2020, Vol. 47
2. 中国农业科学院上海兽医研究所 上海 200241
2. Shanghai Veterinary Research Institute, Chinese Academic of Agricultural Sciences, Shanghai 200241, China
支气管哮喘发病率高，病毒感染可导致哮喘的急性发作，如鼻病毒（rhinovirus，RV）、呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）、流感病毒（influenza，FLU）等，但病毒感染导致哮喘急性发作的机制目前仍不清楚[1]。IL-33是新近发现的IL-1家族成员，能作用于IL-1受体家族孤儿受体ST2而发挥生物学效应[2]。无过敏源刺激的情况下，激动哮喘易感基因，可观察到诱导性IL-33升高和后续肺内嗜酸性粒细胞（eosinophils, EOS）的聚集[3]。IL-33可通过诱导T辅助细胞2（T helper 2, Th2）型细胞因子，启动Th2型免疫反应，从而介导哮喘等异质性疾病[4-7]。呼吸道病毒感染也可导致机体分泌IL-33增加，推测阻断IL-33可作为呼吸道病毒感染诱导哮喘急性发作的治疗策略[8]。Saravia等[9]在RSV急性感染新生小鼠模型中检测到肺内2型固有淋巴细胞（type 2 innate lymphoid cell，ILC2）增多、肺匀浆IL-33蛋白分泌增加，UV-RSV感染小鼠或RSV感染成年小鼠（6~8周龄）均未观察到肺内ILC2及肺匀浆IL-33蛋白的变化。FLU急性感染小鼠中也可检测到IL-33及ILC2显著升高，并观察到IL-33结合ILC2表达的ST2，进而刺激ILC2释放Th2型细胞因子（如IL-4、IL-5及IL-13），诱导EOS聚集、气道高反应性等[10]。IL-33在呼吸道病毒感染导致哮喘急性发作的作用机制目前仍不清楚。本研究采用一定浓度的RSV急性感染卵清蛋白(ovalbumin, OVA)诱导的哮喘小鼠，建立哮喘急性发作小鼠模型，并分析IL-33在其中的作用。
材料和方法主要试剂及设备 PBS液、铝佐剂50 mL（美国Thermo公司），DMEM培养基（美国HyClone公司），OVA（美国Sigma公司），胎牛血清FBS（美国Gibco公司），RNA抽提试剂盒RNeasy Mini Kit(50)（德国QIGEN公司），反转录试剂盒、cDNA合成试剂盒（天根生化科技有限公司），real-time PCR试剂盒AceQ qPCR SYBR Green Master Mix（南京诺唯赞生物科技有限公司），小鼠IgE ELISA Ready-SET-Go、小鼠IL-33 ELISA Ready-SET-Go（美国eBioscience公司）。Applied Biosystem 7500荧光定量PCR仪、酶标检测仪（美国Thermo公司），雾化器（日本OMRON公司），TXD3细胞甩片离心机（湘仪实验室仪器公司）。
SPF级雌性BALB/c小鼠购自北京梅里亚-维通实验动物中心。人喉癌上皮细胞系（Hep-2细胞）由上海市公共卫生临床中心提供。RSV A2 LONG株（来源ATCC）由上海公共卫生中心提供。
RSV扩增 于37 ℃、5% CO2的孵箱中用含10% FBS的DMEM培养基培养Hep-2细胞。待细胞长满单层后，将RSV接种于Hep-2细胞，在含2% FBS的DMEM维持液中继续培养。3~5天细胞可出现病变，待病变达到80%时收获病毒，测得50%组织细胞感染浓度（TCID 50）为4.65×106/mL，将病毒冻存于－80 ℃备用。
动物实验设计 将24只3周龄SPF级BALB/c雌性小鼠随机分为PBS组、RSV组、OVA组和OVA/RSV组，每组6只。第0天腹腔注射含1% OVA 5 μL及铝佐剂50 μL的PBS 125 μL或等体积PBS；第7~13天连续7天予以1% OVA或PBS雾化30 min；第14天(即雾化激发结束后第1天)用含5×105 PFU的RSV病毒悬液50 μL或等体积PBS滴鼻小鼠; 第15天（即RSV感染后第1天）用2%戊巴比妥钠麻醉小鼠，心脏取血，处死小鼠（图 1）。取血清测定总IgE蛋白含量；气管插管进行支气管肺泡灌洗，BALF于4 ℃下500×g离心5 min，取上清测定IL-33蛋白，重悬细胞沉淀后进行细胞总数计数及各分类细胞计数；剪取左下肺行病理切片及HE染色；剩余肺组织匀浆后，取100 μL抽提RNA，用real-time PCR检测Th2型细胞因子（IL-5、IL-13）、IL-33及ST2的mRNA表达；取100 μL肺组织匀浆，ELISA法测定IL-33蛋白含量。
|
