2019, Vol. 46
2. 复旦大学药学院药理学与生物化学教研室 上海 201203
2. Department of Pharmacology and Biochemistry, School of Pharmacy, Fudan University, Shanghai 201203, China
心肌梗死和卒中是目前致死率最高的两大心脑血管疾病(cardiovascular disease, CVD), 其本质原因是动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)[1]。巨噬细胞的泡沫化是早期AS形成的标志之一[2-4]。研究表明泡沫细胞的形成过程与动脉硬化斑块区的炎症、氧化应激及凋亡等密切相关[5-8]。建立稳定的泡沫细胞模型对研究动脉硬化发生发展的机制至关重要[9-10]。
目前构建泡沫细胞模型最有效的手段是使用氧化性低密度脂蛋白(oxidized lowdensity lipoprotein, ox-LDL)孵育单核-巨噬细胞, 单核-巨噬细胞以THP-1和RAW264.7最为常用[11-12]。利用巨噬细胞源性泡沫细胞模型进行的研究常应用不同的泡沫细胞模型[13-14]。RAW264.7巨噬细胞普遍用于研究泡沫细胞形成过程中的炎症信号通路以及相关分子作用机制[15-17]; 而THP-1巨噬细胞通常用于研究细胞凋亡、自噬及脂质代谢异常等[14, 18-19]。明确不同来源的泡沫细胞的生物学特征(如炎症反应、细胞凋亡、氧化应激等)尤为重要。
本研究旨在使用ox-LDL分别孵育RAW264.7和THP-1来源的巨噬细胞, 以模拟体内泡沫细胞的形成与发展过程。从泡沫细胞中炎症因子的分泌、细胞凋亡以及活性氧(reactive oxygen species, ROS)和丙二醛(malondialdehyde, MDA)水平来比较不同来源的巨噬细胞源性泡沫细胞模型的生物学特征。催化色氨酸(tryptophan, Trp)分解代谢的犬尿氨酸代谢途径(kynurenine pathway, KP)在AS发生中起重要作用, 但作用机制尚不明确[28]。吲哚胺2, 3-双加氧化酶1(indoleamine 2, 3 dioxygenase 1, IDO1)作为KP首个限速酶, 其在不同泡沫细胞模型中的活性变化及系统比较在国内外仍无报道。本研究首次在不同巨噬细胞源性泡沫细胞内检测并比较IDO1的活性变化, 旨在为AS的发病机制及治疗方法提供新思路。
材料和方法试剂和药品 人类单核细胞系THP-1为复旦大学药学院楼滨教授所赠; 鼠单核细胞系RAW264.7(中国科学院细胞库); ox-LDL(上海经科化学科技有限公司); 佛波酯(PMA)(美国Sigma-Aldrich公司); 油红O(上海源叶生物科技有限公司); RPMI 1640细胞培养基、胎牛血清(美国Gibico公司); 细胞凋亡检测试剂盒(上海翊盛生物科技有限公司); MDA检测试剂盒、ROS检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司); 实时定量PCR试剂盒(日本Takara公司); Trizol(美国Thermo Fisher公司); AceQ qPCR SYBR Green Master Mix(南京诺唯赞生物科技有限公司)。其余试剂为国产分析纯或色谱纯。
仪器和设备 Calibur流式细胞仪(美国BD公司); CFX96 Touch基因扩增仪(美国Bio-Rad公司); 超低温冰箱、恒温培养箱、高速冷冻离心机(美国Thermo Fisher公司); 高效液相色谱仪(美国Agilent公司); 倒置荧光显微镜(日本Olympus公司); 多功能酶标仪(美国BioTek公司)。
THP-1细胞培养及泡沫细胞模型构建 在恒温培养箱(37 ℃、5% CO2)中, 采用含有RPMI 1640培养基(含50 mg/mL链霉素、50 U/mL青霉素和20% FBS)培养THP-1单核细胞至指数生长期。按照104~105个/mL的密度接种于6孔培养板内。为使THP-1单核细胞分化形成THP-1巨噬细胞, 更换无血清培养基继续培养细胞, 并加入10 nmol/L PMA处理细胞48 h。对照组用RPMI 1640基础培养基培养。建模组待细胞贴壁后, 吸去上清, 更换为含3% FBS的RPMI 1640培养基, 并加入ox-LDL(终浓度为25 mg/L)处理24 h, 即得人源THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞模型[30]。
