2020, Vol. 47
自1972年Rubler等首次报道糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）以来，众多研究表明DCM是一种独立于高血压、冠心病的特异性心肌病，其发病率高、危害性大[1]。DCM的病理生理机制尚不清楚，代谢紊乱、氧化应激、微循环障碍、心肌纤维化等先后被证实参与了其病理生理过程，其中炎症反应起到关键作用[2]。研究发现，在临床上糖尿病合并心衰患者以及DCM动物模型中，肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α, TNF-α）、白介素-6（interleukin 6，IL-6）、IL-1β、IL-37、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎症小体、单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）、血管内皮黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1）、细胞内黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）、诱导型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）等多种炎性介质表达升高[3]。早期的炎症反应是应对高糖损害的保护性反应，若高糖损害持续存在，慢性化的炎症反应最终将导致心肌细胞肥厚、凋亡以及心肌组织纤维化[3]。
炎症小体是一组参与多种疾病炎症、免疫和代谢异常进程的蛋白复合体，可识别多种微生物、应激和损伤信号，激活caspase-1，诱发一系列前炎症因子的活化和一种特殊的细胞程序性死亡——细胞焦亡[4]。常见的炎症小体包括NLRP1、NLRP2、NLRP3、NLRP6、NLRP7、NLRC4（NOD-like receptor family CARD domain containing 4）和AIM2（absent in melanoma 2），其中最为重要的是NLRP3炎症小体[5]。既往许多研究已发现NLRP3炎症小体及其组分、IL-1β和IL-18等炎症因子在DCM动物心肌组织中明显升高[6]。NLRP3基因沉默后相关炎症因子表达明显降低，心脏炎症、细胞凋亡、心肌纤维化和超声结构的异常明显改善[6]。这些研究表明NLRP3炎症小体在DCM的发生中发挥关键作用。本文主要就近年来对NLRP3炎症小体在DCM中的作用机制研究进行综述。
NLRP3炎症小体的分子结构 NLRP3是模式识别受体中NLRs（nucleotide-binding and oligomerization domain-/NOD-like receptors）家族的一员，由1 016个氨基酸组成，包括NACHT结构域[NAIP (NLR family, apoptosis inhibitory protein)、CIITA (class Ⅱ, major histocompatibility complex, transactivator)、HET-E (plant het gene product involved in vegetative incompatibility)、TP-1 (telomerase-associated protein 1)]、亮氨酸重复序列(C-terminal leucine-rich repeats，LRRs)及PYD结构域(pyrin domain) 3个部分[6]。NLRP3的产生依赖于NF-κB通路，这一通路同时也是DCM其他多条炎症信号通路必需的关键环节[3]。当细胞接受相关刺激信号后，抑制NF-κB的蛋白激酶被降解，NF-κB转移至细胞核，上调NLRP3、pro-IL1β、pro-IL-18等基因表达。表达的NLRP3出细胞核，受到细胞内特定的信号刺激后发生寡聚化，其PYD结构域与含CARD(C-terminal caspase recruitment domain)结构域的凋亡相关颗粒样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD, ASC)的PYD结构域结合，ASC的CARD结构域再和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1前体(pro-cysteinyl aspartate specific proteinase-1, pro-caspase-1)的CARD结构域结合，从而使NLRP3、ASC和pro-caspase-1三者构成了完整的NLRP3炎症小体而激活[7]。