| I.P.:Intraperitoneally; I.N.:Intranasally. 图 1 RSV感染OVA诱导哮喘急性发作小鼠模型的技术路线图 Fig 1 Experimental protocol timeline of mouse model of RSV acute infection in OVA-induced asthma |
BALF中细胞计数及染色 气管插管行支气管肺泡灌洗。BALF离心(条件同前），收集上清液置于－80 ℃, 用于IL-33蛋白质检测。重悬细胞沉淀，计细胞总数。吸取剩余细胞悬液至甩片机收集孔中，离心即可把细胞转移至玻片上。行瑞氏/吉姆萨染色，根据细胞大小、形态及细胞核的形态，将细胞分成中性粒细胞、巨噬细胞、EOS和淋巴细胞，计算1个高倍镜视野下各细胞比例，再根据细胞总数计算出BALF中各细胞数目。
real-time PCR检测细胞因子 按说明书抽提肺组织总RNA，反转录合成cDNA。PCR反应体系为20 μL（表 1），包括2×AceQ PCR SYBR Green Master Mix 10 μL、ROX Reference Dye 2 0.4 μL、上下游引物各0.4 μL和cDNA模板2 μL。采用荧光定量PCR仪扩增（型号：Applied Biosystem 7500）。PCR反应条件为：95 ℃ 5 min；95℃ 15 s，60 ℃ 45 s，40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95℃ 15 s，60 ℃ 15 s。
| Genes | Primer sequence(5'to3') | |
| mIL-33 | Forward | TGCCTCCCTGAGTACATACA |
| Reverse | CTGGTCTTGCTCTTGGTCTTT | |
| mIL-5 | Forward | TTTGGAGCAGGGTCTTGTG |
| Reverse | AGGTACAGTCAGGAGGATCAA | |
| mIL-13 | Forward | GCAGCATGGTATGGAGTGT |
| Reverse | TATCCTCTGGGTCCTGTAGATG | |
| mST2 | Forward | ATTCAGGGGACCATCAAGTG |
| Reverse | CGTCTTGGAGGCTCTTTCTG | |
| mβ-actin | Forward | GAGGTATCCTGACCCTGAAGTA |
| Reverse | CACACGCAGCTCATTGTAGA |
ELISA法测蛋白 用ELISA试剂盒分别检测小鼠血清总IgE水平、肺组织及BALF中IL-33蛋白水平。
统计学分析 采用统计软件GraphPad Prism 6处理数据，数据形式表示为x±s，两组间比较采用独立样本t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
结果血清总IgE水平 应用ELISA法检测血清总IgE，比较各组小鼠的变化。第14天, 与PBS组相比，RSV组IgE水平未见明显升高，OVA组IgE水平明显升高[（1 565±230.5）ng/mL, P < 0.05]，OVA/RSV组[（1 496±202.7）ng/mL]与OVA组相比差异无统计学意义。
BALF中细胞总数及各细胞分类计数 通过离心收集BALF中的细胞并计算细胞总数，瑞氏/吉姆萨染色后各细胞分别计数。与PBS组相比，RSV组BALF中细胞总数明显增加（P < 0.05），未见EOS数显著升高，而巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞数均有不同程度升高；OVA组BALF中细胞总数显著增加（P < 0.05），以EOS、淋巴细胞、巨噬细胞升高尤其明显。与OVA组相比，OVA/RSV组主要表现为巨噬细胞和中性粒细胞增加（P < 0.05），而EOS和淋巴细胞未见明显变化，提示巨噬细胞或中性粒细胞在RSV诱导哮喘急性发作中起重要作用。与RSV组和OVA组相比，OVA/RSV组中细胞总数均有显著增加（P < 0.05）。
|
| Total IgE protein in serum was measured by ELISA.(1)vs.PBS group, P < 0.05. 图 2 各组小鼠血清总IgE水平比较 Fig 2 Comparison of the total IgE level in serum of the mice in different groups |
