2019, Vol. 46
2. 复旦大学聚合物分子工程国家重点实验室-高分子科学系 上海 200433;
3. 上海女性生殖内分泌相关疾病重点实验室 上海 200011
2. State Key Laboratory of Molecular Engineering of Polymers-Department of Macromolecular Science, Fudan University, Shanghai 200433, China;
3. Shanghai Key Laboratory of Female Reproductive Endocrine Related Diseases, Shanghai 200011, China
宫颈癌是一种常见的女性恶性肿瘤, 晚期和复发性宫颈癌是致命的, 常常需要化疗和放疗。紫杉醇(paclitaxel, PTX)是一种被广泛使用的化疗药, 用于治疗各种不同类型的恶性肿瘤, 包括晚期卵巢癌、宫颈癌、肺癌和其他恶性肿瘤[1-2]。因为缺乏特异的肿瘤靶向性, 紫杉醇不仅作用于肿瘤细胞, 同时也作用于正常细胞。因此, 伴随着PTX的使用, 其毒性作用及不良反应也总是一并出现, 如心血管毒性、过敏和神经毒性等。另外, PTX还有个很重要的缺点, 即低水溶性。为改善其水溶性, PTX复合溶液中添加了某些助溶剂, 但这又进一步增加了助溶剂本身带来的不良反应。
为减少PTX的不良反应、拓广PTX的应用, 科学家们研究了许多更为安全的药物载体[1, 3]。介孔二氧化硅纳米粒(mesoporous silica nanoparticles, MSN)于20世纪90年代[4]被首次提出, 与传统载体相比, 具有高度有序、高比表面积、良好生物相容性、易修饰性、无生理毒性等优势, 其作为药物释放系统的潜能相继得到特殊关注[5-8]。然而, 如果单纯将PTX包裹于MSNs内, 不增加“释药阀门”, 一旦进入体内, 携带的药物尚未到达病灶部位, 就会被快速释放和清除, 致其不能发挥改善药物生物利用度的作用[9-10]。
我们先前的研究已经构建了一个以二硫键共价链接PTX的MSN[11-13], 并对其释药性能做了初步评估。从材料学分类来讲, 二硫键复合纳米粒属于刺激响应型聚合物, 即能识别体内微环境, 对刺激进行动态反应。二硫键在谷胱甘肽(glutathione, GSH)作用下, 发生氧化还原反应, 能快速裂解, 从而获得氧化还原刺激响应。研究表明, 肿瘤细胞内谷胱甘肽的浓度异常高于血浆(1~10 mmol/L vs.1~2 μmol/L[14]), 因此二硫键在轻微氧化环境如细胞外环境和血浆中十分稳定。利用二硫键负载药物的方式, 可以选择性地将药物释放于细胞内, 而不是血浆中, 以此增强药物作用的靶向性, 并减小非靶向部位的毒性作用及不良反应。为对其载药性能及抗肿瘤效果做全面评估, 本文进行了一系列体内和体外研究。
材料和方法主要试剂与材料 PTX购自北京中化科技有限公司, 纯度≥98%。青霉素/链霉素双抗溶液和细胞培养基购于美国海克隆实验室。胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS)购自美国Gibico公司。异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate, FITC)购自日本东京仁成工业株式会社。原硅酸四乙酯(Tetraethyl orthosilicate, TEOS)、3-氨丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane, APS)、N-溴化十六烷基三甲铵(N-cetyltrimethylammonium bromide, CTAB)和三甲基苯(mesitylene, TMB)购自美国Sigma-Aldrich公司。Tunel检测试剂购于瑞士罗氏公司。苏木精-伊红染色试剂购于珠海贝索(Baso)生物技术有限公司。负载紫杉醇的荧光介孔二氧化硅纳米粒(Paclitaxel-loaded fluorescent mesoporous silica nanoparticles, PTX-FMSN)合成过程详见于本课题组之前的文献报导[11-12]。
细胞培养 人宫颈癌HeLa细胞由中国科学院(上海)细胞库赠送。细胞放入培养基中培育, 同时加入10%的胎牛血清、100 U/mL的青霉素和100 mg/mL的链霉素。细胞培养箱在充分湿化的5% CO2空气中维持37 ℃恒温。用于实验的细胞均处于对数生长期。
