2020, Vol. 47
2. 复旦大学药学院合成药物化学教研室 上海 201203;
3. 复旦大学药学院药学实验教学中心 上海 201203
2. Department of Medicinal Chemistry, School of Pharmacy, Fudan University, Shanghai 201203, China;
3. Experimental Teaching Center of Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy, Fudan University, Shanghai 201203, China
血小板活化因子（platelet activating factor, PAF）是一种强效的磷脂类炎症介质，化学结构为1-O-烷基-2-乙酰基-Sn-甘油-3-磷酸胆碱。内皮细胞、中性粒细胞和巨噬细胞等多种细胞可合成PAF并释放入血液。PAF可参与多种生理病理过程，如过敏反应，哮喘和动脉粥样硬化等。PAF通过结合细胞膜上的PAF受体（PAF receptor, PAFR）发挥生物学活性，PAFR是一种G蛋白偶联受体[1-3]。血浆中的PAF可被PAF乙酰基水解酶催化为溶血血小板活化因子（Lyso-PAF），从而失去PAF的生物学活性[4-5]。细胞内PAF的生成有两种途径，一种是从头合成途径，该途径合成的PAF参与维持细胞的正常生理功能；另一种生成PAF的途径为磷脂重构（即Lands’cycle）：在炎症刺激下，细胞膜的PAF被iPLA2（细胞内钙离子非依赖性磷脂酶A2）水解，去除Sn-2位脂酰基，生成Lyso-PAF, 然后在Lyso-PAF乙酰基转移酶（Lyso-PAF acetyl transferase, LPAFAT）催化下，Lyso-PAF的Sn-2位羟基乙酰化而生成PAF。LPAFAT的底物为Lyso-PAF和乙酰CoA，其产物为PAF和CoA-SH[5-6]（图 1）。
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| A:The structure of substrate; B:The structure of product; C:The enzymatic reaction equation. 图 1 LPAFAT的底物/产物结构式及其酶促反应方程式 Fig 1 The substrate and product structural formula and enzymatic reaction equation of LPAFAT |
血浆中的PAF浓度虽然只有pmol/L级，但造成的炎症效应强大，参与了多种病理过程，抑制PAF引起的炎症效应是当前的研究热点之一。已有文献以PAFR为靶标，研究开发PAFR的拮抗剂，并已有药物应用于临床，而新的PAFR拮抗剂还在陆续开发[7]。在此类药物开发过程中，Deng等[8]发现了一种不依赖PAFR的PAF病理效应，单独拮抗PAFR并不能达到理想的药理学作用，因此如何减少血浆中炎症性PAF的浓度成为接下来的重要研究方向。研究表明血浆中的一些多肽或其衍生物可以结合PAF本身，从而降低PAF的致炎效应，进而削弱PAF的药理学作用[9-10]。另一种减少PAF炎症效应的方法是开发LPAFAT抑制剂，以减少体内PAF的生物合成。目前LPAFAT抑制剂的开发已经取得较大进展，文献报道至少有4种母核具有LPAFAT的抑制活性[11-13]。
在开发LPAFAT抑制剂的过程中，我们采用了多种LPAFAT活性的检测方法，并用这些方法筛选化合物的抑制活性。本文采用一个阳性抑制剂TSI-01[12]和一个假阳性抑制剂硝酸咪康唑为例, 评价常用的LPAFAT活性测定方法在抑制剂筛选中的优缺点。
材料和方法实验材料 硝酸咪康唑（M3512），化合物TSI-01由复旦大学药学院合成药物化学教研室合成并鉴定，Lyso-PAF（L5016）, 乙酰CoA(A2056）, 还原性CoA-SH (C4780)，PAF标准品（P4904）, CPM [7-Diethylamino-3-（4-maleimidophenyl）-4-methylcoumarin]（C1484）（美国Sigma-Aldrich公司）, NBD-Lyso PC（Avanti Polar lipids, 810128P），HPTLC硅胶板（烟台江友硅胶开发有限公司，型号HSG），其他常规试剂均为国药集团分析纯产品。
