2020, Vol. 47
2. 上海市女性生殖内分泌相关疾病重点实验室 上海 200011
2. Shanghai Key Laboratory of Female Reproductive Endocrine Related Diseases, Shanghai 200011, China
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种发生在老年期或老年前期的慢性神经系统退行性疾病，其病理学基础为神经细胞凋亡，典型病理学改变之一为细胞外出现淀粉样斑块沉积[1]。β－淀粉样蛋白（amyloid beta，Aβ）是淀粉样斑块的主要成分，其25~35片段即Aβ25-35是Aβ的主要毒性片段[2]。
PI3K/Akt信号通路作为调控凋亡的经典信号通路之一，在AD等神经退行性疾病的发生、发展及治疗中也具有重要价值[3]，外界信号可通过PI3K/Akt信号通路激活下游bcl-2家族发挥神经保护作用、减轻神经细胞凋亡及抑制Tau蛋白过度磷酸化[4-5]。PI3K/Akt信号通路可同时介导植物类雌激素和相关中药制剂的神经保护作用[6]。雌激素在AD的发病及治疗中占有重要位置[7]，雌激素受体（estrogen receptor，ER）是雌激素作用的关键配体，存在ERα和ERβ两种亚型，在海马组织区中高表达的ERβ可发挥重要的神经保护作用[8]。
复旦大学附属妇产科医院李超荆、俞瑾及曹玲仙教授根据中医理论及多年临床实践经验，以滋肾柔肝、清心泻火为治则制成补肾为主的中药更年春方（Gengnianchun formula，GNC），临床应用显示其可改善围绝经期女性大脑功能，增强记忆力[9]。既往实验发现，GNC可提高去势大鼠的学习及记忆能力[10-11]、抑制凋亡相关基因表达[12]、良性调节脑内海马区各神经细胞层细胞形态及排列结构[13]、上调海马区ERβ的转录及表达[13]，同时可抑制Aβ诱导的具有典型神经特性的PC-12细胞（肾上腺嗜铬细胞瘤细胞）凋亡[12]并明显提高PC-12细胞中ERβ表达[14]。
本实验用原代培养的大鼠胎鼠海马神经细胞构建AD体外模型，观察中药GNC通过ERβ及PI3K/Akt信号通路对Aβ25-35致其损伤的保护作用。
材料和方法主要实验试剂及仪器 DMEM/F12培养基、NeurobasalTM培养基、B27添加剂、GlutaMAXTM、多聚赖氨酸及胎牛血清购自美国Gibco公司。Aβ25-35购自美国Sigma-Aldrich公司，MEM培养基、F12培养基、丙酮酸钠、非必需氨基酸添加剂（NEAA）购自美国Invitrogen公司，PHTPP（选择性ERβ拮抗剂）购自美国MedChemExpress公司，Hoechst33258/PI荧光染料购自美国Abbkine公司。CCK-8试剂盒、LDH检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。兔抗大鼠细胞色素C(cyt-c)抗体(ab133504)、bax抗体(ab32503)、bcl-2抗体(ab196495)购自美国Abcam公司，兔抗大鼠cleaved-caspase-3抗体(#9662)、p-Akt抗体(4060T)、Akt抗体(C67E7)以及抗兔tublinIgG抗体（7074）购自美国CST公司。
HF-90二氧化碳培养箱（Heal Force）、细胞计数仪（美国Bio-Rad公司）、酶标仪（美国Thermo公司）、LAS-4000mini成像系统（美国GE公司）、PCR仪（美国Biosystems公司）、分光光度计（美国Biotek公司）、正置显微镜（日本Olympus公司）及倒置荧光显微镜（日本NIKON公司）由上海市女性生殖内分泌相关疾病重点实验室提供使用。
SH-SY5Y细胞培养及大鼠胎鼠海马神经元的原代培养 用于提取大鼠胎鼠海马神经元的6周龄清洁级雌性孕16~18天SD大鼠购自上海斯莱克实验动物中心。SH-SY5Y细胞系（人神经母细胞瘤细胞系）购自中国科学院上海细胞库。
SH-SY5Y细胞培养于完全培养液（含MEM、F12培养基及GlutaMAX、丙酮酸钠、NEAA、10% FBS）及37 ℃、5%CO2的培养箱中，2~3天传代一次，待细胞进入对数生长期后用于实验。
