2020, Vol. 47
2. 复旦大学基础医学院病理学系 上海 200032;
3. 上海市肾脏疾病与血液净化重点实验室 上海 200032
2. Department of Pathology, School of Basic Medical Sciences, Fudan University, Shanghai 200032, China;
3. Shanghai Key Laboratory of Kidney Disease and Dialysis, Shanghai 200032, China
足细胞构成肾小球滤过膜最外一层，其胞质向外突起形成足突。足细胞的多种特异性细胞骨架蛋白（包括synaptopodin、nephrin等）在其受损后表达降低，足突消失甚至从基膜脱落，是导致肾小球硬化及蛋白尿的最常见原因[1-2]。肾上腺髓质肽（adrenomedullin, AM）是一种小分子扩血管肽，体内分布广泛，且发挥一定的肾脏保护作用[3-5]。在受损足细胞中，AM蛋白及其核酸表达均显著增强[6-7]。Rho GTPases家族在调控细胞骨架蛋白起关键作用，主要成员包括RhoA、Rac1和Cdc42[8]。我们在前期研究中证实，AM不仅通过上调Rho GTPases活性促进足细胞细胞间接触的形成[9]，且可显著升高RhoA活性、增强RhoA-synaptopodin相互作用，促进由嘌呤霉素氨基核苷（puromycin aminonucleoside, PAN）所诱导受损足细胞的修复[10]。然而，有关Rac1及Cdc42在AM保护足细胞中的作用尚不明确。因此，我们拟用PAN处理造成大鼠足细胞损伤，通过体外细胞培养及建立大鼠PAN肾病模型，并应用AM蛋白进行干预，以观察足细胞特异性细胞骨架蛋白以及Rac1/Cdc42的表达变化，进一步探讨AM发挥足细胞保护作用的可能机制。
材料和方法细胞株及实验分组 永生化小鼠足细胞株按本团队前述方法[9]进行培养。该细胞株在33 ℃、添加γ-干扰素条件下呈增殖状态，在37 ℃、无干扰素条件下进行分化。在33 ℃、5% CO2培养箱中以γ-干扰素（10 U/mL)、10%胎牛血清的RPMI 1640培养液进行培养, 亚融合状态时按1:10比例传代，于37 ℃、5%CO2培养箱分化10~14天。将分化成熟的足细胞以无血清培养液静止12 h后分为4组：正常对照组（control）、PAN处理组（100 μg /mL，美国Sigma公司）、PAN联合AM（10-7 mol/L，苏州强耀生物科技有限公司）处理组、PAN联合AM及PKA抑制剂H89（10-6 mol/L，美国Sigma公司）处理组，分别处理24 h后进行相应指标(Rac1、cdc42以及足细胞、骨架蛋白synaptopodin、nephrin)的检测。
大鼠PAN肾病模型 健康雄性SD大鼠购自上海SLAC实验动物公司，清洁级，体质量130~150 g，标准饲料喂养，自由进食和进水，普通光照。随机分为3组：（1）PAN损伤组（PAN组），一次性腹腔注射PAN（150 mg/kg体质量）；（2）AM治疗组（AM+PAN组），每天经尾静脉注射AM（66 μg/kg体重）直至相应时相点处死；（3）对照组，以无菌生理盐水代替药物。在首次注射PAN后第3、7、14天，分别以代谢笼收集大鼠24 h尿液，随后处死大鼠，留取肾组织。部分肾皮质经剪碎、过滤不同孔径筛网，分离并收集肾小球；部分肾皮质冻存于-70 ℃，用于提取组织蛋白。
尿蛋白SDS-PAGE电泳 收集24 h尿液，10 000×g 4 ℃离心5 min，取上清行SDS-PAGE电泳，将胶行考马斯亮蓝染色，反复换液脱色后拍照，应用图像分析软件对条带进行吸光度分析。
透射电镜观察 肾皮质组织切至1 mm3大小，经2.5%戊二醛、1%四氧化锇双重固定，梯度乙醇脱水，环氧树脂812包埋，超薄切片经醋酸铀-柠檬酸铅双重染色，透射电镜（日立H-7000，日本日立公司）观察并拍照，应用FEI Tecnai G2 Spirit透射电镜（美国FEI公司）及FEI Tecnai 4.3成像软件，对每只大鼠至少10个毛细血管袢的足突宽度进行测量分析。