LC/MS/MS检测PAF含量 本文利用天然底物Lyso-PAF和乙酰CoA建立酶促反应，在高效液相色谱和二级质谱的分离和检测下，直接测定产物PAF的含量。方法参考文献[12, 14]并略有修改。
肾微粒体的分离 低温超速离心法分离肾微粒体（LPAFAT来源）为常规方法[10]。冰浴下C57BL/6小鼠肾脏在20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）、300 mmol/L蔗糖缓冲液中充分匀浆，匀浆液于4 ℃ 9 000×g离心10 min，取上清在4 ℃ 100 000×g离心1 h，沉淀用100 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）、1 mmol/L CaCl2、0.007 5% Tween-20缓冲液悬浮，-80 ℃保存备用。
体外酶促反应的建立 含100 μg蛋白的肾微粒体悬浮于100 μL含100 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）、1 mmol/L CaCl2及0.007 5% Tween-20缓冲液中，在冰浴中加入浓度为0.5 mg/mL的Lyso-PAF 6 μL（溶剂为1:1的二甲亚砜:甲醇，v/v）和浓度为2 mg/mL的乙酰CoA水溶液6 μL。加入溶解于二甲亚砜的TSI-01（储备液浓度10 mmol/L）/硝酸咪康唑(储备液浓度10 mmol/L)或加入等量二甲亚砜作为对照，使TSI-01或硝酸咪康唑在反应体系中的终浓度分别为0、10、30、100 μmol/L，上述体系混匀后放置于37 ℃水浴10 min。
脂类的提取 在上述反应体系中加入300 μL的氯仿:甲醇(2:1, v/v）萃取溶剂。剧烈震荡30 s后9 000×g离心10 min。各组吸取等量下层有机相转移入新的试管，用氮吹仪将有机相吹干。样品保存于-80 ℃备用。PAF标准品用氯仿溶解, 配制成不同浓度，各取50 μL用氮吹仪吹干待用。
LC/MS/MS检测 样品或不同含量的PAF标准品用50 μL的异丙醇:乙腈(1:1, v/v）复溶进样。分析采用HPLC Eksigent LC100偶联AB SCIEX Triple TOF 5600+质谱。HPLC色谱柱：Waters XBridge Peptide BEH C18, 3.5 μm，2.1×100 mmol/L，预柱：Phenomenex C18，4×20 mmol/L，柱温：50 ℃，进样室温度：4 ℃，流速：0.4 mL/min，进样体积：2 μL，流动相A:10 mmol/L乙酸铵+0.1%甲酸+99.9%水，流动相B:10 mmol/L乙酸铵+0.1%甲酸+49.95%乙腈+49.95%异丙醇，流动相A和B的比例随时间梯度变化。质谱采用负离子模式。
数据处理 参照PAF标准品数据，用PeakView 1.2软件将样品中的PAF定性，用MultiQuant 2.1对定性的PAF定量。
巯基反应探针偶联分光光度法检测产物CoA-SH含量分析法 利用天然底物Lyso PAF和乙酰CoA建立酶促反应，用巯基反应探针CPM与产物CoA-SH的巯基反应产生荧光信号，通过荧光信号的强弱判断酶活性大小。本方法在文献[12]基础上略有改进。
体外酶促反应的建立 参考“LC/MS/MS检测PAF含量法”中的第二步。
产物信号检测 在反应体系中加入100 μL甲醇，剧烈震荡30 s后9 000×g离心10 min。将50 μL上清转移入96孔荧光酶标板，每孔样品中加入50 μL含5 μmol/L CPM（CPM溶解于甲醇配制成0.5 mg/mL母液, 约为1.242 mmol/L）的50%甲醇水溶液。震摇96孔板混匀，室温静置2 h后用BioTek Flx800酶标仪检测荧光信号, 激发光350 nm，发射光450 nm，数据采用底读方式，灵敏度设置为50。
化合物与CoA-SH反应的检测 96孔荧光酶标板各孔中加入50 μL含有还原性CoA-SH（终浓度为20 μg/mL）的缓冲溶液A，然后加入各种不同浓度的硝酸咪康唑或化合物TSI-01，混匀后室温孵育30 min，随后各孔加入50 μL含5 μmol/L CPM的50%甲醇水溶液。后续操作和数据检测参考“产物信号检测”。