RAW264.7细胞培养及泡沫细胞模型构建 在恒温培养箱(37 ℃、5 %CO2)中, 采用RPMI 1640培养基(含50 mg/mL链霉素、50 U/mL青霉素和10% FBS)培养RAW264.7细胞至指数生长期。按照104~105个/mL的密度接种于6孔培养板内。对照组用含10% FBS的RPMI 1640培养基培养。建模组待细胞贴壁后, 吸去上清, 更换为含3% FBS的RPMI 1640培养基, 并加入ox-LDL (终浓度为25 mg/L)处理24 h, 即得鼠源RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞模型[31]。
油红O染色 将RAW264.7和THP-1巨噬细胞均匀接种于6孔板内, 待ox-LDL诱导建模结束后吸去上清, 用预冷的PBS多次洗涤细胞, 在细胞表面加入4 %甲醛固定液, 室温孵育30 min后用PBS洗涤, 再用预冷的60%异丙醇清洗1次。在细胞表面加入60%油红O染色液, 室温下染色30 min。去除细胞表面油红O染色液, 并用预冷的60%异丙醇清洗2次, 将油红O染料完全洗净。加入200 μL PBS, 在荧光倒置显微镜下观察泡沫细胞形态及脂质富集情况[13]。
qRT-PCR检测炎症因子表达 利用Trizol法提取RAW264.7和THP-1巨噬细胞总RNA, 取2 μg RNA, 利用基因扩增仪进行逆转录, 获得cDNA模板, 按照AceQ qPCR SYBR Green Master Mix说明书对样品进行处理, 使用CFX96Touch基因扩增仪进行qRT-PCR, 在Bio-Rad CFX Manager软件中分析结果[13]。引物序列见表 1。
| Genes | Forward (5’-3’) | Reverse (5’-3’) |
| hIL-1β | GCTGAGGAAG ATGCTGGTTC | TCCATATCCTGTCCC TGGAG |
| hIL-10 | CCCTGTGAAAACAAGAGCAAGG | ACCCTGATGTCTCAGTTTCGT |
| hIL-6 | AAATTCGGTACATCCTCGACGG | GGAAGGTTCAGGTTGTTTTCTGC |
| hTGF-β | AACAGCAGCAGCGACCAG | GGAGTTCAGAGGGAAGGCAC |
| mIL-1β | CTGGTGTGTGACGTTCCCAT | TCGTTGCTTGGTTCTCCTTGT |
| mIL-10 | GCTCTTACTGACTGGCATGAG | CGCAGCTCTAGGAGCATGTG |
| mIL-6 | CAGTGGGATCAGCACTAACAGA | GTTGCCAGGTGGGTAAAGTG |
| mTGF-β | AAGACTTCACCCCAAAGCTGG | TGAGCGCTCTCTGAGATCCAA |
流式细胞术检测细胞凋亡 收集经ox-LDL处理的RAW264.7和THP-1巨噬细胞, 4 ℃下300×g离心100 min后收集沉淀, 加入1×结合缓冲液(100 μL)轻轻吹打, 待沉淀完全溶解后分别加入Annexin V-FITC (5 μL)和PI(10 μL), 剧烈震荡, 混匀细胞, 室温下避光静置15 min, 加入1×结合缓冲液, 通过FACS Calibur流式细胞仪进行流式细胞术分析[13]。
ROS水平测定 将RAW264.7和THP-1巨噬细胞均匀接种在96孔板内, 加入ox-LDL孵育24 h后, 更换RPMI1640基础培养基配制的DCFH-DA工作液(1:3 000稀释), 37 ℃恒温培养箱内避光培养20 min。用基础培养基反复洗涤细胞, 以488 nm为激发波长, 530 nm为检测波长, 利用荧光酶标仪检测RAW264.7和THP-1巨噬细胞内荧光强度, 以示ROS水平。
MDA含量测定 收集经ox-LDL处理的RAW264.7和THP-1巨噬细胞, 沉淀于离心管内, 充分裂解细胞, 12 000×g离心10 min, 弃沉淀, 利用BCA蛋白质浓度检测试剂盒检测蛋白质浓度并计算MDA单位重量的蛋白质含量。在离心管中加入100 μL样品上清, 加入不同浓度的标准品绘制标准曲线, 随后加入等体积的MDA检测工作液。在100 ℃预热的干浴锅内加热15 min, 冷却至室温, 1 000×g离心10 min后弃沉淀, 在96孔板内加入上清, 荧光酶标仪以532 nm为检测波长测定吸光度值, 计算MDA摩尔浓度。根据说明书计算公式, 计算最初RAW264.7和THP-1巨噬细胞的MDA含量。
