2020, Vol. 47
肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）是肝脏的一种非实质细胞，在肝纤维化发生中起到关键作用。原代分离的HSC在体外的培养和传代时间有限，传代一定次数后就会进入衰老期而不能再继续增殖。而反复分离原代细胞不仅费时、费力，且各批次细胞间存在差异，不能保持细胞生理指标的稳定性。体外能无限培养的永生化HSC的建立可为科学研究提供稳定、充足的细胞材料。建立和改良人HSC的分离培养方法及获得永生化人HSC株对于肝纤维化发生机制、诊断及治疗研究具有重要意义。
已有通过脂质体介导猿猴病毒40（simian virus 40，SV40）大肿瘤抗原（large tumor antigen，TAg）基因的真核表达质粒转染获得永生化人HSC（LX1及LX2）的报道[1]。既往研究中，我们采用改良酶液灌注消化及密度梯度离心两步法从1例中国儿童肝肿瘤手术患者的肝脏标本中分离HSC[2]，液氮冻存原代细胞。本研究通过构建慢病毒SV40 TAg表达质粒，介导SV40 TAg转染该原代HSC，获得永生化人HSC株（命名为WM07），可稳定传代并用于肝纤维化研究。
材料和方法构建SV-40 TAg慢病毒表达载体
PCR获取全长SV40 TAg序列 以含SV40 TAg cDNA序列的SV40 tsA58质粒[3-5]为模板，根据NCBI的SV40 TAg完整基因参考序列（NC_001669.1）设计特定的质粒构建引物。SV40 TAg-CF：5’-CACCATGGATAAAGTTTTAAACAG-AGAG-3’；SV40 TAg-CR：5’-TTATGTTTCA-GGTTCAGGGGGA-3’。
高保真PCR获取SV40 TAg全长cDNA PCR反应体系（50 µL）：引物混合液1.5 µL，10×Pfu DNA聚合酶反应混合物（含dNTP）5 µL，Pfu DNA聚合酶0.5 µL，模板DNA质粒1 µL，用灭菌去离子水补齐到50 µL。PCR反应条件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，68 ℃ 4 min，36个循环；68 ℃ 5 min；恢复至4 ℃。
PCR产物纯化 PCR产物进行1%低熔点琼脂糖凝胶电泳，切割回收SV40 TAg全长cDNA PCR条带，pureLinkR QuickGel（美国Invitrogen公司）提取纯化PCR产物，测定并调整为10 ng/µL浓度。
PCR产物TOPO克隆进入pENTRTM TOPOⓇ载体 纯化的SV40 TAg PCR产物4 µL，盐溶液1 µL，pENTRTMTOPOⓇ载体（美国Invitrogen公司）1µL，总体积6 µL，室温轻柔混匀，室温放置30 min，置于冰上。
转化和Entrez克隆筛选 TOPOⓇ克隆反应产物2 µL转化感受态大肠埃希菌（E.coli），接种于卡那霉素LB琼脂板，37 ℃培养过夜，挑选5个生长菌落扩增和提取质粒，以M13正向和逆向引物进行PCR测序（韩国Macrogen公司），鉴定克隆的SV40 TAg cDNA序列，获得pENTR-SV40 TAg Entrez质粒。
LR重组反应 1.5 mL离心管中加入7 µL上述克隆表达质粒pENTR-SV40 TAg（150 ng）、1 µL目标慢病毒载体pLenti4/V5-DEST（美国Invitrogen公司）、8 µL TE缓冲液、2 µL LR ClonaseTM Ⅱ enzyme mix，混匀，25 ℃孵育1 h，加入1 µL蛋白酶K溶液终止反应，混匀后37 ℃孵育10 min。
将SV40 TAg cDNA克隆到目标慢病毒载体 转化1 µL LR反应液与50 µL Stbl3TM感受态细胞，冰上孵育30 min，42 ℃热休克30 s，加入250 µL SOC培养液，37 ℃振摇培养1 h，分别将20 µL和100 μL转化液铺于氨苄青霉素LB（LBA）琼脂板。37 ℃培养过夜，挑选5个生长菌落扩增和提取质粒。以CMV正向和逆向引物进行PCR测序（韩国Macrogen公司），鉴定克隆的SV40 TAg cDNA序列，构建SV40 TAg慢病毒表达载体pLenti4/V5-GW/SV40 TAg。