TLC检测荧光标记产物分析法 以荧光标记的Lyso-PAF（或Lyso-PC, 图 1A）和乙酰CoA作为底物建立酶促反应，产物为荧光标记的PAF或类似物，通过产物的荧光信号强弱判断酶活性大小。方法参考文献[15-16]略有修改。
体外酶促反应的建立 含100 μg蛋白的肾微粒体悬浮于100 μL 100 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4)、1 mmol/L CaCl2及0.007 5% Tween-20缓冲液中，在冰浴中加入浓度为0.5 mg/mL的NBD-Lyso PC 4 μL和浓度为2 mg/mL的乙酰CoA水溶液6 μL。加入溶解于二甲亚砜的TSI-01（储备液浓度10 mmol/L）或硝酸咪康唑(储备液浓度10 mmol/L)或加入等量二甲亚砜作为对照，使TSI-01或硝酸咪康唑在反应体系中的终浓度分别为0、10、30、100 μmol/L。上述体系混匀后放置于37 ℃水浴10 min。
脂类的提取 参考“LC/MS/MS检测PAF含量”中的第三步。
薄层层析(TLC)分离分析 上述脂类提取物用40 μL氯仿复溶，用毛细玻璃管将样品装载于HPTLC硅胶板，采用氯仿:甲醇:水（65:25:4，v/v）展开10 min。待有机溶剂挥发干净，在紫外灯下激发荧光并拍照。条带光密度采用Smart View软件分析。
数据统计及作图 每组至少3次实验，数据表示为x±s，两组之间的比较采用t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。所有数据用GraphPad Prism 6.0软件作图。化合物分子结构采用ChemBioDraw Ultra 14.0软件绘制。
结果LC/MS/MS检测PAF含量法 LC/MS/MS的响应值（峰面积）对应PAF含量（pmol/L）的关系见图 2A，PAF在0~50 pmol/L范围内，LC/MS/MS的响应值呈现良好的线性关系（回归系数r > 0.99）。1 pmol/L范围以内的PAF与LC/MS/MS响应值之间的标准曲线如图 2B。根据本文建立的酶促反应, 用LC/MS/MS检测所获得的PAF峰面积均在100 000自由单位以内，根据标准曲线计算所得PAF产物均在2 pmol/L以内。我们通过增减底物种类及使用不同浓度的抑制剂建立酶促反应，产物PAF的含量随各种因素变化的关系见图 2C。结果表明，TSI-01对LPAFAT活性有抑制作用，在100 μmol/L浓度范围内，其抑制作用呈剂量依赖性。硝酸咪康唑没有LPAFAT抑制活性。
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| A: Detection limit of LC/MS/MS for PAF; B:The standard curve of PAF in the range of 0-2 pmol/L; C:Effects of substrates and inhibitors on the catalytic generation of PAF by LPAFAT. (1)P < 0.01, n=3. 图 2 通过LC/MS/MS检测产物PAF的含量筛选LPAFAT抑制剂 Fig 2 LPAFAT inhibitor screening by LC/MS/MS via measuring the concentration of product PAF |
巯基反应探针偶联分光光度法检测产物CoA-SH含量分析法 CPM本身几乎没有荧光信号，但CPM与还原性巯基反应后生成的荧光信号很强烈。本研究中，CPM与还原性巯基的反应发生在荧光酶标板中，2 h内室温下产生的荧光信号强弱随时间的延长而加强。因孵育时间的长短对检测信号的强弱影响很大，所以不同批次实验得到的数据没有可比性。在同一批次下，CPM本身、肾微粒体、酶促反应底物Lyso-PAF与乙酰辅酶A对荧光信号的影响见图 3A。该结果表明，仅有肾微粒体及仅有CPM条件下几乎没有荧光信号（图 3A柱1和柱2）。不加入底物Lyso-PAF和乙酰辅酶A的条件下，本方法即产生较强的噪音信号（由肾微粒体和CPM两种因素同时存在时产生的荧光信号），噪音信号占总信号比例约为39%（图 3A柱3）。单独加入底物Lyso-PAF并不增强荧光信号（图 3A柱4），但单独加入底物乙酰辅酶A，荧光信号即达到峰值（图 3A柱5），即使加入两种底物也并未继续增加荧光信号（图 3A柱6）。