大鼠胎鼠海马神经元的提取及原代培养如下：10%水合氯醛腹腔麻醉孕鼠，全程无菌低温分离出大鼠胎鼠海马区脑组织，细致剪碎后37 ℃恒温箱内胰酶消化20 min, 终止消化后轻轻吹打静置，获得悬浮细胞上清液，通过无菌筛网过滤获得海马神经元单细胞悬浮液。细胞悬液离心（1 000×g, 5 min)后去上清，重新悬浮后进行细胞计数。将所获细胞接种于预先使用多聚赖氨酸包被过的细胞培养板中，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养。离体种板后第1天（DIV1）更换含2% B27、无血清NeurobasalTM及GlutaMAX的完全培养基。此后每2~3天半量更换完全培养基，体外培养的大鼠胎鼠海马神经元在离体种板后第7天（DIV7）后可用于实验。
去势大鼠更年春方含药血清（GS）、空白血清（NS）及Aβ25-35的制备 取雌性3月龄SD大鼠43只，10%水合氯醛腹腔麻醉后行去势手术。术后第7天起，于每日早晚6时行大鼠阴道涂片, 检查是否去势完全。排除不符合条件和死亡的动物。剩余大鼠随机分为GS组及NS组，GS组每日2次予GNC溶液灌胃，灌胃剂量按体表面积公式计算，相当于成人每千克体重剂量的10倍（1.25 g GNC颗粒/天），将25 g GNC颗粒溶解在100 mL生理盐水中，每日使用2.5 mL GNC溶液。给予NS组大鼠相同体积的生理盐水，持续5天。末次灌胃后1 h于股动脉取血，无菌分离血清，－80 ℃冻存待用。采用去势大鼠制备GS的目的是模拟处于低雌激素水平下发生AD的围绝经期后女性服用GNC后的血清药物水平，同时可以避免雌激素对于实验结果的可能的影响。
将Aβ25-35溶解在PBS中，配置浓度为100 μmol/L的储备液。37 ℃下恒温震荡处理72 h后获得寡聚态Aβ25-35片段，－80 ℃冻存待用。
含药血清及Aβ25-35培养神经细胞的有效浓度及时间摸索 96孔板中培养至80%~90%密度的SH-SY5Y细胞经饥饿过夜后分别加入GS或NS，每组血清设3个浓度，分别为5%、10%和20%，另设一组不加入血清细胞孔的为无血清对照组，37 ℃、5% CO2培养4、12、24 h后每孔加入20 μL CCK-8溶液，继续孵育1 h后于450 nm波长测定各孔吸光度值。同上法检测5 μmol/L、10 μmol/L Aβ25-35处理6、12、24 h后各孔吸光度值。
同上将SH-SY5Y细胞种板，将其分为无血清对照组、模型组及不同浓度的GS组，GS血清设3个浓度，分别为5%、10%和20%，处理4 h后去除含血清培养基，用10 μmol/L Aβ25-35继续处理24 h。到预定检测时间后每孔加入20 μL CCK-8溶液，继续孵育1 h后于450 nm波长测定各孔吸光度值。各组细胞重复如上步骤进行处理，到预定检测时间后各孔分别加入60 μL LDH检测工作液，室温避光孵育30 min，于490 nm波长测定吸光度值，计算各组细胞毒性值。
大鼠胎鼠海马神经元分组及处理方法 大鼠胎鼠海马神经元DIV7后分为无血清对照组、模型组、GS组和NS组，无血清对照组不进行任何处理，模型组用10 μmol/L Aβ25-35处理24 h，GS组及NS组分别用5% GS或5% NS处理4 h后去除含血清培养基，换用10 μmol/LAβ25-35继续处理24 h。
形态学观察、CCK-8及LDH释放实验 大鼠胎鼠海马神经元接种到96孔板（5×105/孔）中，DIV7后分组，分组及各组处理方法同前。到预定检测时间后每孔加入20 μL CCK-8溶液，继续孵育1 h后于450 nm波长测定各孔吸光度值。重复如上步骤进行各组细胞处理，到预定检测时间后各孔分别加入60 μL LDH检测工作液，室温避光孵育30 min，于490 nm波长测定吸光度值，计算各组细胞毒性值。正置显微镜下观察各组细胞形态。
Hoest33258/PI双重荧光染色实验 大鼠胎鼠海马神经元接种在置于24孔培养板中的无菌盖玻片上（1.0×105/孔），DIV7后分组，分组及各组处理方法同前。每孔用无菌PBS洗涤后依次使用10 μg/mL Hoechst33258荧光染料及10 μg/mL PI荧光染料避光室温孵育15 min，每次去除荧光染液时用PBS洗3次，每次5 min。每孔用预冷4%多聚甲醛固定15 min，去除固定液，用PBS洗3次，每次5 min。将盖玻片取出，倒扣于已滴抗荧光淬灭封片剂载玻片上密封。Hoechst33258被活细胞摄取后，可以与细胞核内的DNA结合，经过紫外光激发而产生蓝色荧光。而PI使凋亡细胞着染产生红色荧光。倒置荧光显微镜下观察、采集图像并计数。