免疫荧光染色 体外培养足细胞以4%多聚甲醛固定，3%BSA封闭30 min，一抗4 ℃孵育过夜，以Alexa Fluor 488/546标记的荧光二抗（1:200，美国Invitrogen公司）37 ℃孵育1 h，DAPI衬染细胞核，经激光共聚焦显微镜（TCS-SP8，德国Leica公司）观察拍照。所用一抗包括：兔抗synaptopodin（1:50）和羊抗desmin（1:50，美国Santa Cruz公司）。
采用OpalTM 4色荧光免疫组化试剂盒（美国Perkin Elmer公司）对肾组织石蜡切片行AM-synaptopodin和synaptopodin-desmin双重免疫荧光染色。该试剂盒应用酪胺信号放大技术（tyramide signal amplification，TSATM）。石蜡切片常规脱蜡，3% H2O2去除内源性过氧化物酶，封闭液封闭非特异性结合位点，第一重一抗4 ℃孵育过夜，HRP标记二抗孵育10 min，TSA染色孵育10 min；微波处理去除第一重一抗及二抗，封闭液封闭，加第二重一抗，方法同上。DAPI衬染细胞核，甘油封片，应用Vectra多光谱成像系统（美国Caliper公司）进行图片扫描。所用一抗包括：兔抗AM、羊抗synaptopodin、羊抗desmin（1:2 500，美国Santa Cruz公司）。
Western blot 以含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液提取足细胞或肾组织总蛋白，以BCA法进行蛋白质定量，经SDS-PAGE电泳并湿转移至硝酸纤维素膜上。以5%脱脂牛奶封闭2 h后，一抗4 ℃孵育过夜，HRP标记二抗（1:1 000，上海优宁维试剂公司）常温孵育2 h。经曝光、显影、成像，应用图像分析软件对特异性条带进行吸光度分析。所有实验均重复至少3次。所用一抗包括：小鼠抗Cdc42、兔抗Rac1、兔抗synaptopodin、羊抗desmin（1:500，美国Santa Cruz公司）。
实时定量RT-PCR（qRT-PCR） Trizol（美国Invitrogen公司）法提取足细胞RNA，测定其浓度，使用mRNA逆转录试剂盒（Primescrip RT Master Mix, 日本Takara公司）将目的RNA逆转录为cDNA。采用SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒（日本Takara公司）行qRT-PCR，反应条件为95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，扩增40个循环。选择GAPDH为内参照基因，采用2-ΔΔCT法进行半定量分析。
谷胱甘肽巯基转移酶-拉下实验检测Rho GTPases活性 采用Rho GTPases活化分析组合生化试剂盒（美国Cytoskeleton公司）特异性检测处于活性状态的Rho GTPases，按照操作说明进行[11]。将体外培养的足细胞或分离的肾小球以含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液提取细胞总蛋白，随后与PAK-PBD琼脂糖珠孵育，清洗后加入SDS上样缓冲液，100 ℃煮沸5 min，按前述Western blot法进行检测。
统计学处理 采用GraphPad Prism 5.0软件进行数据的统计学分析。正态分布的计量数据以x±s表示，两组间采用独立样本配对t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
结果AM对体外培养足细胞特异性骨架蛋白表达的影响 双重免疫荧光染色后，激光共聚焦显微镜观察足细胞特异性骨架蛋白synaptopodin及其受损标志物desmin的表达结果显示，在正常足细胞中，synaptopodin染色为位于胞质及细胞膜的排列有序的丝状或线状结构，desmin染色为阴性或胞质内极微弱染色；经PAN作用后，synaptopodin染色显著减弱且呈现为排列紊乱的丝状结构，而desmin染色显著增强；AM蛋白显著抑制PAN所介导的效应，该表达趋势可被PKA抑制剂H89阻断（图 1A）。Western blot结果显示，与对照组比较，PAN显著抑制synaptopodin、nephrin表达而升高desmin蛋白水平，该作用被AM显著抑制，H89显著阻断AM所介导的效应（图 1B）。qRT-PCR结果显示，PAN显著抑制synaptopodin及nephrin的mRNA表达，该作用可被AM显著抑制，H89显著阻断AM的作用（图 1C）。