慢病毒包装 采用脂质体LipofectamineTM3000介导pLenti4/V5-GW/SV40 TAg慢病毒质粒（假病毒）和包装质粒pCMV-VSV-G及psPAX2（2:1.5:1）转染工程细胞293FT，进行假病毒包装，24、48、72 h分别收集含包装病毒的培养上清液，离心，冻存备用。
HSC分离和原代培养 复旦大学附属中山医院外科手术切除人肝脏肿瘤标本，无菌操作切取病灶周围相对正常的一小块肝组织，按5 mL/g用EGTA液（含肝素20 U/mL）沿血管残端反复灌注冲洗残余血液，至肝组织呈灰黄色。采用改良酶液灌注消化及Nycodenz密度梯度离心两步法获得原代HSC[2]。采用常规台盼蓝拒染法鉴定细胞活力。采用自发蓝绿色荧光、油红O脂滴染色、α-平滑肌肌动蛋白（α-smα-SMA）、免疫荧光染色等方法鉴定细胞纯度[2]，每3天换液1次，原代冻存。
永生化HSC株WM07的建立
SV40 TAg转染原代培养细胞并筛选转染细胞 以含SV40 TAg的慢病毒培养上清液加入细胞培养液中转染原代（复苏第2代）培养细胞，48 h后换用含50 µg/mL博来霉素（zeocin）的10%胎牛血清的DMEM培养液筛选转染和稳定表达SV40 TAg的原代细胞，每3天换液1次，2~4周后可筛选出存活细胞克隆，扩增成株。细胞株至少能稳定传十代。
SV40 TAg表达的检测 一抗采用抗SV40 TAg抗体（1:200，美国Santa Cruz公司，sc-148），用Alexa Fluor 594（红色）标记的二抗进行免疫荧光染色，检测SV40 TAg，可作为SV40 TAg转染获得永生化细胞的标志。
α-SMA的检测 一抗采用抗α-SMA（1:500，英国Abcam公司，ab5694），用Alexa Fluor 488（绿色）标记的二抗进行免疫荧光染色检测α-SMA，作为活化HSC的标志。
结果SV40 TAg全长cDNA的鉴定 高保真PCR获取的SV40 TAg全长cDNA经琼脂糖凝胶电泳鉴定，PCR条带大小符合全长SV40 TAg cDNA片段大小（2 477 bp，图 1）。
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| 图 1 高保真PCR获取SV40 TAg全长cDNA的琼脂糖凝胶电泳图 Fig 1 Agarose gel electrophoresis map showing a single band of high-fidelity PCR product of SV40 TAg full-length cDNA fragment |
pENTR-SV40 TAg Entrez质粒的鉴定 通过M13正向引物对pENTR-SV40 TAg Entrez质粒进行PCR测序，结果验证所构建的pENTR-SV40 TAg Entrez质粒含CACC克隆位点（122~125）、ATG转录起始位点（126~128）及SV40 TAg cDNA序列（图 2）。
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| The sequence of CACC clone site (122-125), ATG transcription start site (126-128) and SV40 TAg cDNA. 图 2 M13正向引物对pENTR-SV40 TAg Entrez质粒进行PCR测序的结果 Fig 2 The PCR sequencing result of pENTR-SV40 TAg Entrez plasmid by M13 forward primer |
慢病毒表达质粒pLenti4/V5-GW/SV40 TAg的鉴定 通过CMV正向引物对pLenti4/V5-GW/SV40 TAg慢病毒表达质粒进行PCR测序，结果验证所构建的质粒含ATG转录起始位点（151~153）及SV40 TAg cDNA序列（图 3）。
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| ATG transcription start site (151-153) and SV40 TAg cDNA sequence. 图 3 CMV正向引物对pLenti4/V5-GW/SV40 TAg慢病毒表达质粒进行PCR测序结果 Fig 3 PCR sequencing result of the expression plasmid of pLenti4/v5-GW/SV40 TAg lentivirus with CMV forward primer |