qRT-PCR及Western blot实验 大鼠胎鼠海马神经元接种于6孔培养板中（5.0×105/孔），DIV7后分为无血清对照组、模型组、GS组、NS组和PHTPP组。PHTPP组使用0.1 μmol/L PHTPP预处理24 h后，再使用5% GS处理4 h，去除含血清培养基，换用10 μmol/L Aβ25-35继续处理24 h，其余4组处理方法同前。每组分别使用Trizol法提取总RNA，逆转录为cDNA。使用10 μmol/L反应体系行qRT-PCR实验，体系含5 μL的SYBR Premix Ex Taq Ⅱ，0.4 μL的PCR正向引物和0.4 μL的PCR反向引物，0.2 μL的RoxII，1 μL的cDNA模板和3 μL的ddH2O。反应条件为：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，40个循环；95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s。所用的引物序列如下：Bax：5’-AGACACCTGAGCTGACCTTGGAG-3’、5’-GTTG-AAGTTGCCATCAGCAAACA-3’；Bcl-2：5’-TG-AACCGGCATCTGCACAC-3’、5’-CGTC-TTC-AGAGACAGCCAGGAG-3’；Cyt-c：5’-GGACG-TCTCCCTAAGAGTCTGATCC-3’、5’-GGAGGTTTGGTCCAGTCTTATGCT-3’；GAPDH：5’-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3’、5’-A-TGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3’。
同上种板及分组处理大鼠胎鼠海马神经元，提取各组蛋白后测定蛋白浓度，使用15 μL/30 μg的蛋白体系，利用蛋白上样缓冲液及PBS配制蛋白样本，100 ℃处理10 min使蛋白样本失活。上样后恒压120 V进行电泳，直到溴酚蓝电泳到达胶底。剪裁大小合适的提前使用甲醇激活的PVDF膜及滤纸，依次置于转膜夹内，排空气泡。恒定电流转膜后剪裁目的条带。BSA室温封闭条带1 h。封闭好的PVDF膜4 ℃放孵育一抗过夜。TBST洗膜。室温下孵育二抗1 h，TBST洗膜。LAS-4000mini成像系统曝光条带。使用的各抗体稀释倍数如下：Cleaved-caspase 3为1:1 000、Bax为1:1 000、Bcl-2为1:1 000、Cyt-c为1:5 000、p-Akt为1:2000、Akt为1:1 000、tublin为1:1 000。
统计学方法 实验结果数据用x±s表示，采用单因素方差分析（ANOVA）和最小显著差法（LSD法）进行数据统计，双侧P < 0.05为差异有统计学意义。
结果GS及Aβ25-35培养SH-SY5Y细胞系的有效浓度及时间分析 如图 1所示，5% GS处理4 h即可使SH-SY5Y细胞系细胞活力显著增加，较无血清对照组及NS组差异均有统计学意义（P < 0.05），且5%、10%及20% GS分别处理4、12及24 h后，SH-SY5Y细胞系的细胞活力较无血清对照组及NS组显著增加，差异均有统计学意义（P < 0.05）。分别对比相同GS处理浓度下4、12及24 h 3个时间点的SH-SY5Y细胞系细胞活力发现，随处理时间延长，细胞活力显著增加（P < 0.05）。GS处理24 h后，随GS浓度升高，SH-SY5Y细胞系的细胞活力升高，较无血清对照组及NS组差异均有统计学意义（P < 0.05），显示GS对SH-SY5Y细胞系具有保护作用且存在时间依赖性，于处理24 h时间点显示出浓度依赖性。
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| (1)vs.control group, P < 0.05;(2)vs.NS group, P < 0.05;(3)P < 0.05. 图 1 不同培养浓度GS及Aβ25-35各时段对SH-SY5Y细胞系细胞活力的影响 Fig 1 Effect on cell viability of SH-SY5Y cell of different concentrations of GS and durations of Aβ25-35 |
