原发性免疫性血小板减少症（immune thrombocytopenia，ITP）是临床常见的获得性自身免疫性出血性疾病，由于免疫紊乱导致血小板及巨核细胞破坏增加和/或生成减少。原发性ITP患者体内存在多种免疫细胞亚群数量和功能异常^[1]，Th1/Th2显著失衡，目前公认原发性ITP为Th1优势自身免疫性疾病^[2]。部分B细胞可以通过分泌IL-10而影响T细胞亚群(如Th1、Th17等)的分化和功能，其中CD5⁺B细胞是产生IL-10的重要B细胞亚群^[3-4]，多种具有免疫调节功能的B细胞亚群都表达CD5分子标志物^[5-7]。我们发现原发性ITP患者CD5⁺B细胞存在数量及分泌IL-10能力的异常^[8-9]，提示在原发性ITP患者中CD5⁺B细胞对T细胞亚群的免疫调节功能可能存在缺陷。原发性ITP的一线治疗药物为糖皮质激素，首选大剂量地塞米松（high-dose dexamethasone，HD-DXM）冲击治疗^[10]。本研究通过观察原发性ITP患者CD5⁺B细胞对CD4⁺T细胞分泌Th1和Th2型代表性细胞因子IFN-γ和IL-4的调节作用，以及经过HD-DXM治疗后CD5⁺B细胞免疫调节功能的变化，探讨CD5⁺ B细胞在原发性ITP患者Th1/Th2失衡中的作用。

研究对象  所有研究对象均符合《成人原发免疫性血小板减少症诊断与治疗中国专家共识（2016年版）》^[11]的诊断标准。收集2018年2月至6月复旦大学附属中山医院青浦分院血液科病房ITP患者共5例（男1例、女4例），中位年龄49（35~62）岁。招募健康对照者5例（男2例、女3例），中位年龄35（28~46）岁。本研究经复旦大学附属中山医院青浦分院医学伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

HD-DXM冲击治疗方案   患者起始血小板计数 < 30×10⁹/L和/或有出血表现，接受HD-DXM冲击治疗：口服地塞米松40 mg/d×4天，重症患者同时给予静脉注射丙种球蛋白0.4 g·kg^-1·d^-1×5天和/或血小板输注和/或重组人血小板生成素；4天后停药，若血小板稳定，则不再用药；若血小板下降至 < 50×10⁹/L，则重复给药1次，然后以泼尼松15 mg/d维持。疗效评估参照文献^[11]。

淋巴细胞分选    ITP患者接受HD-DXM治疗前、后均采集外周静脉血20 mL，EDTA-K2抗凝；健康对照者采集外周静脉血20 mL。采用Ficoll密度梯度离心法获得外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。分选CD4⁺T细胞：1×10⁷ PBMC重悬于80 μL分选缓冲液中，加入20 μL CD4磁珠, 置于4 ℃冰箱孵育15 min；洗涤重悬后过柱，获得阳性细胞（纯度 > 99%）。分选CD19⁺CD5⁺B细胞和CD19⁺CD5^-B细胞：1×10⁷ PBMC重悬于80 μL分选缓冲液中，加入20 μL CD19磁珠, 置于4 ℃冰箱孵育15 min，后10 min加入CD5-Biotin抗体10 μL；洗涤后过柱，分选获得CD19⁺B细胞；1 mL CD19⁺细胞中加入20 μL酶切试剂，4 ℃孵育10 min，洗涤后重悬于50 μL缓冲液；加入30 μL终止液；加入20 μL Biotin磁珠，4 ℃孵育15 min；洗涤重悬后过柱，分选获得CD19⁺CD5⁺B细胞（纯度 > 90%），其余为CD19⁺CD5^-B细胞（纯度 > 98%）。

淋巴细胞共培养    CD4⁺T细胞（2×10⁵/mL)与完全RPMI 1640培养基混合，接种于预包被CD3 mAb的96孔培养板，在2.5 μg/mL CD28 mAb和10 ng/mL IL-2的条件下，磁珠纯化出的CD19⁺CD5⁺B细胞或CD19⁺CD5^-B细胞与CD4⁺T细胞按1:9、1:5、1:3、1:1，混合培养72 h或144 h。

ELISA检测IFN-γ和IL-4水平   取上述细胞共培养上清，按ELISA试剂盒说明书检测IFN-γ和IL-4水平，每个样本和标准品均设3个复孔，酶标仪读取波长450 nm处的吸光度（D）值，绘制标准曲线，计算IFN-γ和IL-4含量。所用ELISA试剂盒IFN-γ和IL-4的最低检测浓度分别为5 pg/mL和0.5 pg/mL。

统计学分析   运用SPSS 16.0和GraphPad Prism 7统计软件进行数据分析。计量资料以x±s表示，多组间计量资料比较采用双因素ANOVA检验。P < 0.05为差异有统计学意义，P < 0.01为差异有显著统计学意义。