体外抗肿瘤实验 将HeLa细胞接种于48孔培养皿中, 每孔细胞密度2.4×105, 37 ℃孵育24 h, 接着放入不同浓度的PTX-FMSN (分别为0.01、0.1、1和5 μg/mL), 利用Cell-IQ活细胞工作站连续观察60 h, 分析总细胞数, 稳定态细胞数, 分裂态细胞数及死亡细胞数, 自动计数计算得到细胞的生长曲线。PTX(浓度分别为0.01、0.1、1和5 μg/mL)和未带药FMSN均相同处理。另取3组处于对数生长期的HeLa细胞, 分别加入0.1 μg/mL的PTX和相同浓度的PTX-FMSN, 以空白FMSN作为对照, 37 ℃恒温孵育, 分别于第8、16、24、32、40 h收集细胞, 制成1×106/mL细胞悬液, PBS液洗2遍。加入5 mL Annexin V-FITC和碘化丙啶(propidium iodide, PI)混匀, 室温、避光反应15 min, 上流式细胞仪观察和检测细胞, 各组重复3次。
宫颈癌动物模型 实验用4~6周大雌性裸鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司), 饲养于南方模式生物SPF动物房, 动物饲养环境、模型构建和取材过程均符合《关于善待实验动物的指导性意见》(科技部2006年9月13日)。0.2 mL内含有1×107个HeLa细胞的溶液经皮下注入裸鼠右侧腋下。3天后, 可见瘤体形成。
体内抗肿瘤实验 实验方案经复旦大学附属妇产科医院动物伦理委员会审核批准。裸鼠按实验方案分为4组, 每组4只(表 1)。成瘤方法如上所述。瘤体长到约100 mm3时, 裸鼠按组分别经尾静脉注入生理盐水、PTX溶液、未带药FMSNs、PTX-FMSNs, 每3天重复给药1次, 药物浓度分别为4、8、12 mg/kg, 同时用电子游标卡尺测量肿瘤直径, 按照以下公式测算肿瘤大小:肿瘤体积=1/2×肿瘤长径×肿瘤短径。注入肿瘤细胞后21天, 经全身生物发光成像后, 以水合氯醛(浓度4%, 剂量0.20 mL/20 g)镇静, 1.5%异氟烷吸入麻醉, 自裸鼠腹部正中线向上剖开, 自下向上剪至剑突, 沿两侧肋弓V字型打开胸廓, 血管钳夹持左侧胸壁翻转, 暴露心脏, 以康德莱1 mL注射器刺入右心室, 取静脉血, 注入EDTA抗凝管中。自裸鼠体内取出瘤体、肺、肝、小肠、胃、心脏和肾, 经4%甲醛溶液固定, 制成石蜡块。
| Group | No. | HeLa cell injection | Treatment(via tail vain) | Treatment interval (d) |
| A | 4 | 107 cells/mouse | Saline | 21 |
| B | 4 | 107 cells/mouse | PTX | 21 |
| C | 4 | 107 cells/mouse | Blank FMSNs | 21 |
| D | 4 | 107 cells/mouse | PTX-FMSNs | 21 |
全身生物发光成像 本实验采用全身生物发光成像监测药物分布。经尾静脉注入药物后15 min, 裸鼠经1.5%异氟烷麻醉后成像。
组织染色 用TUNEL法进行肿瘤组织染色[15]。肺、肝、小肠、胃、心脏和肾组织切片HE染色后, 由病理学专家作出诊断。
统计学方法 使用STATA12.0软件对数据进行分析。多组间比较用单因素方差分析, 两组间比较用Bonferroni校正。P＜0.05为差异有统计学意义。
结果药物投递系统的制备 PTX-FMSN合成过程详见于之前本课题组发表的论文[11-13]。最终我们得到的FMSNs外观为规则的离散球形, 平均直径约147 nm, 其内部为有序的中空多孔状结构, 载药效率为12%。
体外抗肿瘤评价 图 1显示的是在不同浓度药物和培育时间下的HeLa细胞活性。从图 1A和1B可知, 细胞活性与药物浓度密切相关, PTX溶液抑制细胞活性的作用稍强于PTX-FMSN。当药物浓度在0.1 μg/mL时, PTX-FMSN和PTX在抑制HeLa细胞生长及促进细胞死亡上无差异, 提示PTX-FMSN能很好地释放药物。当药物浓度为0.01 μg/mL时, PTX-FMSN对HeLa细胞生长抑制和杀伤作用较PTX稍弱, 可能是因为药物浓度低, 释放量较少。