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| A:Double immunofluorescence for synaptopodin (green) and desmin (red) (×400);B:Protein levels of synaptopodin, nephrin and desmin; C: The relative mRNA expressions of synaptopodin and nephrin.(1)vs. Control, (4)vs. PAN+AM, P < 0.01; (2)vs. Control, (3)vs. PAN, P < 0.05. 图 1 大鼠足细胞细胞骨架蛋白的表达 Fig 1 Expressions of cytoskeleton proteins of podocytes in rats |
AM对体外培养足细胞Rac1/Cdc42表达的影响 与对照组相比，PAN显著下调Rac1及Cdc42的总蛋白水平及活性，该作用被AM显著阻断，AM所介导的效应被H89显著阻断（图 2）。
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| (1)vs. Control, (3)vs. PAN, P < 0.01; (2)vs. Control, (4)vs. PAN+AM, P < 0.05. 图 2 大鼠足细胞Rac1、Cdc42的蛋白水平及活性改变 Fig 2 Protein levels and activities of Rac1 and Cdc42 in podocytes in rats |
AM对大鼠尿蛋白水平的影响 SDS-PAGE结果显示，PAN组3天时尿蛋白水平即显著升高，7天、14天尿蛋白水平进一步升高，且主要成分为白蛋白（图 3A）；与模型组相比，PAN+AM组在3个时相点的尿蛋白水平均显著低于模型组（图 3B）。
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| A:The urine protein excretion of PAN groups; B:The urine protein excretion of three groups at different time points. (1)vs. Control, (3)vs. PAN, P < 0.01; (2)vs. Control, P < 0.05. 图 3 大鼠PAN肾病模型尿蛋白表达水平 Fig 3 Urine protein excretion of PAN nephrosis in rats |
AM对大鼠足突宽度的影响 经电镜观察，PAN组3天即出现足细胞广泛肿胀、足突显著变宽；7天及14天时，足突广泛消失伴大量微绒毛形成，与尿蛋白水平趋势一致。与PAN组相比，AM+PAN组足突宽度显著降低（图 4）。
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| The changes of foot process width were observed by electron microscopy (×3 200). (1)vs. Control, (3)vs. PAN, P < 0.01; (2)vs. Control, P < 0.05. 图 4 大鼠PAN肾病模型足突宽度的变化 Fig 4 Changes of foot process width in PAN nephrosis in rats |
大鼠肾小球AM的表达 synaptopodin-AM双重免疫荧光染色结果显示，AM主要定位于足细胞；与对照组比较，PAN组足细胞AM表达显著增强（图 5）。
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| 图 5 大鼠PAN肾病模型足细胞中AM的表达(×400) Fig 5 AM expression in the podocytes of PAN nephrosis in rats (×400) |