Aβ25-35处理浓度越高，时间越长，SH-SY5Y细胞系的细胞活力越低（P < 0.05），显示Aβ25-35对SH-SY5Y细胞系具有神经损伤作用, 且存在时间及浓度依赖性。为增加造模成功率，后续选择10 μmol/L Aβ25-35处理大鼠胎鼠海马神经元24 h构建AD的体外模型。
如图 2所示，在处理4 h时，GS浓度越高，Aβ25-35处理后SH-SY5Y细胞系细胞活力越高，细胞释放LDH水平越低，显示GS对Aβ25-35所致的SH-SY5Y细胞损伤具有保护作用且存在浓度依赖性。最低5%浓度GS即可对10 μmol/L Aβ25-35所致神经细胞损伤产生保护作用。本次实验为提高实验效能，采用5%浓度GS、处理4 h的处理条件。
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| (1)P < 0.05. 图 2 不同培养浓度GS处理4 h对Aβ25-35作用后的SH-SY5Y细胞系细胞活力影响 Fig 2 Effect of different concentrations of GS for 4h on SH-SY5Y cell viability induced by Aβ25-35 |
GS对Aβ25-35诱导的大鼠胎鼠海马神经元损伤的保护作用 正置显微镜下观察大鼠胎鼠海马神经元形态变化显示，大鼠胎鼠海马神经元在贴壁前表现为周围带少量光晕的同心圆形状悬浮细胞，细胞随后在24 h内贴壁，自DIV1起逐渐出现神经突触的生长及延伸，神经元体积逐渐变大，相互间通过树突连接形成神经网络（图 3A-C）。
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| 图 3 正置显微镜下大鼠胎鼠海马神经元形态学观察 Fig 3 Morphological observation of primary cultured rat fetal hippocampal neurons through positive microscope |
与无血清对照组相比，模型组内神经元胞体和突触的收缩及崩解明显，可见明显的细胞碎片（图 3D、3E）。与模型组及NS组相比，GS组神经元胞体和突触的收缩及崩解减少，细胞碎片减少（图 3F、3G）。
如图 4所示，与无血清对照组相比，模型组大鼠胎鼠海马神经元的细胞活力明显下降（P < 0.05），GS组细胞活力明显增加，相较于NS组及模型组差异均有统计学意义（P < 0.05）。模型组细胞的LDH释放较无血清对照组显著增加（P < 0.05），GS组细胞的LDH释放显著下降，相较于NS组及模型组差异均有统计学意义（P < 0.05）。
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| (1)P < 0.05. 图 4 GS对Aβ25-35作用后的大鼠胎鼠海马神经元细胞活力及对LDH释放的影响 Fig 4 Effect of GS on primary cultured rat fetal hippocampal neurons injury induced by Aβ25-35 and LDH release tests |
GS对Aβ25-35诱导的大鼠胎鼠海马神经元凋亡的抑制作用 如图 5所示，与无血清对照组相比，模型组PI阳性细胞数量显著增加（P < 0.05），GS组PI阳性细胞数量较NS组及模型组均显著下降（P < 0.05）。
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| (1)P < 0.05. 图 5 GS对Aβ25-35作用后的大鼠胎鼠海马神经元Hoechst33258/PI荧光表达的影响 Fig 5 Hoechst33258/PI double strain of primary cultured rat fetal hippocampal neurons apoptosis after treated with GS and Aβ25-35 |