小鼠肺组织病理切片和HE染色 取小鼠左下肺病理切片行HE染色，于正置荧光显微镜下观察到:PBS组小鼠肺间质基本无炎症细胞浸润，肺泡壁较光滑，RSV组和OVA组均可见小气道周围大量不同程度的炎症细胞浸润，OVA组还可见杯状细胞增生。RSV感染OVA诱导哮喘的小鼠小气道周围炎性细胞浸润更加明显，毛细血管扩张充血，甚至可见气道上皮脱落，符合哮喘急性发作时肺组织病理学改变。
小鼠肺组织中细胞因子mRNA表达变化 real-time PCR检测各组小鼠肺匀浆中细胞因子及ST2 mRNA相对于内参β-actin mRNA表达的变化。与PBS组相比，RSV组和OVA组IL-5、IL-13及IL-33 mRNA表达显著增加（P < 0.05），但ST2 mRNA表达无明显增加。与RSV组相比，OVA/RSV组小鼠各基因均表达上调。与OVA组相比，OVA/RSV组中IL-13和IL-33 mRNA表达增加更加明显（P < 0.05），IL-5和ST2 mRNA表达有所增加，但差异无统计学意义，IL-5、IL-13等Th2型细胞因子升高提示RSV感染OVA诱导哮喘小鼠中Th2型免疫反应进一步加强，符合哮喘急性发作特征。
小鼠肺组织及BALF中IL-33蛋白水平 ELISA法检测各组小鼠肺组织匀浆及BALF中IL-33蛋白水平，肺组织中IL-33蛋白质水平已校正为全肺水平。与PBS组相比，RSV组和OVA组小鼠肺匀浆及BALF中的IL-33蛋白质水平均显著升高（P < 0.05）。与RSV组相比，OVA/RSV组小鼠肺匀浆及BALF中的IL-33蛋白质水平均升高。与OVA组相比，OVA/RSV组小鼠肺组织匀浆中IL-33增高更加显著（P < 0.05），BALF中IL-33有所增加，但差异无统计学意义。小鼠肺组织中IL-33 mRNA水平和蛋白质水平基本呈平行趋势。
|
| The total cell counts and differential cells in BALF were counted after Wright-Giemsa staining.(1)vs.PBS group, (2)vs.RSV group, (3)vs.OVA group, P < 0.05. 图 3 各组小鼠BALF中细胞总数及各细胞分类计数的比较 Fig 3 Comparison of total inflammatory cell counts and other cell counts in BALF in the mice of different groups |
|
| Lung pathology was determined by HE staining under high times optic microscope. The arrow indicated exfoliation of airway epithelium. 图 4 各组小鼠肺组织病理切片HE染色变化 Fig 4 Comparison of HE staining in pathological section of lung tissues in the mice of different groups |
|
| The gene expressions of IL-33 and Th2 cytokines were measured by real-time PCR.(1)vs. PBS group, (2)vs.RSV group, (3)vs. OVA group, P < 0.05. 图 5 各组小鼠肺组织中各基因的相对表达比较 Fig 5 Comparison of relative gene expression of the cytokines in the lung of the mice in different groups |
|
| IL-33 protein in the lung (A) and BALF (B) were detected by ELISA.(1)vs. PBS group, (2)vs. RSV group, (3)vs. OVA group, P < 0.05. 图 6 各组小鼠肺组织及BALF中IL-33蛋白质水平比较 Fig 6 Comparison of IL-33 production in the lung homogenate or BALF samples in the mice of different groups |
呼吸道病毒感染诱导哮喘急性发作，进一步损害肺功能及加速疾病进展。哮喘稳定期用药(如吸入性激素、长效β受体激动剂等)对病毒感染诱导的急性发作常常效果不佳。加快对呼吸道病毒感染所致哮喘急性发作机制的了解与研究，尤其是提供新的治疗策略，既是迫切需要也是重大挑战。本实验在前期OVA哮喘模型基础上[11]，再应用RSV感染，观察到BALF中细胞总数进一步升高，肺组织炎症细胞浸润更加明显，Th2型细胞因子进一步升高，表明RSV感染致哮喘急性发作小鼠模型成功建立。