健康对照组CD5⁺B细胞对CD4⁺T细胞分泌IFN-γ的影响   共培养72 h，健康对照组CD5⁺B细胞与CD4⁺T细胞比例在1:3时，CD4⁺T细胞分泌IFN-γ浓度明显下降，与T细胞单独培养相比差异有统计学意义[（2 427.99±632.62）pg/mL vs.（1 109.25±338.10）pg/mL，P=0.001 2]。CD5⁺B细胞与CD4⁺T细胞比例增加至1:1时，CD4⁺T细胞分泌IFN-γ浓度下降至（395.22±136.54）pg/mL（P < 0.001）。共培养144 h得到相似的结果，但培养上清液中IFN-γ浓度较共培养72 h高出数倍。

共培养72 h，各浓度梯度下CD5CD5^-BB细胞对CD4⁺T细胞培养上清液中IFN-γ浓度均未见明显影响（P均 > 0.05）；当CD5^-B细胞与CD4⁺T细胞比例增加至1:1时，IFN-γ浓度有下降趋势，但差异无统计学意义。共培养144 h，CD5^-B细胞与CD4⁺ T细胞比例为1:9时表现为促进IFN-γ的分泌，而B与T细胞比例增加至1:3时对IFN-γ的分泌才产生抑制作用，较T细胞单独培养时IFN-γ浓度显著下降（P均 < 0.01，图 1、表 1）。

The concentration of IFN-γ in supernatant of CD4+ T cells cocultured with CD5+/CD5-B cells in healthy controls after 72-h (A) and 144-h (B) coculture.The concentration of IFN-γ in supernatant of CD4+ T cells cocultured with CD5+/CD5-B cells of primary ITP patients after 72-h (C) and 144-h (D) coculture.vs.T cell culture alone, (1)P < 0.05;(2)P < 0.01.T:T cell; B:B cell. 图 1 健康对照组和ITP组CD5+/CD5-B细胞对CD4+ T细胞分泌IFN-γ的影响 Fig 1 The effect of CD5+/CD5-B cells on IFN-γ secretion by CD4+ T cells in healthy control group and ITP group

图选项

ITP患者CD5⁺B细胞对CD4⁺T细胞分泌IFN-γ的影响  共培养72 h，ITP患者CD5⁺B细胞与CD4⁺T细胞比例增至3:1时，较T细胞单独培养时IFN-γ的分泌显著下降[（3 060.02±493.98）pg/mL vs.（1 769.45±634.73）pg/mL，P=0.000 3]。共培养144 h，ITP患者CD5⁺B细胞有轻度抑制CD4⁺ T细胞分泌IFN-γ的趋势，但差异无统计学意义。

共培养72 h，ITP患者CD5^-B细胞与CD4⁺T细胞比例为1:1时，CD5^-B细胞促进CD4⁺T细胞分泌IFN-γ，与T细胞单独培养相比差异有统计学意义（P=0.029 1）。共培养144 h，ITP患者CD5^-B细胞对CD4⁺T细胞分泌IFN-γ几乎没有影响（P均 > 0.05，图 1、表 2）。

ITP患者HD-DXM治疗后CD5⁺B细胞对CD4⁺T细胞分泌IFN-γ的影响   经HD-DXM治疗后ITP患者均获得完全或部分反应。共培养72 h，CD5⁺B细胞与CD4⁺T细胞比例为1:1时，即表现出对CD4⁺T细胞分泌IFN-γ的抑制作用[（3 600.02±838.00）pg/mL vs.（1 157.97±383.20）pg/mL，P < 0.000 1]；当比例增加至3:1时，CD4⁺T细胞分泌IFN-γ浓度进一步下降至（829.67±314.25）pg/mL（P < 0.000 1）。共培养144 h的结果同样显示，经过HD-DXM有效治疗后，CD5⁺B细胞与CD4⁺T细胞比例为1:3时，表现出对CD4⁺T细胞分泌IFN-γ的抑制作用[（11 543.53±3 541.90）pg/mL vs.（5 102.81±1 734.33）pg/mL，P=0.002 9]；当比例增至1:1和3:1时，CD4⁺T细胞分泌IFN-γ的浓度随着B:T细胞比例的增加进一步下降（P均 < 0.000 1，表 3）。

健康对照者及ITP患者的CD5⁺B细胞对CD4⁺T细胞分泌IL-4的影响   在健康对照者和ITP患者中，CD5⁺B细胞以不同比例与CD4⁺T细胞共培养，无论72 h还是144 h，培养上清中IL-4的浓度变化与T细胞单独培养时比较, 差异均无统计学意义。CD5^-B细胞以不同比例与CD4⁺T细胞共培养，同样对IL-4的浓度无明显影响。

CD5⁺B细胞具有分泌IL-10的能力，其免疫调节作用已经在动物实验中得到证实：体外诱导扩增的CD5⁺B细胞回输小鼠体内可以缓解实验性变态反应性脑脊髓炎疾病，而CD5^-B细胞则不具备这种免疫调节功能^[12]。本研究证实，健康对照组共培养72 h时CD5⁺B细胞具有抑制CD4⁺T细胞分泌IFN-γ的作用，提示CD5⁺B细胞影响Th1细胞亚群的细胞因子分泌，并在维持Th1/Th2平衡中起到重要作用。

