2020, Vol. 47
赖氨酸乙酰化修饰是一种保守的、可逆的蛋白质翻译后修饰，参与调控许多细胞信号通路和疾病发病过程。乙酰化修饰通过改变赖氨酸残基上的电荷导致蛋白质构象变化，进而影响酶活、定位、DNA结合力和蛋白质稳定性[1-2]。蛋白质的赖氨酸乙酰化由赖氨酸乙酰基转移酶（lysine acetyltransferases，KATs）和赖氨酸去乙酰化酶（lysine deacetylases，KDACs）调控。Sirtuins家族是第Ⅲ类KDACs，它们的去乙酰化活性依赖于NAD+（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）。SIRT2作为Sirtuins家族的成员之一，参与多种病理生理的发展过程，包括衰老[3]、能量限制[4-5]、细胞凋亡[6]和炎症反应[7]等。研究显示SIRT2与心血管疾病的发病机制密切相关[8]。
氨酰tRNA合成酶（aminoacyl tRNA synthetase，AARS）是一个与蛋白质翻译紧密相关的古老的蛋白质家族，由20种酶组成。这些酶通过识别对应氨基酸，使其与消耗ATP的特定tRNA连接起来，合成氨酰-tRNA，进而为最终蛋白质合成提供底物。且作为管家蛋白质，AARS在漫长的进化过程中相当保守。近年来研究揭示了AARSs在调控细胞生理活动时的新功能。例如，酪氨酰tRNA合成酶可以作为白藜芦醇的靶点，在应激条件下，由细胞质转移至细胞核，影响DNA损伤修复[9-10]；谷氨酰胺tRNA合成酶可以同凋亡信号调节激酶ASK1相互作用，进而对细胞凋亡产生影响[11]。在斑马鱼的遗传学研究中发现，丝氨酰tRNA合成酶（seryl-tRNA synthetase，SerRS）可以通过调控血管生成中的关键调节因子——血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）的表达，进而在封闭血液循环系统的发育中发挥重要作用[12-14]。
研究表明，SerRS可与SIRT2相互作用，招募SIRT2入核，且SerRS与SIRT2的相互作用会增强SIRT2的去乙酰化活性[15]。但是，SerRS与SIRT2作用的具体机制仍不清楚。本研究验证了SerRS能够与SIRT2相互作用，并且增强其作用于底物α-微管蛋白（α-tubulin）的去乙酰化酶活性。通过对SIRT2的H187位点的探究，检测其对SIRT2与SerRS结合的调控作用，同时通过结构模拟进行分析，为靶向SIRT2的H187位点治疗心血管疾病提供了新的方向和思路。
材料和方法材料和试剂 HEK293T细胞来自本实验室，DMEM高糖培养基购自美国HyClone公司，Seryl-tRNA synthetase、SIRT2和HA抗体购自英国Abcam公司，α-微管蛋白及其K40Ac抗体分别购自美国Invitrogen公司和美国Proteintech公司，FLAG和MYC抗体则分别购于美国Sigma公司和美国Cell Signaling Technology公司，Flag磁珠购自德国Sigma Aldrich公司。KOD-plus定点突变试剂盒购自日本东洋纺公司，烟酰胺购自美国Sigma公司，BL21感受态菌株购自上海擎科生物技术有限公司，质粒小抽试剂盒购自天根生物科技公司。
细胞转染 HEK293T细胞转染主要采用PEI试剂（以10 cm培养皿为例）。在添加10%胎牛血清的DMEM培养基中培养HEK293T细胞，当细胞密度达到60%~70%时，即可进行转染。将1 mL DMEM培养基、5 μg目的质粒及15 μL PEI试剂依次加入1.5 mL EP管中，反复吹打混匀，室温静置20 min。将EP管内的混合液加入细胞培养基，摇匀，放入37 ℃恒温细胞培养箱中培养，6 h后更换培养基，24~36 h后回收细胞。
免疫共沉淀 以10 cm培养皿为例，除去细胞培养基，用4 ℃ PBS溶液洗涤3次，加入预冷的1 mL裂解液（提前加入蛋白酶抑制剂），将培养皿置于4 ℃水平摇床上，快速裂解20 min。结束后充分吹打，将裂解液收集到1.5 mL EP管中，4 ℃下12 000 ×g离心30 min。取上清，转移到新的EP管中。取64 μL上清，加入16 μL 5×SDS上样缓冲液，95 ℃加热15 min，用作细胞裂解样品（Input）。剩余上清中加入10 μL Flag磁珠，4 ℃旋转3 h或过夜。4 ℃下2 000×g离心2 min，去上清。加入1 mL裂解液，混匀，4 ℃下2 000×g离心2 min，重复3次。加入70 μL 1×SDS上样缓冲液，95 ℃加热15 min，行Western blot检测。