第0天腹腔注射OVA致敏小鼠，然后在第7~13天连续1周进行雾化OVA激发，相较于仅PBS致敏激发的空白对照小鼠, 血清总IgE水平显著升高。第14天RSV急性感染OVA致敏激发的小鼠血清总IgE水平未见进一步升高。推测此模型中IgE作为过敏性疾病的特征，并不能反映病毒感染致哮喘急性发作的程度，提示哮喘急性发作可能并不依赖IgE水平[12]。在BALF中，OVA组较PBS组细胞总数升高，OVA/RSV组小鼠可见细胞总数再次升高。BALF中细胞总数升高预示炎症加重，Mahmutovic等[13]通过屋尘螨致敏激发建立哮喘模型，并以不同浓度RV替代物双链RNA急性感染，观察到BALF中细胞总数水平升高，浓度越高的双链RNA可检测到的细胞总数水平越高。比较BALF中的各组分类细胞计数，OVA组以EOS升高为主，提示OVA诱导的哮喘模型以EOS炎症为主；RSV组中巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞数均有不同程度升高；OVA/RSV组较OVA组主要表现为巨噬细胞和中性粒细胞的增加，推断病毒感染可诱导以巨噬细胞、中性粒细胞为主的炎症，而非以EOS炎症为主。这与临床上难治性哮喘以中性粒细胞浸润为主相符合[14]，可为研究难治性哮喘提供思路。Nguyen等[15]在RSV感染OVA诱导哮喘急性发作小鼠模型中观察到，以巨噬细胞、中性粒细胞渗出为主，这与本研究观察结果一致。Nguyen等[15]还观察到地塞米松可以完全抑制OVA致敏激发的哮喘小鼠气道高反应性和EOS聚集，但不能抑制RSV急性感染OVA诱导的小鼠哮喘急性发作时巨噬细胞和中性粒细胞的炎症渗出。病理切片结果显示，OVA组和RSV单独感染组均见到小气道周围不同程度的炎症细胞浸润；在OVA组还可观察到杯状细胞增生，这可导致哮喘小鼠气道重构以及分泌更多黏液。RSV急性感染OVA诱导哮喘的小鼠，小气道周围炎性细胞浸润更加明显，毛细血管扩张充血，甚至可见气道上皮的脱落。Mahmutovic-Persson等[16]观察到RV替代物双链RNA感染OVA诱导的哮喘小鼠，有更多的炎症细胞浸润及更高的炎症评分。综合上述特点，本研究成功建立了RSV感染OVA诱导的哮喘小鼠急性发作模型，为后续实验打下一定基础。
为了进一步探究呼吸道病毒感染诱导哮喘急性发作的机制，我们分析了Th2型细胞因子、IL-33和ST2的变化。本研究观察到OVA诱导的哮喘小鼠仍然有较高的IL-5和IL-13基因表达水平，这符合哮喘以Th2型免疫反应为主的特征。在RSV感染OVA诱导哮喘的小鼠中，仅观察到IL-13表达进一步升高，IL-5无明显升高趋势，且RSV单独感染小鼠的IL-13水平也较OVA哮喘小鼠有所升高，推测RSV感染致哮喘急性发作可能依赖于IL-13的表达。RSV单独感染小鼠可观察到Th2型细胞因子的表达增加，这与Zeng等[17]的研究结果一致。IL-33作为新近发现的IL-1家族成员[2]，在RV急性感染诱导哮喘加重小鼠模型中起重要作用[13, 18]。Saglani等[19]观察到激素耐药的难治性哮喘患者中IL-33表达升高，IL-33在介导气道重构中起重要作用，并通过ST2缺失小鼠进一步证实IL-33作为激素耐药介质可促进难治性哮喘的气道重构，提出IL-33可作为难治性哮喘重要的治疗靶点。本研究中，IL-33 mRNA水平和蛋白质水平在OVA诱导的哮喘小鼠及RSV单独感染小鼠均上调，而其受体ST2 mRNA表达却无明显升高。与哮喘小鼠相比，RSV感染OVA诱导哮喘急性发作小鼠中IL-33 mRNA及蛋白质水平均显著增加。
综上，IL-33可能参与RSV感染OVA诱导哮喘急性发作的过程。本研究有助于阐明RSV感染介导哮喘急性发作的机制。IL-33/ST2信号通路在此模型的具体作用机制及阻断IL-33/ST2信号通路是否对RSV感染致哮喘急性发作有效，还有待进一步探讨。
| [1] |
LIU AH, ANDERSON WR, DUTMER CM, et al. Advances in asthma 2015:across the lifespan[J]. J Allergy Clin Immunol, 2016, 138(2): 397-404.
[URI]
|
| [2] |
SCHMITZ J, OWYANG A, OLDHAM E, et al. IL-33, an interleukin-1-like cytokine that signals via the IL-1 receptor-related protein ST2 and induces T helper type 2-associated cytokines[J]. Immunity, 2005, 23(5): 479-490.