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| A:Cell viability of HeLa cells incubated with PTX and PTX-FMSN at different concentrations of drugs for 60 h.B:Cell viability of HeLa cells with different incubation time at 0.1 μg/mL of drug concentration.The cells treated with blank FMSN were used as a control.(1)vs.Control, P < 0.05. 图 1 经PTX和PTX-FMSN处理的HeLa细胞活性 Fig 1 Cell viability of HeLa cells with PTX and PTX-FMSN |
为了进一步评估PTX-FMSN的抗肿瘤效应, 我们通过Annexin V-FITC/PI试剂, 用流式细胞仪分析细胞凋亡和坏死率。图 2显示PTX和PTX-FMSN不同作用时间下, HeLa细胞的凋亡和坏死情况。结果表明, 虽然细胞死亡率在PTX-FMSN组相对稍低, 但差异无统计学意义, PTX和PTX-FMSN作用下的HeLa细胞凋亡和坏死率趋势一致。根据体外实验的结果, PTX-FMSN与PTX对HeLa细胞有相似的抑制作用。
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| A:HeLa cells counts at 16 h, 24 h, 32 h and 40 h.B:Apoptosis rate (left) and necrosis rate (right) of HeLa cells.The cells treated with blank FMSN were used as a control.The concentration of drug was 0.1 μg/mL.(1)vs.Control, P < 0.05. 图 2 经PTX和PTX-FMSN处理的HeLa细胞凋亡坏死情况 Fig 2 The apoptosis and necrosis of HeLa cells treated with PTX and PTX-FMS |
体内抗肿瘤评价 因为纳米复合物在合成过程中添加了荧光分子FITC, 可以通过发光成像观察PTX-FMSN在体内的分布。从图 3A可以看出, 裸鼠注射空白FMSN作为对照组, 在其身上未发现集中的荧光信号。而PTX-FMSNs通过尾静脉注入裸鼠4 h后, 肿瘤部位即显示强烈荧光, 表明PTX-FMSN能高效富集于肿瘤部位。
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| A:The whole-body bioluminescence imaging of tumor-bearing mice after blank FMSN (left) and PTX-FMSN (right) administration for 4 h.B:The growth curves of tumors treated with different drug doses.(1)P < 0.05, (2) P < 0.01. 图 3 裸鼠荧光成像和肿瘤生长曲线 Fig 3 Bioluminescence imaging and the growth curves of tumors in nude mice |
在裸鼠成瘤给药后21天, 所有的实验裸鼠在麻醉下处死。肿瘤的生长曲线显示(图 3B), 未带药的FMSNs组与生理盐水组相似, 对肿瘤的生长无抑制作用。PTX溶液组和PTX-FMSN组显示明显的肿瘤生长抑制效果, 其效果随着药物浓度增加而增强, 在肿瘤生长抑制效果上, PTX-FMSN和PTX两组差异无统计学意义。
为了进一步研究纳米复合物对肿瘤生长的抑制作用, 本研究将肿瘤组织制成病理切片。TUNEL染色后, 肿瘤中的坏死组织在光学显微镜下显示为浅棕色。从图 4A-H中可以看出, 不考虑药物浓度因素, PTX和PTX-FMSN两组之间差异无统计学意义。在低浓度药物作用下, PTX和PTX-FMSN组和对照组(生理盐水和未带药FMSN)差异无统计学意义。当药物浓度增加(8和12 mg/kg), PTX和PTX-FMSN组有大量的癌细胞凋亡。这些结果也与图 3 B的结果一致, 充分表明PTX-FMSN能在肿瘤部位充分释放PTX, 发挥出与同等剂量游离PTX相同的抗肿瘤效果。