我们发现在原发性ITP患者中CD5⁺B细胞存在数量及分泌IL-10能力的异常^[8-9]，这提示在ITP患者中CD5⁺B细胞免疫调节功能可能存在缺陷。本研究发现，相较于健康对照组，CD5⁺B细胞对CD4⁺T细胞分泌IFN-γ(Th1型代表性细胞因子)有显著抑制作用，ITP患者中CD5⁺B细胞抑制IFN-γ分泌的能力明显受损，CD5⁺B细胞在更高的比例下才表现出对CD4⁺T细胞分泌IFN-γ的抑制作用，而且在相同的B:T细胞比例下，IFN-γ分泌受抑制的程度远低于健康对照组。说明在ITP患者中CD5⁺B细胞调节CD4⁺T细胞分泌IFN-γ的功能存在缺陷。CD5⁺B细胞主要通过分泌IL-10发挥免疫抑制功能，本研究结果也与我们之前发现的ITP患者CD5⁺ B细胞存在分泌IL-10能力异常相一致。B细胞分泌IL-10主要由Toll样受体及其下游的MyD88通路所介导，针对ITP患者CD5⁺B细胞，我们运用PCR Array方法对TLRs/MyD88信号传导通路中的相关分子进行初步探索，筛选出一些重要的差异表达分子，如FOS、JUN、IRF3等^[13]，为后续机制研究提供了方向。

另一方面，健康对照者和原发性ITP患者的CD5⁺B细胞对Th2型代表性细胞因子IL-4的分泌均无明显影响。CD5⁺B细胞可以下调Th1/Th2型细胞因子的比例，但在ITP患者中由于CD5⁺B细胞抑制IFN-γ分泌的能力明显受损，可能造成Th1/Th2失衡和Th1型细胞因子优势。ITP是一种典型的Th1优势的自身免疫性疾病，Th1/Th2失衡在ITP的发病机制中起到重要作用^[14-16]。本研究结果提示，CD5⁺B细胞的免疫调节功能缺陷参与了ITP患者形成Th1优势和Th1/Th2失衡的过程。

HD-DXM治疗疗效好、疗程短、不良反应小，故推荐作为ITP的一线治疗^[10]，但其作用机制尚不完全清楚。与治疗前相比，在HD-DXM治疗有效的ITP患者中观察到Th1/Th2失衡可被纠正^[17]及Treg数量增加^[18]等免疫细胞和细胞因子的变化。本课题组前期研究发现ITP患者CD5⁺B细胞的IL-10分泌障碍可以被HD-DXM修复^[8]。本研究进一步发现，患者接受HD-DXM治疗后，CD5⁺B细胞抑制IFN-γ分泌的能力部分恢复，提示CD5⁺B细胞免疫调节功能的恢复可能也是HD-DXM的作用机制之一。功能部分恢复的CD5⁺B细胞对IFN-γ分泌的抑制程度仍显著低于健康对照者，这说明经过HD-DXM治疗，患者的血小板计数升高到相对安全的范围，但其CD5⁺B细胞对CD4⁺T细胞的免疫调节功能尚未完全恢复，患者仍处于免疫失衡状态，这可能是导致疾病复发的原因之一。本研究中有2例患者同时使用具有免疫调节功能的丙种球蛋白，其对T细胞分泌IFN-γ的影响尚无明确定论，丙种球蛋白联合地塞米松对T细胞分泌细胞因子方式的影响及其临床意义值得进一步探讨。

本研究还比较了CD5^-B细胞与CD5⁺B细胞在免疫调节功能上的差异。无论是在健康对照者还是ITP患者中，共培养72 h，CD5^-B细胞均不能抑制CD4⁺T细胞分泌IFN-γ，在ITP患者中随着CD5^- B细胞比例的增加，反而有促进CD4⁺T细胞分泌IFN-γ的趋势。共培养时间延长至144 h，健康对照组中随着CD5^-B细胞比例的增加，表现出对IFN-γ的分泌有一定的抑制作用，而ITP患者中CD5^-B细胞对IFN-γ的分泌几乎不产生影响。Lemoine等^[19]研究认为, 在T细胞与B细胞相互作用的过程中，B细胞可上调CD5的表达并获得抑制T细胞免疫反应的能力。ITP患者中B细胞的异常表现提示其获得免疫抑制功能的通路受阻，但具体机制有待深入研究。

总之，本研究发现原发性ITP患者CD5⁺B细胞抑制CD4⁺T细胞分泌Th1型代表性细胞因子IFN-γ的能力明显受损，但是对Th2型代表性细胞因子IL-4的分泌无明显影响。HD-DXM治疗有效的ITP患者中，CD5⁺B细胞抑制IFN-γ分泌的能力可部分恢复。本研究一方面揭示了CD5⁺B细胞在ITP疾病发生发展尤其是Th1/Th2失衡中可能发挥的作用，另一方面也为ITP患者B细胞免疫调节功能缺陷制定相应的治疗策略提供了实验基础。