Western blot检测 向电解槽中加入适量电泳缓冲液后上样，80 V恒压跑30 min，电压调至130 V跑1~1.5 h，样品前沿跑至最底端即可转膜，300 mA恒流湿转60 min。用5% BSA溶液（M/V）室温封闭1 h。一抗孵育，4 ℃摇床过夜或室温摇床1 h。1×TBST溶液洗膜5 min，重复3次。加入HRP标记的抗小鼠或抗兔的二抗，室温孵育1 h。1×TBST溶液洗膜3次，进行显影记录。
蛋白质纯化 将目的片段克隆重组到pET28a-his载体上，用重组质粒转化E.coli BL21。挑取成功表达质粒的单菌落到含有3~5 mL LB（含抗生素）的摇菌管中，37 ℃下培养至菌液浑浊，转移到含有1 L LB（含抗生素）的锥形瓶中进行扩增，37 ℃下培养至D600为0.6~0.8，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG进行诱导，16 ℃下继续培养20 h。4 ℃下5 000×g离心20 min，收集沉淀细菌。
用缓冲液[200 mmol/L Tris-HCl (pH=8.0)+500 mmol/L NaCl+25 mmol/L咪唑]重悬菌液，在4 ℃下使用流动泵将有His标签的蛋白挂到提前平衡好的1 mL镍柱上，用AKTA将镍柱上的蛋白洗脱下来。浓缩分装，液氮速冻，-80 ℃保存备用。
SIRT2酶活检测 酶活反应液配方为50 mmol/L Tris-HCl (pH=9.0)、4 mmol/L MgCl2、0.5 mmol/L DTT、1 μmol/L MAL[Boc-Lys (AC) amc]和1 mmol/L NAD+。将纯化的野生型SIRT2与SerRS按照一定的摩尔浓度比加入上述反应液中，以MAL[Boc-Lys (AC) amc]为底物在37 ℃下进行反应。设置0、1、2、3 h的反应时间梯度，加入与反应体系体积相同的停止液（含0.05 g/mL胰蛋白酶）停止反应，并按照指示测量荧光强度（F360/F460）[16]。
结果SIRT2与SerRS在细胞内的相互作用 我们通过免疫共沉淀实验来验证SIRT2与SerRS在细胞内的相互作用。因为SIRT1定位于核内，且被证明可以促进血管生成[17]，所以我们同时验证了SIRT1是否可以在细胞内与SerRS结合。首先在pCDNA3.1b(-)载体上构建带有Flag标签的SerRS表达质粒，同时构建带有HA标签的SIRT1、SIRT2重组质粒，将SIRT1、SIRT2分别与SerRS共转染至HEK293T细胞中进行过表达。转染48 h后，收集细胞裂解液，使用Flag M2磁珠进行免疫共沉淀。Western blot结果显示，外源Flag-SerRS和SIRT2-HA存在明显的相互作用，但没有检测到与SIRT1-HA的相互作用（图 1A）。通过半内源的方法在细胞内过表达lag-SIRT1与lag-SIRT2，免疫共沉之后检测内源的SerRS，结果与之前相同（图 1B）。
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| A:Flag-SerRS interacted with SIRT2-HA; B:Flag-SIRT2 interacted with endogenous SerRS; C:SIRT2-HA specifically interacted with Flag-SerRS, but without Flag-TyrRS.293T cells were transfected with indicated plasmids, and were harvested and immunoprecipitated with anti-Flag M2 beads (A, B, C). 图 1 SIRT2和SerRS的相互作用 Fig 1 SIRT2 interacted with SerRS |