如图 6所示，与无血清对照组相比，模型组bax/bcl-2 mRNA及cyt-c mRNA水平显著上升（P < 0.05），GS组bax/bcl-2 mRNA及cyt-c mRNA水平较NS组及模型组显著降低（P < 0.05），PHTPP组bax/bcl-2 mRNA及cyt-c mRNA较GS组表达显著上升（P < 0.05），与模型组比较差异无统计学意义。
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| (1)P < 0.05. 图 6 GS对Aβ25-35作用后的大鼠胎鼠海马神经元转录水平及蛋白表达水平的影响 Fig 6 Related mRNA and protein level of primary cultured rat fetal hippocampal neurons after treated with GS and Aβ25-35 |
模型组bax/bcl-2、cyt-c和cleaved-caspase 3的蛋白表达水平较无血清对照组显著上升（P < 0.05），GS组bax/bcl-2、cyt-c和cleaved-caspase 3的蛋白表达水平较NS组及模型组显著降低（P < 0.05）。模型组中p-Akt水平较无血清对照组显著降低（P < 0.05），GS组p-Akt蛋白表达水平较NS组及模型组显著上升（P < 0.05）。PHTPP组相较于GS组bax/bcl-2、cyt-c及cleaved-caspase 3蛋白表达水平显著上升（P < 0.05），相较于模型组差异无统计学意义。此外，PHTPP组相较于GS组p-Akt蛋白表达水平显著下降（P < 0.05），较模型组差异无统计学意义。
讨论女性随着卵巢功能衰退、全身器官衰老，学习及记忆能力会出现明显减退，严重者甚至发展为AD。中医学将衰老定义为生理性肾虚，包括AD在内的中枢神经退行性疾病的发生发展与衰老密切相关，故以补肾为主的中医学治法在延缓衰老、防治AD中显得尤为重要。本课题组既往临床研究表明，补肾为主的中药GNC可明显提升围绝经期女性记忆商[9]，且可以提高去势大鼠学习及记忆能力[10]。进一步探究其分子机制发现，GNC可能通过抑制凋亡相关基因及介导凋亡相关信号通路发挥作用[13]。
神经细胞凋亡是AD患者出现记忆丧失及认知功能障碍等临床表现的病理学基础，与AD的发生发展密切相关。研究显示，与凋亡发生密切相关的PI3K/Akt信号通路、caspase和bcl-2基因家族也在AD等神经退行性疾病发生及治疗中显示出重要价值。PI3K/Akt信号通路的激活可以保护神经元免受Aβ诱导的神经毒性作用[4], 抑制Akt的磷酸化可以加重AD患者认知及记忆损伤[15]。与之相反，上调Akt表达能显著抑制Aβ1-42引起的bax表达上调，改善Tau蛋白过度磷酸化[5]，从而抑制凋亡。除此之外，PI3K/Akt信号通路也被证实可以介导植物雌激素和相关中药制剂对Aβ25-35诱导的神经损伤的保护作用[6]。相关研究显示，Aβ的出现与脑内海马区caspase-3的激活密切相关，caspase-3激活后可进一步引起凋亡级联反应，最终使AD患者出现相应临床症状。bcl-2基因家族位于caspase家族上游，可通过抑制caspase-3等蛋白的合成发挥抑制凋亡及神经保护作用。去势大鼠海马神经元中bax表达上升、bcl-2表达下降，使得海马神经细胞凋亡增加[16]。本课题组前期动物实验研究发现，GNC可显著抑制AD模型小鼠即APP/PS1双转基因小鼠脑组织内的神经元凋亡[17]，此作用可能通过上调bcl-2表达和降低bax表达实现[14]。
除PI3K/Akt信号通路可能在AD发生、发展及治疗中占据重要地位外，ER尤其是ERβ可能也在其中发挥重要作用。ERβ可通过介导雌激素的作用对学习记忆及认知能力产生良性调节[18], 同时选择性ERβ受体激动剂也可通过非雌激素依赖途径直接改善AD的病理表现及临床症状[19]。与以上研究结果相似，本课题组前期相关研究表明，GNC改善女性认知功能障碍的机制除可能与抑制凋亡相关基因及相关信号通路有关外，也可能与ER尤其是ERβ存在联系[12-14]。GNC可以通过选择性增加大鼠海马组织中ERβ mRNA和蛋白的表达来改善大鼠的学习和记忆能力[13]。利用PC-12细胞系构建AD体外模型进行的相关实验表明，GS可以增强PC-12细胞活力，抑制Aβ诱导的PC-12细胞早期凋亡，并能明显提高PC-12细胞中ERβ的表达[12, 14]。