NLRP3炎症小体在DCM中介导的炎症信号通路 IL-1β、IL-18炎症因子的表达以及活化需要两大步骤：调控NLRP3和pro-IL-1β、pro-IL-18表达的起始步骤，以及装配NLRP3炎症小体，激活caspase-1后剪切pro-IL-1β、pro-IL-18至活性形式的激活步骤（图 1）。
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| 图 1 NLRP3炎症小体的起始步骤与激活步骤 Fig 1 The priming step and activation step of NLRP3 inflammasome |
起始步骤 NLRP3表达依赖于NF-κB通路，这也是多条炎症信号介导心肌组织炎症反应的共同通路。但NLRP3产生的起始步骤尚未研究清楚，已知高糖和高脂介导的活性氧（reactive oxygen species，ROS）在这一过程中占主要作用，ROS可以由PKC-和Rac1依赖的NADPH氧化酶产生，此外线粒体的功能异常、RAAS系统激活等多种途径也能产生ROS，激活NF-κB信号通路[8]。PAMPs、DAMPs识别PRRs后也可激活NF-κB，导致NLRP3表达的升高[9]。
激活步骤 NLRP3产生后在细胞质内保持未活化状态，需经相关刺激后发生寡聚化[8]，其PYD结构域与ASC的PYD结构域结合，ASC的CARD结构域再和pro-caspase-1的CARD结构域结合，才能构成完整NLRP3炎症小体。许多病原体或宿主来源的配体都能激活NLRP3炎症小体，包括病原相关分子模式、细菌成孔毒素、疟原虫色素、二氧化硅、石棉、紫外线和ATP等[7]。DCM相关的激活途径主要有ROS相关途径，P2X7受体相关途径，溶酶体相关途径以及线粒体功能异常等途径。
ROS相关激活途径 长期高糖和高脂刺激心肌细胞内ROS过度产生，ROS促使细胞内DNA、蛋白等多种成分发生氧化修饰，同时还介导NLRP3炎症小体的聚集和活化[6]。有研究发现ROS能从硫氧还蛋白相互作用蛋白-硫氧还蛋白（thioredoxin interacting/inhibiting protein- thioredoxin，TXNIP-TXN）复合物中解离出TXNIP，游离的TXNIP能调节NLRP3炎症小体的形成和激活[10-11]；瑞舒伐他汀可以通过TXNIP途径抑制NLRP3炎症小体的激活[12]。此外，ROS还可以打开细胞膜的钙离子通道TRPM2导致钙离子内流，激活NLRP3炎症小体[8]。
P2X7受体相关途径 P2X7受体是心肌成纤维细胞膜上的以ATP为配体的离子门控通道，细胞外的ATP刺激该离子通道开放，引发K+外流和泛连接蛋白(pannexin-1)膜通道的形成，胞外各种NLRP3激动剂便能进入胞内, 促进NLRP3炎症小体的聚集和活化[11]。外源性的H3松弛素能够明显减弱P2X7受体介导的NLRP3炎症小体激活，抑制高糖环境下心脏成纤维细胞胶原合成[13]。使用ROS激动剂H2O2和ROS抑制剂NAC都不会影响P2X7受体的表达，提示P2X7受体相关途径可能是独立于ROS途径之外的一条激活通路[13]。
溶酶体相关途径 NLRP3炎症小体的激活存在于痛风、硅肺、动脉粥样硬化、阿尔兹海默症和DCM等多种疾病中，溶酶体的损伤是他们共有的激活通路[14]。细胞外尿酸、结晶体或特殊颗粒被内吞入细胞，导致溶酶体膜透化，溶酶体释放的内容物可促进NLRP3炎症小体的聚集和活化[15]。
线粒体功能异常途径 高糖处理H9C2细胞，可诱导线粒体氧化应激并释放细胞色素C，后者直接作用于NLRP3，促进炎症小体的形成；用传统中药七叶胆甙可以抑制ROS的产生，以及NLPR3的激活；进一步用细胞色素A（细胞色素C的抑制物）也能明显抑制NLRP3炎症小体活化[9]。线粒体膜稳定性被破坏以后还能释放ROS、线粒体DNA、心磷脂进一步激活NLRP3炎症小体[16]。
其他激活方式 在巨噬细胞中，胆固醇结晶可通过诱导溶酶体损伤的途径激活NLRP3炎症小体[17]。氧化的低密度脂蛋白胆固醇与细胞膜上的CD36相互作用，能促进细胞内可溶物向结晶体的转化，导致溶酶体损伤和破裂[18]。ATP、尼日利亚菌素、刺尾鱼毒素等则可以通过P2X7受体途径，促进ROS生产、钾离子外流激活NLRP3炎症小体[19]。低钾也是参与NLRP3炎症小体激活的可能因素，当细胞内钾离子浓度低于90 mmol/L时，NLRP3炎症小体会自动生成，而高钾时这一过程被抑制。二氧化硅、铝盐等同样也可激活NLRP3炎症小体[7]。然而，这些途径大部分存在于巨噬细胞、血管内皮细胞中，而心肌细胞、心肌成纤维细胞内是否存在这些激活途径还有待进一步验证。