有研究报道定位于胞质的TyrRS在一定条件下可入核与SIRT1发生结合[18]。我们在293T细胞中同时过表达外源的SIRT2-HA和Flag-TyrRS，并没有发现两者的相互作用（图 1C）。证明并不是所有细胞质内的SerRS都能与SIRT2结合。
SerRS可增强SIRT2的去乙酰化酶活性 为了验证SerRS与SIRT2的相互作用对SIRT2酶活性的影响，我们使用MAL[Boc-Lys (AC) amc]作为底物来进行去乙酰化酶活性检测。MAL的N-端与C-端分别与荧光基团和淬灭基团偶联，去乙酰化酶反应前不能发出荧光。一旦SIRT2进行去乙酰化反应，淬灭基团与MAL分离，即可发出荧光，去乙酰化酶的活性可通过测量相应的荧光强度来检测。结果发现，SerRS能显著提升SIRT2依赖NAD+的去乙酰化酶活性，且随着SerRS蛋白质浓度的增加，其对SIRT2酶活的促进作用增强（图 2A）。
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| A:Effect of SerRS on the deacetylation activity of SIRT2.The SIRT2 acitivity was measured by the fluorescence intensity (F360/F460).B: SerRS enhanced the deacetylation of SIRT2 to α-tubulin.Whole 293T cell lysates were incubated with purified SIRT2 and SerRS at the indicated ratios and then were treated with NAM.The acetylation levels of tubulin were analyzed by Western blot. 图 2 SerRS提高SIRT2去乙酰化酶活性 Fig 2 SerRS increased enzymatic activity of SIRT2 |
α-微管蛋白作为SIRT2去乙酰化底物之一，其乙酰化程度可调控自身的稳定性，进而对糖尿病性心肌病及相关心力衰竭产生一定的影响[19]。我们将微管蛋白作为反应底物，烟酰胺（nicotinamide，NAM）作为SIRT2去乙酰化反应抑制剂，在体外按照0、1、2的SerRS与SIRT2摩尔浓度比梯度与细胞裂解液在反应液中混合，经Western blot验证，微管蛋白乙酰化水平随SerRS浓度增加而不断降低（图 2B）。因此，SerRS可增强SIRT2酶活性，使α-微管蛋白的乙酰化程度降低。
SIRT2 H187位点可影响与SerRS的结合 为了寻找影响SIRT2和SerRS互作的位点，通过检索文献并对不同物种的SIRT2之间的同源性进行比对，我们发现SIRT2上的H187位点保守性较高（图 3A）。该位点对SIRT2本身依赖NAD+的去乙酰化酶活性有关键作用[20]。当187位点组氨酸（H）突变成酪氨酸（Y）时，SIRT2酶活丧失。我们以另一个影响SIRT2酶活的S368D突变为对照，通过外源和半内源的方法，检测在细胞内SerRS和SIRT2及其H187Y、S368D突变型是否有相互作用。结果表明：SIRT2的H187Y突变型不再与SerRS相结合，而S368D突变却不影响其与SerRS的相互作用（图 3B~3C）。
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| A:Comparison of SIRT2 conservation in different species; B:Flag-SerRS interacted with SIRT2-S368D, but without H187Y;C:SIRT2-H187Y did not interact with endogenous SerRS; D:Flag-SerRS interacted with SIRT2-H187A.293T cells were transfected with indicated plasmids, and were harvested and immunoprecipitated with anti-Flag M2 beads. 图 3 SIRT2的H187位点突变可影响与SerRS的结合 Fig 3 H187 mutation affected the binding between SIRT2 and SerRS |