[DOI]
|
| [3] |
FERREIRA MA, JANSEN R, WILLEMSEN G, et al. Gene-based analysis of regulatory variants identifies 4 putative novel asthma risk genes related to nucleotide synthesis and signaling[J]. J Allergy Clin Immunol, 2017, 139(4): 1148-1157.
[DOI]
|
| [4] |
NABE T. Interleukin (IL)-33:new therapeutic target for atopic diseases[J]. J Pharmacol Sci, 2014, 126(2): 85-91.
[DOI]
|
| [5] |
HARDMAN C, OGG G. Interleukin-33, friend and foe in type-2 immune responses[J]. Curr Opin Immunol, 2016, 42: 16-24.
[DOI]
|
| [6] |
MAKRINIOTI H, TOUSSAINT M, JACKSON DJ, et al. Role of interleukin 33 in respiratory allergy and asthma[J]. Lancet Respir Med, 2014, 2(3): 226-237.
[DOI]
|
| [7] |
LIEW FY, GIRARD JP, TURNQUIST HR. Interleukin-33 in health and disease[J]. Nat Rev Immunol, 2016, 16(11): 676-689.
[DOI]
|
| [8] |
DONOVAN C, BOURKE JE, VLAHOS R. Targeting the IL-33/IL-13 axis for respiratory viral infections[J]. Trends Pharmacol Sci, 2016, 37(4): 252-261.
[DOI]
|
| [9] |
SARAVIA J, YOU D, SHRESTHA B, et al. Respiratory syncytial virus disease is mediated by age-variable IL-33[J]. PLoS Pathog, 2015, 11(10): e1005217.
[DOI]
|
| [10] |
SHIM DH, PARK YA, KIM MJ, et al. Pandemic influenza virus, pH1N1, induces asthmatic symptoms via activation of innate lymphoid cells[J]. Pediatr Allergy Immunol, 2015, 26(8): 780-788.
[DOI]
|
| [11] |
SHI T, HE Y, SUN W, et al. Respiratory syncytial virus infection compromises asthma tolerance by recruiting interleukin-17A-producing cells via CCR6-CCL20 signaling[J]. Mol Immunol, 2017, 88: 45-57.
[DOI]
|
| [12] |
GALLI SJ, TSAI M, PILIPONSKY AM. The development of allergic inflammation[J]. Nature, 2008, 454(7203): 445-454.
[DOI]
|
| [13] |
MAHMUTOVIC PI, AKBARSHAHI H, MENZEL M, et al. Increased expression of upstream TH2-cytokines in a mouse model of viral-induced asthma exacerbation[J]. J Transl Med, 2016, 14(1): 52.
[DOI]
|
| [14] |
ALAM R, GOOD J, ROLLINS D, et al. Airway and serum biochemical correlates of refractory neutrophilic asthma[J]. J Allergy Clin Immunol, 2017, 140(4): 1004-1014.
[DOI]
|
| [15] |
NGUYEN TH, MALTBY S, SIMPSON JL, et al. TNF-alpha and macrophages are critical for respiratory syncytial virus-induced exacerbations in a mouse model of allergic airways disease[J]. J Immunol, 2016, 196(9): 3547-3558.
[DOI]
|
| [16] |
MAHMUTOVIC-PERSSON I, AKBARSHAHI H, BARTLETT NW, et al. Inhaled dsRNA and rhinovirus evoke neutrophilic exacerbation and lung expression of thymic stromal lymphopoietin in allergic mice with established experimental asthma[J]. Allergy, 2014, 69(3): 348-358.
[DOI]
|
| [17] |
ZENG S, WU J, LIU J, et al. IL-33 receptor (ST2) signalling is important for regulation of Th2-mediated airway inflammation in a murine model of acute respiratory syncytial virus infection[J]. Scand J Immunol, 2015, 81(6): 494-501.
[DOI]
|
| [18] |
WERDER RB, ZHANG V, LYNCH JP, et al. Chronic IL-33 expression predisposes to virus-induced asthma exacerbations by increasing type 2 inflammation and dampening antiviral immunity[J]. J Allergy Clin Immunol, 2018, 141(5): 1607-1619.
[DOI]
|
| [19] |
SAGLANI S, LUI S, ULLMANN N, et al. IL-33 promotes airway remodeling in pediatric patients with severe steroid-resistant asthma[J]. J Allergy Clin Immunol, 2013, 132(3): 676-685.
[DOI]
|