HPLC检测IDO1活性 分别取100 μL经ox-LDL处理的RAW264.7和THP-1巨噬细胞上清液, 去蛋白质处理后上机测定Trp和犬尿氨酸(kynurenine, Kyn)含量, 测定值为实际浓度的1/3。色谱条件:流动相为乙酸钠-乙酸溶液(15 mmol/L, 含体积分数为6%的乙腈, pH=3.6);色谱柱为Agilent Technologies C18柱(250 nm×4.6 mm, 5 μm); 柱温30 ℃; 进样体积20 μL; 流速1.0 mL/min; Trp和Kyn的紫外监测波长分别为280和360 nm[32]。根据Trp和Kyn的峰面积, 利用标准曲线法计算RAW264.7和THP-1巨噬细胞上清中Trp和Kyn含量, 以(Kyn/Trp浓度)×100来表示细胞上清中IDO1活性。
统计学方法 使用SPSS 20.0统计软件进行分析。所有实验数据以x±s表示, 重复3次以上。用t检验分析两组数据间差异, P < 0.05为差异有统计学意义。
结果鼠、人源巨噬细胞源性泡沫模型建立及泡沫细胞形态变化 油红O染色结果如图 1所示。对照组鼠源RAW264.7巨噬细胞内未见红色脂质富集, 细胞形态为梭形; 而经过ox-LDL诱导的细胞内可见大量红色脂质富集, 呈环状整齐排列在细胞膜内侧, 细胞多为扁圆形, 这一现象表明泡沫细胞已经形成(图 1A)。对照组人源THP-1巨噬细胞几乎无红色脂质沉积, 细胞型态为圆形; 经ox-LDL诱导后, 红色脂质明显增多, 在细胞内均匀散落分布, 细胞仍为圆形成团聚集, 表明泡沫细胞已经形成(图 1B)。两种巨噬细胞源性泡沫细胞模型均构建成功, 并存在不同的脂滴分布及形态变化。
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| RAW264.7 (A) and THP-1 (B) macrophages were incubated with ox-LDL for 24 h to form foam cells.Data were based on at least 3 independent experiments. 图 1 鼠、人源巨噬细胞及泡沫细胞的油红染色结果(×600) Fig 1 Oil-red staining of mouse/human macrophages and foam cells (×600) |
ox-LDL对鼠、人源巨噬细胞内炎症因子的影响 qRT-PCR的结果如图 2所示。对照组鼠源RAW264.7巨噬细胞内IL-10、IL-1β、IL-6和TGF-β等4种炎症因子在mRNA水平的表达均偏低, 经ox-LDL诱导后, 细胞内炎症因子的表达均升高, 其中IL-10、IL-6和TGF-β表达大幅度升高, 差异有统计学意义(P < 0.05, 图 2A)。对照组人源THP-1巨噬细胞中, IL-10、IL-1β、IL-6和TGF-β表达水平较低; 经ox-LDL诱导后, IL-10、IL-1β和TGF-β表达均明显上调(P < 0.05, 图 2B), IL-6表达虽有近2倍的升高, 但差异无统计学意义。ox-LDL会引起不同来源的巨噬细胞内炎症因子表达升高, 并加剧巨噬细胞中的炎症反应。
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| RAW264.7 (A) and THP-1 (B) macrophages were incubated with ox-LDL for 24 h.The mRNA levels were measured by qRT-PCR.Data were based on at least 3 independent experiments.(1)P < 0.05. 图 2 ox-LDL对鼠、人源巨噬细胞内炎症因子mRNA水平的影响 Fig 2 The effect of ox-LDL on the mRNA levels of inflammatory factors in mouse/human macrophages |
ox-LDL对鼠、人源巨噬细胞凋亡的影响 利用流式细胞术检测细胞凋亡比率, 并对3次独立实验的各组别总细胞凋亡率(晚期细胞与早期细胞凋亡百分比之和)进行统计(图 3)。发现鼠源RAW264.7巨噬细胞自然凋亡率为9.57%±0.44%, 经ox-LDL处理后细胞凋亡率有所升高(10.36%±0.68%), 但差异无统计学意义(图 3A)。人源THP-1巨噬细胞自然凋亡率为11.26%±8.71%, 经ox-LDL处理24 h后细胞凋亡比率显著增加(26.41%±13.15%, P < 0.05, 图 3B)。ox-LDL可引起两种不同来源的巨噬细胞出现不同程度的凋亡, 其中人源THP-1巨噬细胞对ox-LDL更为敏感。