为进一步确认H187位点突变对其与SerRS结合的影响，我们构建了SIRT2 H187A突变型。当187位点H突变成丙氨酸（A）时，会降低SIRT2的去乙酰化酶活性[20]。我们同样用外源的方法检测了SIRT2 H187A与SerRS的相互作用，发现与H187Y相比，H187A与SerRS的结合相对较强，但仍弱于SIRT2与SerRS的相互作用（图 3D）。结果表明，SIRT2的H187位点可调控其与SerRS的相互作用，当H突变为Y时产生的影响最大。
SIRT2突变位点的结构分析 SIRT2上与SerRS结合的界面包含两部分，即Gly52-Asp60和Trp337-Ser356[15]。为了进一步研究SIRT2 H187位点对其与SerRS结合的影响，我们尝试从结构生物学的角度进行深入探讨，采用软件对人源SIRT2（PDB ID编号：1J8F）的H187Y突变进行了结构模拟（图 4）。
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| 图 4 SIRT2-H187Y突变型的分子模拟结构 Fig 4 Molecular modeling of H187Y mutation in SIRT2 |
与野生型相比，187位点H突变为Y时，会与相邻的Q267位点发生空间上的冲突。一方面，酪氨酸侧链比组氨酸的更长，所以与267位谷氨酰胺羰基氧之间的距离从2.5Å缩短为2.3Å，在空间上不合理；另一方面，突变后187位点酪氨酸残基侧链变为负电，且与267位谷氨酰胺的羰基相斥。由此推测，H187Y突变体破坏了复合结构中同267位Q的相互作用，进而影响SIRT2的构象，使其与SerRS相互作用的2个位点发生了距离改变，进而影响其与SerRS的相互作用。
SerRS可被SIRT2去乙酰化 因为SIRT2能够与SerRS相互作用，且SIRT2是去乙酰化酶，为探究SerRS是否存在乙酰化修饰，我们通过NAM处理细胞进行检测。首先在细胞内进行Flag-SerRS转染，12 h后用5 mmol/L NAM按照0、2、4 h时间梯度处理，随后裂解细胞并使用Flag磁珠进行免疫共沉淀。Western blot结果显示，SerRS存在乙酰化修饰，且随着NAM处理时间增加，乙酰化水平不断提高（图 5A）。因此确定Sirtuins为SerRS的去乙酰化修饰酶。
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| A:NAM treatments increased SerRS acetylation.Western blot detected acetylation levels of ectopically expressed SerRS in 293T cells treated with 5 mmol/L NAM.B: SIRT2 overexpression decreased SerRS acetylation.Western blot detected acetylation levels of ectopically expressed SerRS in 293T cells co-transfected with SIRT2-Myc. 图 5 SIRT2使SerRS乙酰化 Fig 5 SIRT2 deacetylated SerRS |
进一步在细胞内共转染Flag-SerRS与SIRT2-HA，免疫共沉淀后经Western blot检测显示，SIRT2在细胞内过表达，SerRS的乙酰化程度下降（图 5B）。因此认为，SIRT2是SerRS的去乙酰化酶。
讨论乙酰化修饰在表观遗传及代谢调控中具有重要的作用，其调控的紊乱与许多疾病密切相关, 包括神经系统疾病[21]、癌症[22]和心血管疾病[23]等。心血管疾病作为威胁人类健康的一大疾病，已知的发病机制涉及氧化应激、细胞自噬、细胞的凋亡与再生等，这些都被证明与SIRT2紧密相关。