这种结果表明，在不加入Lyso-PAF的条件下，即使单独加入底物乙酰辅酶A，酶促反应中已发生大量的乙酰基转移反应而产生了还原性CoA-SH。蛋白质在酶催化或无酶催化下均可发生乙酰化反应。我们用牛血清白蛋白作为乙酰化受体证实了这一现象（图 3B）。由于本方法中蛋白的乙酰化反应即已生成大量的还原性CoA-SH（图 3A柱5），真正由LPAFAT催化后生成的还原性CoA-SH与CPM反应产生的荧光信号极微弱（图 3A柱6与柱5的差值），因而本方法并不能准确判断LPAFAT活性的大小。但是，我们用本方法检测TSI-01和硝酸咪康唑对LPAFAT的抑制作用时，却得到如图 3C所示的实验结果。该结果表明TSI-01呈剂量依赖性地减少由CPM与还原性CoA-SH反应产生的荧光信号。经过对TSI-01结构的分析，我们猜测该化合物可直接与还原性CoA-SH发生迈克尔加成反应，从而消耗大量还原性CoA-SH，减少了还原性CoA-SH与CPM反应生成的荧光信号。为验证这一假设，我们用还原性CoA-SH标准品与TSI-01反应，然后用CPM检测剩余还原性CoA-SH的含量（图 3D），该结果表明TSI-01呈剂量依赖性地减少由CPM与还原性CoA-SH反应产生的荧光信号。
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| A:The influence of different factors on the detection signal of the analytical method; B:Effect of protein acetylation on detection signal; C:The effect of inhibitors on the detection signal of the analytical method; D:The effect of inhibitors on the detection signal produced by reaction of CPM and CoA-SH. (1)P < 0.01, n=3. 图 3 产物CoA-SH含量分析法筛选LPAFAT抑制剂 Fig 3 LPAFAT inhibitors screened by CoA-SH content analysis |
TLC检测荧光标记产物分析法 NBD-Lyso PC中，荧光基团与Sn-1位的脂酰基连接，由于细胞匀浆或微粒体中存在的磷脂酶A1活性很强，在酶促反应中生成了大量副产物NBD标记的游离脂肪酸（图 4中NBD-FFA条带）。尽管如此，以NBD-Lyso PC和乙酰CoA为底物，仍然可以测定LPAFAT的活性（图 4中NBD-PAF类似物条带）。不同浓度的TSI-01和硝酸咪康唑对LPAFAT都有抑制作用，且抑制作用呈剂量依赖性（图 4A、4B）。
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| A:Effects of TSI-01 on the detection signals; B:Effects of miconazole on the detection signals. (1)P < 0.01, n=3. 图 4 TLC检测荧光标记产物分析法筛选LPAFAT抑制剂 Fig 4 LPAFAT inhibitors screened by fluorescence labeled product analysis |
动物血浆或细胞中生理条件下的PAF含量极其微少，至今已发展出多种方法监测生理条件下的PAF含量。有学者将PAF衍生加入荧光基团后，用高效液相色谱检测，可检测低至100 pg的PAF。但该方法费时，样品容易损失而引入操作误差[17]。至今最灵敏的方法是先去除PAF的磷酸胆碱极性基团，替代为非极性基团，成为挥发性物质，然后用气相色谱和质谱联用检测，可检测到低至50 fg的PAF[14]。但该方法同样费时，样品容易损失而引入操作误差，价格也很高昂。用高效液相色谱和二级质谱联用直接对PAF检测，文献报道称可检测到低至1 pg（1.9 fmol）的PAF[14]。本文所建立的LC/MS/MS方法可检测到低至0.01 pmol的PAF，足以用于体外监测LPAFAT的活性。该方法省时，由人为操作引入的误差小，数据重现性高，但检测成本依然较高。通过LC/MS/MS方法检测PAF的含量来判断LPAFAT活性，与本文介绍的其他两种方法比较，优点在于建立酶促反应时，所使用的底物均是天然结构，最符合酶与天然底物的结合状态，能准确判断LPAFAT的真实活性及化合物对该酶是否具有真实的抑制作用。本文采用两种化合物TSI-01和硝酸咪康唑，TSI-01对LPAFAT具有抑制作用，但硝酸咪康唑并没有LPAFAT的抑制活性（图 2C）。
