 min。电泳结束后，于紫外凝胶成像仪中拍照观察。

PCR产物检测   各取5 μL PCR产物模板，加入1 μL 6×加样缓冲液混匀。制备2%琼脂糖凝胶，将混合液加入凝胶孔中，Trans2K Plus DNA Marker作为参照，于120 V电压下电泳20 min。电泳结束后，于紫外凝胶成像仪中拍照观察。

结果

P、N、A和B的血细胞中均抽提到DNA   P和N样本的血细胞DNA、A和B样本的血浆和血细胞DNA分别用1%琼脂糖凝胶电泳分离，结果如图 1所示。A和B血浆DNA样本均无主条带，而P、N、A和B血细胞样本有清晰的DNA主条带，表明A和B的血浆中DNA含量可能非常少而无法用琼脂糖凝胶电泳分离出，而P、N、A和B的血细胞中均成功抽提到了DNA。

A样本的血细胞DNA均扩增出3个Y-STR基因座   P和N样本的血细胞DNA、A和B样本的血浆和血细胞DNA均分别用3个Y-STR基因座（DYS460、DYS513和DYS570）的引物进行扩增，产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离。结果如图 2所示，作为阴性对照的N样本血细胞DNA以及B样本的血细胞DNA和血浆DNA都无法扩增出Y-STR基因座条带，而作为阳性对照的P样本血细胞DNA以及A的血细胞DNA样本中均扩增出3个Y-STR基因座，且产物条带大小与理论值（表 1）相符，说明A样本为20号男性受试者的样本，B样本为10号女性受试者的样本。因A样本的血浆几乎不含Y染色体DNA，因此也无法扩增出产物。

讨论

Ⅰ期临床试验常涉及密集采血，血液采集数量多、时间短、要求高，涉及环节也比较多，加上操作人员的熟练程度、受试者的静脉条件、采血管压力等原因，会出现临床样本标识不清、标签脱落等情况，导致无法辨别样本来自哪个个体。

自2015年7月原国家食品药品监督管理总局发布《关于开展药物临床试验数据自查核查工作的公告（2015年第117号）》以后，药物临床试验数据完整性问题越来越受到重视，临床试验质量的控制措施进一步被细化^[11-12]。因此，建立鉴定混淆生物样本的应急管理措施，能够为后续生物样本的检测和数据的完整性提供样本基础，从而保障临床试验的质量。

本文以血细胞DNA为模板，选取Y染色体的3个基因座（DYS460、DYS513和DYS570），成功鉴别出2个不同性别受试者的血液样本。针对不同性别受试者的血液样本混淆的情况，此方法可以作为生物样本质量控制中的一种应急措施，建议将其纳入生物样本质量控制的标准操作程序中。然而，本文探讨的案例限于两位异性受试者样本的鉴别，至于多位男性受试者的样本的鉴别方法，因Y-STR的基因多样性和单倍型多样性^[13-14]，以及Y-STR基因座存在突变的可能^[15-16]，建议可以利用个人前后采血点的样本进行Y-STR的检测和比对分析，但是其中涉及的相关伦理问题还需要进一步研究决定。为了尽可能避免样本标识数据缺失的情况，除了在样本采集前对物品进行充分准备外，也应对研究护师加强培训，如可以配备一名机动护师在旁边，帮助采血护师及时补上样本标识信息。此外，本文提倡的应急措施还需进一步建立统一的操作标准，有待在后续研究中进行完善。

作者贡献声明  曾丽艳  论文构思，实验执行，数据采集，统计分析，论文撰写和修订。王倩  数据分析、论文撰写和修订。柯晶  文献调研和整理。董华娟   论文修订。孟现民  研究指导，论文修订。

利益冲突声明  所有作者均声明不存在利益冲突。