心力衰竭是许多心血管疾病常见的终末期病症，其特征之一是心肌的病理性肥大。有研究发现，与野生型小鼠相比，SIRT2敲除小鼠在注入血管紧张素Ⅱ后，心肌肥厚、纤维化加重，心脏功能受损。相反，SIRT2过表达可防止损伤[24]。体外实验表明，SIRT2过表达可保护心肌细胞在血清饥饿条件下不发生凋亡，而NAM则可抑制SIRT2进而促进心肌细胞凋亡[25]。但是，SIRT2在心血管疾病中的确切作用仍需要进一步研究，以验证SIRT2是否能像SIRT1或SIRT3一样，成为心血管疾病治疗或预防的靶点。SIRT2抑制剂已经在治疗神经退行性疾病中显示出积极的意义，有研究发现抑制SIRT2可在细胞水平上减少帕金森病相关毒性蛋白α-synuclein的积累和聚集[26]。
SerRS定位于细胞质，属于第二类AARS。其结构中特有的UNE-S结构域中存在核定位信号（nuclear localization signal，NLS），能引导SerRS入核[27]，进而参与血管生成的调控。在心血管疾病中，血管生成对梗死后心脏和循环功能的恢复至关重要，血管生成不足会阻止缺血后的恢复，并可能导致心肌梗死后的心力衰竭[28]。研究发现，当斑马鱼体内SIRT2的蛋白质表达量降低时，VEGFA的表达量上升，血管生成增加[15]。
SerRS可以通过招募SIRT2入核，对VEGFA基因的组蛋白去修饰以抑制其表达。SIRT1和SIRT2在血管内皮细胞中高表达，且都可介导氧化应激反应，通过药物抑制SIRT2可以降低氧化应激诱导的内皮细胞毒性[29]。我们通过免疫共沉淀验证了SerRS能够与SIRT2相互作用，而不与SIRT1结合。SIRT2通过调节α-微管蛋白的乙酰化水平，导致血管重构，从而调节血管紧张素Ⅱ诱导的内皮细胞迁移[30]。以α-微管蛋白为底物，我们发现SerRS与SIRT2的相互作用可增强SIRT2的去乙酰化酶活性。由于SIRT2主要定位于细胞质中，参与调控多种生理过程，SerRS也同样定位于胞质，两者相互作用后在SerRS的核定位信号引导下入核。从另一角度说明，SerRS对SIRT2酶活的增强作用可能对整体代谢水平产生影响，这为研究心血管疾病提供了一个新的思路。
目前对SerRS如何在细胞核中控制VEGFA表达已研究得较为清楚，但其中SerRS的作用及其激活SIRT2的机制却并不清楚。通过数据比对，我们发现SIRT2的H187位点保守性较高，而该位点也是SIRT2的去乙酰化活性的关键位点。对该位点的深入探究显示，H187A突变可降低SIRT2去乙酰化酶活性，同时其与SerRS的结合减弱。而使SIRT2失活的H187Y突变则阻断了SIRT2与SerRS的结合。以上结果初步表明，SIRT2的H187位点对其与SerRS的结合具有重要的调控作用，尤其是SIRT2 H187Y突变型不与SerRS结合。根据上述结果，通过结构模拟发现，187位点突变为酪氨酸后，会与相邻的Q267位点发生空间上的冲突，可能改变SIRT2构象，进而影响SIRT2与SerRS的结合。SerRS在许多恶性肿瘤中高表达，分析其原因，除了其氨基酰化功能在蛋白质合成中至关重要外，也存在SerRS参与其他信号通路的调控，进而影响肿瘤发生发展的可能性。可以通过调控SIRT2的H187位点来影响SerRS对SIRT2的招募及激活作用，同时不影响SerRS本身的氨酰化活性。
由于SIRT2为去乙酰化酶，我们通过实验发现SerRS存在乙酰化修饰，且SIRT2可调控SerRS的乙酰化水平。乙酰化修饰与蛋白质降解、核定位等功能相关，同时SerRS招募SIRT2入核会影响血管生成，所以SIRT2对SerRS乙酰化修饰的调控很可能在该过程中发挥功能。结合上述发现的H187位点对SIRT2自身去乙酰化酶活性有重要影响，后续的工作可进一步研究SIRT2对SerRS的乙酰化调控机制及其在疾病和肿瘤发生、发展中的作用。
综上，本研究发现了SerRS作用于SIRT2并增强其酶活的潜在位点，拓展了对于SerRS和SIRT2在许多相关疾病中的认识，并为针对SIRT2的药物研发以及相关疾病的治疗提供了新的思路。
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