NLRP3炎症小体在DCM发生发展中介导的效应
炎症反应 NLRP3炎症小体形成后，募集并诱导pro-caspase-1自我剪切为活化的caspase-1。活化的caspase-1将pro-IL-1β、pro-IL-18剪切为具有活性的IL-1β、IL-18。IL-1β是一种重要的促炎因子，通过激活IL-1R下游信号通路，诱发一系列炎症反应。用NLRP3-miRNA干预后，心肌组织中IL-1β、IL-18的水平明显降低[6]。
细胞焦亡 caspase-1在剪切pro-IL-1β、pro-IL-18的同时，还能联合其他相关的caspase（如caspase-11），触发gasdermin D(GSDMD)的N端寡聚化，使细胞质膜孔道形成，诱发特殊细胞程序性死亡——细胞焦亡[4]。细胞焦亡是依赖于caspase-1的死亡方式，细胞膜孔道形成和细胞核DNA断裂是细胞焦亡启动后两个明显的特征，细胞膜孔道形成有利于细胞外基质的内渗和细胞内炎症因子的外溢，最终导致细胞肿胀破裂和局部的炎症反应。高糖刺激的大鼠心肌细胞中可见caspase-1高表达，心肌细胞出现细胞器肿胀，细胞核DNA断裂等的细胞焦亡特征性改变，用NLRP3基因沉默技术可以有效抑制caspase-1在体内和体外水平的活化，减轻细胞器肿胀和DNA损伤，抑制细胞焦亡[6]。
心肌纤维化 NLRP3炎症小体激活也参与心肌纤维化病理生理过程。在DCM的病理情况下，这条信号通路被激活，心肌成纤维细胞会在IL-18、IL-1β等炎症产物的长期刺激下合成大量的Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原，导致过度的胶原堆积、心肌组织纤维化和心脏重构[20]，而黄芪夹苷便可通过抑制NLRP3炎症小体的激活途径，减少胶原的合成达到抗心肌纤维化的目的[21]。研究发现心肌成纤维细胞接受TGF-β刺激后，NLRP3表达也会升高，提示NLRP3参与了心肌纤维化过程[22]。NLRP3炎症小体在DCM纤维化过程中的具体分子机制还有待进一步探究。
对NLRP3炎症小体通路的负调控研究
抑制NLRP3炎症小体信号通路的起始步骤 瑞舒伐他汀可以通过抑制TXNIP来降低NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β的mRNA表达，改善肌纤维紊乱和线粒体肿胀[12]。外源性的硫化氢可以通过抑制TLR4/NF-KB通路，从而抑制心肌细胞NLRP3炎症小体激活[23]。钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂达格列净也可以明显降低NLPR3炎症小体相关成份基因表达，提高糖尿病小鼠心功能[24]。
抑制NLRP3炎症小体信号通路的激活步骤 H3松弛素是胰岛素样生长因子超家族的一员，能通过减弱ROS和P2X7受体介导的NLRP3炎症小体激活，抑制高糖环境下心肌成纤维细胞胶原合成[13]。传统的中药七叶胆甙干预高糖环境下的H9C2细胞后，细胞质ROS和细胞色素C释放水平下调，NLRP3炎症小体激活被抑制，CRP、IL-1β、IL-18炎症因子水平明显降低[9]。Nrf2激活剂是一种主要的内源性抗氧化酶调节物质，有研究发现外源性的Nrf2激活剂叔丁基对苯二酚能通过上调NADPH醌脱氢酶，使ROS产生减少，进而抑制NLRP3的激活[25]。传统中药苦参碱具有抗氧化和抗炎作用，能减缓晚期糖基化终末产物诱导的内皮细胞损伤；研究发现，使用苦参碱干预内皮细胞后，NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β的水平均有所下降，而其能否抑制心肌细胞或心肌纤维细胞的NLRP3炎症小体通路还待进一步研究[26]。
结语 NLRP3炎症小体是近几年被发现参与炎症反应、细胞焦亡过程的一种蛋白复合体，可能在DCM病理生理过程中发挥重要作用。深入研究NLRP3炎症小体在DCM过程中的激活分子机制，有助于完善DCM病理生理机制，为DCM的防治提供新的干预靶点。
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