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| Tumor tissue necrosis stained by TUNEL (×200).A:Untreated mice (saline); B:Untreated mice (blank FMSNs); C:PTX treated mice at 4 mg/mL concentration; D:PTX-FMSN treated mice at 4 mg/mL concentration; E:PTX treated mice at 8 mg/mL concentration; F:PTX-FMSN treated mice at 8 mg/mL concentration; G:PTX treated mice at 12 mg/mL concentration; H:PTX-FMSN treated mice at 12 mg/mL concentration; I:Comparison of tumor tissue necrosis rates.(1)P < 0.05, (2)P < 0.01. 图 4 裸鼠宫颈癌标本病理切片(TUNEL染色) Fig 4 Pathological section of cervical cancer speciments in nude mice (stained by TUNEL) |
体内药物不良反应 首先, 本研究检查了4个血常规指标, 包括白细胞计数、中性粒细胞计数、红细胞计数和血小板计数, 两个对照组4个血指标均在正常范围内(图 5)。当药物浓度为8 mg/kg时, 所有指数均是正常的。当药物浓度为12 mg/mL时, PTX组血白细胞和中性粒细胞的数量显著下降, 而PTX-FMSN组血白细胞和中性粒细胞仅略有下降, 这表明随着药物浓度升高, PTX-FMSN对血液毒性低于PTX。
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| A:White blood cell count; B:Neutrophils count; C:Red blood cell count; D:Platelet count.(1)P < 0.05. 图 5 不同药物处理的小鼠血细胞计数 Fig 5 Blood cells counts in mice treated by different drugs |
随后, 本研究将裸鼠的脏器制成切片, 通过组织学检查观察有无病理变化。结果如图 6及表 2所示, PTX和PTX-FMSN两组在低药物浓度时, 对肝、肺和小肠组织损伤程度的差异不显著, 但随着药物浓度的增加, PTX组对上述脏器组织的损伤程度明显大于PTX-FMSN组。
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| A:Lung; B:Liver; C:Small intestinal villi.HE stain (×200). 图 6 各组小鼠肺、肝和小肠组织改变的染色结果 Fig 6 Histology stain of lung, liver and small intestinal villi changes in different mice groups |
| Dose(mg/kg) | Drugs | Lung changes | Liver changes | Small intestinal villus changes | |||||
| Alveolar septums | Alveolar cavities | Bullae like | Liver cords | Hepatic sinusoids | Focal hepatic cell proliferation | ||||
| 4 | PTX | Significantly widened | Apparently smaller | None | Not clear | Disappeared | None | Normal | |
| PTX-FMSN | Normal | Normal | Basically normal | Basically normal | None | ||||