永生化HSC株WM07表达SV40 Tag 对经慢病毒介导SV40 TAg转染、博来霉素筛选获得的永生化肝星状细胞株WM07进行SV40 TAg的免疫荧光染色，结果显示WM07表达SV40 TAg，并在细胞核表达和定位（图 4）。
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| A:Immunofluorescence staining of SV40 TAg; B:Nuclear staining of DAPI; C: Colocalization of SV40 TAg (red) and DAPI (blue) staining in the nuclei of transfected cells (purple). 图 4 免疫荧光染色永生化HSC株WM07的SV40 TAg表达（×100） Fig 4 Immunofluorescence staining of SV40 TAg expression in theimmortalized HSC line WM07 (×100) |
永生化HSC株WM07表达活化HSC标志物 免疫荧光染色鉴定显示，WM07细胞质内均表达活化HSC的特异性标志α-SMA（图 5）。
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| Green:Cytoplasma positive staining of α-SMA; Blue:Nuclear staining of DAPI. 图 5 免疫荧光染色永生化人HSC株WM07的α-SMA的表达（×20） Fig 5 Immunofluorescence staining of α-SMA expression in immortalized human HSC line WM07 (×20) |
一些抑癌基因p53和pRB的失活以及端粒酶的激活，是人体细胞获得永生化的必要条件。哺乳动物细胞使用几种方法诱导细胞永生化，包括使用SV40 TAg基因、人类端粒酶逆转录酶基因、P53和pRB的小发卡或短发卡RNA（shRNA）等。SV40 TAg是由SV40病毒早期编码区编码的一种多功能磷酸蛋白，在病毒复制过程中发挥重要作用。SV40 TAg具有活化宿主细胞核糖体基因、诱导DNA合成、修饰蛋白质合成起始因子等作用，并且能结合、调控某些关键性的细胞调控蛋白，如视网膜母细胞瘤蛋白家族成员（如pRB）、肿瘤抑制因子P53等，并可诱导感染细胞的端粒酶活性，诱导多种细胞的永生化。SV40 TAg基因与宿主细胞DNA稳定整合重组后，不但能在细胞内表达SV40 TAg，加快转化细胞的生长速率，同时也能保留原始细胞的许多分化表型，具有相对稳定的增殖特性和功能状态，而在转化细胞系中非原始基因的表达很少见。
目前已有一些方法用于介导SV40 TAg转染，如通过脂质体介导构建有SV40 TAg基因的真核表达质粒载体，转染目标原代细胞，并筛选获得永生化细胞系的方法，但其转染效率较低，筛选困难，一些较难转染的细胞难以获得稳定表达和建立细胞系。慢病毒是逆转录病毒的一种，能够将靶基因导入一些较难转染的细胞内，可以有效感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，并且将靶基因随机整合到宿主HSC基因组中，从而大大增加了感染效率，并且能够在细胞系中稳定表达若干代，可以进行稳转细胞株的筛选。慢病毒已广泛用于基因功能研究、RNA干扰、小分子RNA研究及活体动物实验中，成为基因治疗的有力工具之一。既往研究中，我们采用慢病毒载体构建和转染方法成功进行了Toll样受体4及DDX5单核苷酸基因多态性的表达和功能探讨[7-8]。本研究构建一种能够高效、快速转染SV40 TAg慢病毒的表达载体，该载体通过工程细胞包装可获得表达SV40 TAg的慢病毒颗粒（假病毒）用于转染原代人HSC，进而通过博来霉素抗性特点筛选获得永生化细胞株。提供一种构建永生化细胞株的方法，并获得一株永生化HSC株WM07，可稳定传代，并可用于肝纤维化研究，具有重要的应用价值。
致谢 美国纽约西奈山肝病中心Scott L.Friedman教授给予指导和帮助。
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