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| RAW264.7 (A) and THP-1 (B) macrophages were incubated with ox-LDL for 24 h.PI was used for nucleus staining's and Annexin V-FITC was used for cytomembrane staining.The first quadrant represented cellular debris and damaged cells.The second and the third quadrant represented apoptosis cells in late or early stage respectively.The fourth quadrant represented normal cells.The total cell apoptosis was the sum of the percentage of late cell and early cell apoptosis.Data were based on at least 3 independent experiments.(1)P < 0.05. 图 3 ox-LDL对鼠、人源巨噬细胞凋亡的影响 Fig 3 The effect of ox-LDL on the apoptosis of mouse/human macrophages |
ox-LDL对鼠、人源巨噬细胞ROS和MDA的影响 ROS检测结果显示, 对照组鼠源RAW264.7巨噬细胞的ROS荧光强度为48.79±6.41, 加入ox-LDL共孵育24 h后, 细胞内ROS荧光强度达到56.86±9.12, 差异有统计学意义(P < 0.05, 图 4A)。对照组人源THP-1巨噬细胞的ROS荧光强度为46.69±3.69, 加入ox-LDL共孵育24 h后, 细胞内ROS荧光强度显著升高(59.50±12.33, P < 0.05, 图 4B)。MDA检测结果显示, 对照组鼠源RAW264.7和人源THP-1巨噬细胞中MDA含量分别为(0.511±0.219)×103和(1.30±0.081)×103 μmol/mg, 加入ox-LDL诱导后, 两种来源巨噬细胞内MDA水平均明显升高(P < 0.05, 图 4C、4D)。ox-LDL可促使不同来源巨噬细胞中ROS和MDA上调, 进而引发细胞的脂质过氧化反应。
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| RAW264.7 (A) and THP-1 (B) macrophages were incubated with ox-LDL for 24 h.Data were based on at least 3 independent experiments.(1)P < 0.05. 图 4 ox-LDL对鼠、人源巨噬细胞内ROS和MDA水平的影响 Fig 4 The effect of ox-LDL on the levels of ROS and MDA in mouse/human macrophages |
ox-LDL对鼠、人源巨噬细胞内IDO1活性的影响 HPLC检测结果显示, 相较于对照组, 鼠源RAW264.7巨噬细胞加入ox-LDL导致Trp浓度下降近60%, 此时Kyn浓度有所升高, 但差异无统计学意义。KP代谢限速酶IDO1活性由Kyn/Trp来表示[20]。与对照组相比, 加入ox-LDL使鼠源RAW264.7巨噬细胞内IDO1活性升高近2.4倍, 差异有统计学意义(P < 0.05, 图 5A)。人源THP-1巨噬细胞中加入ox-LDL诱导后, 细胞内Trp被消耗约40%, 随着Kyn浓度升高, IDO1活性(Kyn/Trp)升高近3倍, 差异有统计学意义(P < 0.05, 图 5B, 表 2)。ox-LDL可上调RAW264.7和THP-1巨噬细胞内IDO1活性并激活KP。
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| RAW264.7 (A) and THP-1 (B) macrophages were incubated with ox-LDL for 24 h.The activity of IDO1 was represented by the ratio of Kyn/Trp.Data were based on at least 3 independent experiments.(1)P < 0.05. 图 5 ox-LDL对鼠、人源巨噬细胞中KP代谢限速酶IDO1活性的影响 Fig 5 The effect of ox-LDL on the activity of IDO1 (KP rate-limiting enzyme) in mouse/human macrophages |