LPAFAT催化反应的产物除了PAF，还有CoA-SH。通过检测CoA-SH的含量来判断酶活性大小，具备良好潜力。在本文建立的酶促反应中，底物乙酰CoA发生了非特异性的转乙酰基反应，因而产生了大量的CoA-SH，造成该方法的本底噪音较大（图 3A柱5与柱4的差值）。这种大量的转乙酰基反应可能由蛋白的乙酰化造成（图 3B）。巯基反应探针CPM除了与CoA-SH反应产生荧光外，其与蛋白质中的还原性-SH基团反应也可产生荧光信号（该数据在本文没有提供）。与Tarui等[12]采用的方法相比，本文已有改进，我们在酶促反应结束后用甲醇将大量蛋白沉淀，使其与CoA-SH分离，但上清中仍然残留少量蛋白质（带有还原性-SH基团），也是本底噪音信号的来源之一（图 3A柱3和柱4，图 3B柱1）。除了底物乙酰CoA外，加入另一个底物Lyso PAF，并没有使由LPAFAT催化产生的CoA-SH信号大幅提升（图 3A柱6与柱5的差值），所以该方法并不适合于检测LPAFAT的催化活性。
与巯基反应探针CPM的官能团一样，TSI-01的母核也是马来酰亚胺，与蛋白质中的还原性-SH或CoA-SH中的-SH都可以发生迈克尔加成反应。当TSI-01在酶促反应中存在时，已与蛋白质中的-SH和生成的CoA-SH中的-SH发生了反应，消耗了大量-SH基团，因而在最终加入CPM检测CoA-SH含量时，荧光信号对TSI-01的浓度有剂量依赖性的变化（图 3C）。虽然TSI-01确实具有LPAFAT抑制作用（图 2C），但图 3C中荧光信号的减弱却并非由于该化合物的LPAFAT抑制活性所引起。Tarui等[12]在筛选LPCAT2抑制剂时，从化合物库中的174 131个化合物库中筛选的第一步，使用的正是这种方法。他们在后续筛选中采用了LC/MS/MS方法，但正是由于第一步筛选方法的失误，造成最终筛选出来的十数个化合物虽然具有LPAFAT活性，其IC50可低至0.13 μmol/L，但这些化合物的母核均是马来酰亚胺。这批化合物除了与CoA-SH反应外，均可非特异性的与蛋白质中的-SH反应，因而不具有成药性。
荧光信号具有灵敏度高，易于显影和定量的特点，因而荧光基团标记底物用于检测酶活性或筛选酶的抑制剂也逐步被广泛采用[15-16, 18-19]。但荧光基团标记底物后改变了底物的天然结构，可能造成酶与底物的结合并不符合天然状态。由于市面上没有荧光标记的Lyso PAF销售，我们采用易于购买的NBD标记的Lyso PC。Lyso PC与Lyso PAF的结构非常相似，两者的差别仅在于甘油骨架的Sn-1位所连接基团的化学键，Lyso PAF的Sn-1位为醚键而Lyso PC的Sn-1位为酯键（图 1A）。以NBD-Lyso PC和乙酰CoA为底物，可以测定LPAFAT的活性（图 4）。采用这种方法可见TSI-01对LPAFAT具有抑制作用（图 4A），但并无LPAFAT抑制活性的硝酸咪康唑也可以抑制产物NBD-PAF类似物的生成，且呈剂量依赖性（图 4B）。用荧光标记底物建立酶促反应，检测荧光标记产物的分析方法，有可能对酶的催化活性或抑制剂的筛选造成误判。硝酸咪康唑即是一种假阳性抑制剂。
由于蛋白质的乙酰化反应可产生大量的CoA-SH，干扰了对LPAFAT活性的正确判断，因此通过产物CoA-SH的含量测定LPAFAT活性的方法虽然具备良好潜力，但也存在严重缺陷，仍需进一步优化。
用荧光标记底物建立酶促反应，通过产物NBD-PAF（类似物）的荧光强度可用于LPAFAT活性检测及抑制剂的筛选。该方法对酶的催化活性或抑制剂的筛选可能有误判，因此应慎重对待实验结果。由于成本低，易于操作，在化合物的早期初筛时可采用此办法。
用天然结构的底物Lyso-PAF和乙酰CoA建立酶促反应，通过LC/MS/MS测定产物PAF的含量，是判断LPAFAT活性或筛选其抑制剂的最佳方法，可作为最终判定的依据，但价格昂贵。
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