大鼠足细胞特异性骨架蛋白的表达 synaptopodin-desmin双重免疫荧光双染色结果显示：与对照组相比，PAN组synaptopodin在各时相点逐渐下降，而desmin表达逐渐增强；与PAN组相比，PAN+AM组synaptopodin明显增强而desmin显著降低（图 6A）。Western blot结果显示，与对照组相比，PAN组synaptopodin及nephrin的蛋白表达水平显著下降，经AM干预后则显著升高（图 6B）。
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| A: Double immunofluorescence for synaptopodin (green) and desmin (red) (×400);B:The protein levels of synaptopodin, nephrin and desmin. (1)vs. Control, (3)vs. PAN, P < 0.01; (2)vs. Control, P < 0.05. 图 6 大鼠足细胞特异性骨架蛋白表达的变化 Fig 6 Cytoskeleton protein expressions in the podocytes of rats |
AM对大鼠分离肾小球Rac1/Cdc42表达的影响 由大鼠肾皮质组织分离肾小球（图 7A）。与对照组相比，PAN组Rac1、Cdc42蛋白表达及活性均显著下降，经AM干预后则显著升高，但仍低于对照组（图 7B、7C）。
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| A:The isolated glomeruli; B and C:The protein levels of GTP-Rac1, Rac1, GTP-Cdc42, and Cdc42. (1)vs. Control, (3)vs. PAN, P < 0.01;(2)vs. Control, P < 0.05. 图 7 大鼠分离肾小球Rac1/Cdc42的表达 Fig 7 Rac1 and Cdc42 expressions in the isolated glomeruli of rats |
Rho GTPases属于Ras超家族，相对分子质量（Mr)为20 000~30 000，是一类GTP结合蛋白，当其与GTP相结合时为活性状态，与GDP相结合时为非活性状态，从而发挥“分子开关”的作用，调控其下游多种效应分子的活化[8]。Rho GTPases在调控足细胞形态及功能中发挥重要作用，而不同Rho GTPases成员可能发挥不同调控作用。对足细胞条件性Rho GTPases敲除小鼠的研究发现，仅Cdc42（而非RhoA或Rac1）敲除小鼠表现为先天性肾病综合征、足突消失及肾小球硬化，出生后2周即因肾功能衰竭而死亡[11-12]。Cdc42在由高糖、脂多糖及ADR所致受损足细胞中的蛋白表达水平及活性均呈显著下降；应用siRNA技术或特异性抑制剂靶向下调Cdc42表达，无论在体内或体外均可导致足细胞凋亡及蛋白尿的产生[13]。提示，在生理条件下Cdc42在维持足细胞正常形态和功能中发挥至关重要的作用。相对比而言，足细胞条件性Rac1敲除小鼠虽然不发生肾功能障碍且足细胞发育正常，但其在以鱼精蛋白硫酸盐灌注造成的急性足细胞损伤[11]或STZ诱导的糖尿病肾病[14]中，足细胞损伤及蛋白尿均得到显著缓解，该作用与Rac1/PAK1/p38/β-catenin信号转导被特异性抑制密切相关[14]。然而，在慢性高血压性肾小球损伤[11]或由阿霉素诱导的FSGS模型[15]中，足细胞条件性Rac1敲除小鼠表现为更严重的足细胞丢失、蛋白尿及肾小球硬化，且与mTOR通路被抑制显著相关[15]。此外，足细胞特异性Rac1敲入通过活化的P38MAPK-β1-整合素信号通路导致足细胞足突消失甚至脱失以及大量蛋白尿的产生[16-17]，肾组织形态由早期MCD进展为FSGS[16]。在人MCD及FSGS肾活检标本中，足细胞Rac1活性显著升高[16]。抑制Rac1可发挥一定程度的足细胞保护作用。在肾5/6切除所致慢性肾损伤模型中，应用Rac1抑制剂可显著减轻蛋白尿水平及肾组织损伤形态学[18]。激素治疗可通过抑制Rac1表达发挥保护足细胞的作用[19]。上述研究提示，Rac1在不同类型的足细胞损伤中介导不同的效应。