| (x±s) | ||||
| Index | RAW264.7 | RAW264.7+ox-LDL | THP-1 | THP-1+ox-LDL |
| Trp (μmol/L) | 45.4±35.3 | 13.6±11.3 | 14.16±6.13 | 8.31±3.84 |
| Kyn (μmol/L) | 0.46±0.13 | 0.53±0.24 | 1.52±1.30 | 2.30±1.18 |
| (Kyn/Trp)× 100 | 2.82±1.73 | 6.75±2.46 | 11.2±8.03 | 29.6±6.07 |
AS是一种由不良的适应性免疫反应所驱动的慢性炎症疾病[21]。单核-巨噬细胞、内皮细胞、平滑肌细胞等多种细胞参与AS的发生、发展[22]。ox-LDL是公认的诱导血管内壁炎症反应的主要危险因素之一, 可以诱导单核细胞分化成巨噬细胞, 并激活巨噬细胞内的免疫反应, 随后引发脂质积累和泡沫细胞形成, 在AS的发生、发展过程中起着至关重要的作用[23-24]。ox-LDL诱导构建的不同泡沫细胞模型常应用于不同的研究中, 因此明确不同来源的泡沫细胞在AS发生、发展过程中的生物学特征, 对于进一步阐述AS机制具有重要意义[13-14]。本研究通过给予巨噬细胞ox-LDL成功建立鼠源RAW264.7和人源THP-1巨噬细胞泡沫细胞模型。通过油红O染色实验发现, 大量红色脂质颗粒在不同来源的巨噬细胞内富集, 但分布略有不同, 这与以往的研究结果相符合。巨噬细胞大量吞噬脂蛋白形成泡沫细胞后, 会分泌各种细胞因子, 从而进一步影响局部炎症反应以及细胞黏附、增殖等特征, 最终导致AS病灶形成[25]。本研究发现ox-LDL可以引发RAW264.7和THP-1巨噬细胞大量分泌IL-10、IL-1β、IL-6和TGF-β, 从而在细胞内引发剧烈的炎症反应, 但这些细胞因子参与的炎症信号传导通路目前尚不清楚。
ox-LDL会通过一些信号通路诱发较强的细胞毒性作用, 最终可导致巨噬细胞、平滑肌细胞、内皮细胞的退化凋亡[26]。本研究发现相同浓度ox-LDL诱导后, THP-1凋亡比率增加近2倍, 而RAW264.7凋亡比率基本不变。这一结果证明, ox-LDL会引起不同来源的巨噬细胞产生不同的凋亡特性, THP-1对ox-LDL引起的细胞凋亡更为敏感。在今后的研究中, 选取人源THP-1巨噬细胞探索ox-LDL诱导的巨噬细胞凋亡信号通路更具科学性。LDL是导致AS病灶区脂质堆积的主要原因之一, 而ox-LDL含有的氧化成分会对巨噬细胞造成额外的氧化损伤, 过多摄入ox-LDL更易促使巨噬细胞破裂死亡, 最终加速AS斑块形成[27]。本研究结果显示, 加入ox-LDL不仅会造成鼠源RAW264.7和人源THP-1巨噬细胞内脂质沉积, 同时也显著上调细胞内ROS和MDA表达, 从而诱发脂质过氧化并直接对细胞造成损伤。因此, 减少巨噬细胞的氧化损伤, 增强巨噬细胞的抗氧化能力对AS的防治与治疗具有重要意义。
活化的KP对AS发生发展至关重要, IDO1作为KP的首个限速酶, 其活性与早期AS发生呈显著正相关[28-29]。在鼠源RAW264.7巨噬细胞和人源THP-1巨噬细胞中, ox-LDL都会引起IDO1活显著上调, 表明ox-LDL会激活不同来源的巨噬细胞的KP。同时在细胞水平上证实, KP代谢限速酶IDO1活性与泡沫细胞的形成呈正相关, 我们认为IDO1活性可以作为泡沫细胞形成的标志, 但其是否可以作为AS形成的生物指标还有待进一步研究。抑制IDO1活性或KP途径的代谢产物或可为阻断AS的发展提供新的治疗思路, IDO1抑制剂或将成为预防AS的新型治疗药物。
综上所述, RAW264.7和THP-1细胞均可为研究AS发生发展机制提供稳定可靠的泡沫细胞模型, 不同来源的泡沫细胞模型的生物学特征不完全相同。针对不同的生物学特征, 选择合适的细胞模型, 将使今后的研究更具有针对性、科学性。通过ox-LDL对鼠源RAW264.7和人源THP-1巨噬细胞产生的多种影响, 我们认为减缓ox-LDL引起的炎症反应, 防止巨噬细胞内的脂质富集, 减少巨噬细胞内脂质氧化损伤, 选择性调控ox-LDL引发的凋亡和KP激活或将成为有效治疗AS的手段。
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