因海马与学习记忆有关，AD病理改变最严重的脑区之一是海马，使用更贴近AD发病机制及病理变化的原代培养的大鼠胎鼠海马神经元构建AD体外模型更为理想。在本次实验中，我们利用Aβ25-35作用原代培养的大鼠胎鼠海马神经元构建AD体外模型，通过对凋亡相关关键分子、PI3K/Akt信号通路关键分子p-AKT的检测，探究GNC对Aβ25-35致神经细胞损伤的保护作用，并探究此作用与ERβ和PI3K/Akt信号通路之间的关系。
本次实验结果显示，5% GS处理4 h即可使SH-SY5Y细胞系细胞活力显著增加，较无血清对照组及NS组均存在显著统计学差异，且5%、10%及20% GS分别处理4、12及24 h后，SH-SY5Y细胞系细胞活力较无血清对照组及NS组均显著增加。本课题组既往曾使用PC-12细胞系探究GS培养神经细胞的有效浓度及时间，最终实验结果为采用20% GS作用PC-12细胞系24 h后，细胞活力较无血清对照组及空白血清对照组显著增加，但采用5%或10% GS分别作用PC-12细胞系24 h后，细胞活力与无血清对照组及空白血清对照组比较无显著差异。原因可能是PC-12细胞系来源于肾上腺的嗜铬细胞瘤细胞系，虽然具有一定的神经细胞特性，但不能真正代表有学习及记忆特性的海马神经元，并且既往采用PC-12细胞系摸索GS处理浓度的实验中没有设置4 h及12 h两个时间点，故不能明确在处理4 h或12 h两个时间点下GS的作用。所以本次实验中未参照既往采用PC-12细胞系摸索的GS处理条件，而重新进行了设计。由于真正的海马神经元获得不易且不能传代，不宜做摸索浓度使用，因此采用了更加贴近大鼠胎鼠海马神经元的神经特性的SH-SY5Y细胞系摸索GS及Aβ25-35的处理条件，为提高本次实验效能，还采用了最低有效浓度及最短有效处理时间。同时, 本次实验研究结果显示，GS对SH-SY5Y细胞系具有保护作用，且该保护作用存在时间依赖性，虽然在处理4 h及12 h两个时间点处未显示浓度依赖性，但在处理24 h时间点处显示出浓度依赖性，可提示GS对神经细胞的保护作用。为何在4 h及12 h时间点处未显示浓度依赖性有待后续进一步研究。
本实验结果显示，GS可显著下调大鼠胎鼠海马神经元凋亡相关关键分子bax/bcl-2、cyt-c转录水平，显著下调bax/bcl-2、cyt-c和cleaved-caspase 3蛋白表达水平，显著上调其p-Akt的蛋白表达水平，表明GNC可以抑制大鼠胎鼠海马神经元凋亡，且此作用可能依赖于PI3K/Akt信号通路，但是否通过其他信号通路介导需要进一步研究。本实验同时显示，ERβ抑制剂PHTPP可阻断GS下调大鼠胎鼠海马神经元凋亡相关关键分子bax/bcl-2、cyt-c转录水平及bax/bcl-2、cyt-c和cleaved-caspase 3蛋白表达水平的作用，表明GNC抑制大鼠胎鼠海马神经元凋亡的作用除可能依赖于PI3K/Akt信号通路外，也依赖于ERβ介导。
近期ERβ与PI3K/Akt信号通路在神经退行性疾病发生发展中的交互作用也是研究的热点，PI3K/Akt信号通路除可能在AD相关细胞凋亡中起重要作用外，也可能参与了ER的非基因组作用。选择性ERβ调节剂二芳基丙腈可通过增加Akt磷酸化起到保护神经元免受Aβ1-42诱导的神经毒性的作用。中药人参皂苷Rg1可以通过雌激素受体及MAPK/ERK、PI3K/Akt信号转导通路促进APP的非淀粉样蛋白切割，从而起到神经保护作用。一些体外研究[20-22]进一步表明，ERβ-PI3K/Akt信号通路可以介导对帕金森病等神经退行性疾病模型的细胞保护作用。
基于此，我们在本次研究中也对ERβ与PI3K/Akt信号通路的交互作用进行了初步验证。实验显示，ERβ抑制剂PHTPP可阻断GS上调大鼠胎鼠海马神经元p-Akt蛋白表达水平的作用，阻断GS通过PI3K/Akt信号通路介导的抑制大鼠胎鼠海马神经元凋亡作用，除再次表明GS抑制大鼠胎鼠海马神经元凋亡的作用可能依赖于ERβ介导外，也提示了ERβ在信号通路转导中可能位于PI3K/Akt信号通路的上游位置。
综上所述，GNC对Aβ25-35致大鼠胎鼠海马神经元的损伤具有保护作用，ERβ和PI3K/Akt信号通路是介导GNC神经保护作用的关键途径或至少是关键途径之一。为补肾为主中药保护神经细胞损伤、防治AD提供了实验依据。
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