最近，Wan等[20]在转基因斑马鱼模型发现，足细胞Rac1活性的升高程度与其对足细胞损害程度呈剂量依赖性，中等程度Rac1活性升高并不损害肾小球滤过屏障，但加重甲硝唑会导致足细胞损伤；当Rac1活性显著升高时，nephrin及podocin表达显著下降，导致大量蛋白尿、足突消失，斑马鱼发生水肿、乃至幼年期即死亡。此外，Muraleedharan等[21]在果蝇肾细胞中研究发现，Rac1及Cdc42之间的平衡表达在维持足细胞细胞骨架稳定表达中发挥关键调控作用。Stephenson等认为对Rho GTPases的研究不应仅限于其定量表达，更应结合其空间表达来揭示其作用机制[22]。因此，在不同损伤因素所致复杂的肾小球内环境中，对Rac1及Cdc42时空表达的深入研究将有助于阐明其作用机制。
PAN是一种来源于链霉菌属细菌的氨基核苷类抗生素，是通过造成足细胞毒性损伤而建立肾病综合征动物模型的常用药物之一[23]。在大鼠PAN肾病模型的修复期，足细胞Rac1表达开始升高，提示其与促进足突修复有关；体外研究表明，Rac1活性在发生分化的足细胞中明显升高，表达增强的Rac1可显著促进未分化足细胞的伪足（足突）形成[24]。过表达nephrin不仅通过激活磷酸肌醇-3-激酶信号通路升高Rac1活性[25]，且通过激活cAMP反应元件连接蛋白（cAMP response element-binding protein，CREB）促进synaptopodin表达升高与集聚[26]，对大鼠PAN肾病模型发挥保护作用。上述研究提示，Rho GTPases与细胞骨架蛋白之间相互作用在调控足细胞结构与功能中的重要作用。本研究分别经体外足细胞培养并成功建立大鼠PAN肾病模型，发现AM显著改善由PAN所致足细胞特异性骨架蛋白synaptopodin和nephrin的表达下降、损伤特异性标志物desmin的表达增强、大鼠尿蛋白水平以及足突广泛消失，提示AM对PAN所致足细胞损伤的保护作用。此外，AM在体内、外均显著拮抗由PAN所致Rac1和Cdc42蛋白水平及活性的下降，提示AM可通过上调Rac1和Cdc42蛋白表达及活性，稳定细胞骨架蛋白的表达，从而发挥保护足细胞的作用。
cAMP作为细胞内重要的第二信使，主要通过激活PKA发挥调控细胞增殖、分化及细胞骨架形成的功能。Azeloglu等[27]分离大鼠PAN肾病模型的肾小球并应用蛋白组学分析，发现活化的cAMP-PKA通过激活其下游转录因子CREB从而增强synaptopodin的表达，促使肾组织形态和功能的恢复。应用腺苷酸环化酶激动剂forskolin[28-29]或内源性cAMP激活剂—异丙肾上腺素[30]，或选择性cAMP/PKA激活剂（pCPT-cAMP），均可减轻阿霉素肾病小鼠蛋白尿水平和足细胞足突消失，缓解由ADR或PAN所致足细胞损伤及丢失，促使synaptopodin，nephrin等表达。以上研究提示，cAMP-PKA信号通路是维持足细胞正常结构与功能的关键调控因子。本研究中，AM对PAN的拮抗作用可被PKA抑制剂H89所阻断，提示AM主要通过PKA信号通路调控Rac1/Cdc42进而促进细胞骨架蛋白的表达。此外，我们在大鼠PAN肾病模型中发现，足细胞AM的表达在3天时即显著增强，且随时相点其表达逐渐增强，提示AM在足细胞遭受损伤后的反馈性保护机制，且可能参与足细胞损伤后修复。
综上所述，AM可能主要通过活化PKA信号通路，稳定细胞骨架蛋白的表达，从而在体内、外对由PAN所致足细胞损伤发挥一定保护作用，该作用与AM上调Rac1及Cdc42蛋白表达及活性密切相关。进一步深入探讨调控Rho GTPases活化状态的蛋白分子，Rho GTPases不同成员之间的串话（cross talk），以及Rho GTPases活性变化时的时点、部位，将有助于揭示AM对Rho GTPases及足细胞细胞骨架蛋白的调控机制，为临床治疗以足细胞损伤为主的肾脏疾病提供更多的理论依据及作用靶点。
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