| 8 | PTX | Significantly widened | Apparently smaller | None | Not clear | Disappeared | None | Normal | |
| PTX-FMSN | Normal | Little smaller | Widened | Not clear | None | ||||
| 12 | PTX | Significantly widened | Damaged | Observed | Not clear | Disappeared | Yes | Short and sparse | |
| PTX-FMSN | Normal | Damaged | Observed | Widened | Not clear | None | |||
MSNs是具有均匀可调节孔径的中空立体载物体, 可在2~50 nm范围内任意调整孔径大小, 具有稳定的骨骼结构、较高的表面积和载药率, 并且微粒本身无生理毒性, 非常适合携带药物。此外, MSNs的内部和外部表面有大量的活性硅氧基, 可以被不同的功能基团或功能聚合物改性。纳米技术有望能改善药物的生物利用率, 减小药物毒性作用及不良反应, 并提高药物水溶性。因此, 在药物载体的研发中, MSNs受到了越来越多的关注。
YU等[16]报道的PTX纳米复合物结构稳定, 因减少了从肾小管的滤除, 从而增加了血循环留存时间, 并利用纳米颗粒的高渗透长滞留效应, 在肿瘤部位有较好的聚集性, PTX纳米复合物联合放疗与单纯PTX或单纯放疗相比, 对宫颈癌具有更好的抗肿瘤效果, 其抑制肿瘤增生的机制可能是通过调节Ki-67, 降低微血管密度、CD31和血管内皮生长因子实现的, 一定程度上增加了放化疗敏感性。
根据肿瘤组织中表达的特殊抗原或配体, 可以制作相匹配的MSNs药物靶向复合体, 以提高抗肿瘤药物作用的靶向性。实验结果表明, 抗肿瘤药物纳米复合物在肿瘤组织中具有良好的聚集性, 从而发挥了更高效的抗肿瘤作用[17-19]。研究报道[17, 20], 因肿瘤细胞具有高速代谢特点, 其表面较正常细胞配备更多叶酸受体, 故含有叶酸配体的纳米复合物可用于肿瘤靶向治疗, 实验结果证实此类纳米复合物发挥了良好的抗肿瘤效果, 且减小了药物的毒性作用及不良反应。
另有研究表明, 在肿瘤细胞中谷胱甘肽的浓度远远高于正常[21], 二硫键可以在谷胱甘肽的作用下分离, 通过二硫键共价联合抗肿瘤药物和纳米颗粒的应用已有报道[22]。Luo等[23]通过二硫键将PTX链接于纳米颗粒上, 然后对荷瘤小鼠(人表皮癌)给予相当于8 mg/kg剂量的PTX治疗, 结果提示PTX纳米复合物与单纯PTX相比, 前者的肿瘤聚集性更加明显, 在其他脏器的积聚更少。在观察终末, 经PTX纳米复合物治疗的负荷小鼠, 肿瘤完全消退。但此类纳米复合物用于治疗宫颈癌的相关报道甚少, 尤其是体内实验的资料匮乏。
在本研究中, 课题组通过二硫键共价链接合成PTX-FMSN复合物。体外细胞实验表明, PTX-FMSN显示出与PTX相似的对HeLa细胞增殖抑制和促凋亡作用。空白FMSN作为细胞试验对照组, 结果显示对细胞活性基本无影响, 这也说明FMSN作为药物载体是安全的。
通过全身生物荧光成像, 表明PTX-FMSN具有较好的肿瘤靶向性。体内抗肿瘤实验表明, 经PTX溶液和PTX-FMSN处理的裸鼠, 其肿瘤生长曲线无显著差异, 两组的细胞坏死率也无显著差异。血液检测结果表明, PTX-FMSN组中血白细胞和中性粒细胞计数显著高于PTX组。通过病理评估, 可以看到PTX和PTX-FMSN治疗组裸鼠肺、肝、小肠有组织学变化, 但同剂量下的PTX组病变较PTX-FMSN组更为严重。
本研究通过上述一系列体内体外实验, 提示PTX-FMSN对宫颈癌有抑制作用, 其效果与单纯PTX相当; 通过二硫键共价链接, 使PTX充分释放在肿瘤组织内, 同时减小了药物对其他脏器的毒性作用及不良反应。这些结果与Luo等[23]的实验结果相吻合, 进一步验证了二硫键这一阀门在控制药物释放中是安全有效的, 其对于宫颈癌的治疗前景值得肯定。当然, 我们的实验尚不完善, 需进一步改进实验设计, 比如增加药代学方面的研究。对PTX复合物的设计也可进一步完善, 如增加其他抗肿瘤药物研究联合抗癌效应, 增加靶向标记让其更具肿瘤靶向性等。我们也可以尝试在其他肿瘤中做相应的抗癌评价实验, 这些都有待进一步实验去考证。
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