2019, Vol. 46
变应性鼻炎(allergic rhinitis, AR)是由变应原诱导、免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig)-E介导、Th2细胞促发的发生于鼻腔黏膜的变态反应性炎症。在AR发病的各种信号通路中, Th2细胞(适应性免疫的关键细胞)合成和释放的Ⅱ型细胞因子白介素(interleukin, IL)-4、IL-5、IL-9和IL-13等起着枢纽的作用[1]。大量研究证实, 无论是适应性免疫还是固有免疫, 都在AR的发病机制中起着重要作用[2]。
固有淋巴样细胞(innate lymphoid cells, ILCs)是固有免疫的关键细胞, nuocyte细胞属于Ⅱ型(IL2Cs)中的一种。该细胞是在对小鼠寄生虫免疫的研究中发现的。nuocyte细胞在IL-25和/或IL-33的作用下, 可在小鼠寄生虫模型的肠系膜淋巴结和脾脏中大量增殖, 产生和释放Ⅱ型细胞因子如IL-5、IL-13等, 尤其是IL-13, 也能产生少量IL-10[3]。随后的研究发现, nuocyte细胞在小鼠哮喘模型的肺组织中也出现增殖, 并可以直接导致支气管的高反应性, 其诱发机制主要是通过释放大量IL-13而增加了支气管黏膜的炎症反应所致[4]。IL-5可以趋化和激活嗜酸性粒细胞(eosinophil, Eos)[5], IL-13可以促进杯状细胞的增生和黏膜下腺体的分泌, 还能诱发气道的高反应性[6]。
我们前期的研究显示, nuocyte细胞在卵清蛋白(ovalbumin, OVA)诱导建立的AR小鼠模型的鼻相关淋巴组织(nasal-associated lymphoid tissue, NALT)中出现增殖, 并发现将体外培养的OVA诱导NALT来源的nuocyte细胞过继转移给小鼠后, 可以加剧AR小鼠鼻腔黏膜的变应性炎症[7], 这种作用也是通过nuocyte细胞产生和释放IL-5和IL-13而诱发的。目前大多数关于nuocyte细胞的研究重心都放在这两种细胞因子上, 而对于该细胞分泌的IL-10及其可能的作用研究甚少。本研究旨在探讨体外小鼠nuocyte细胞中IL-13的干预对CD4+IL10+细胞分化的影响。
材料和方法实验动物 健康雌性BALB/c小鼠(SPF级)12只, 6~8周龄, 购自中科院上海实验动物中心, 由复旦大学上海医学院实验动物科学部代养。本研究获得复旦大学实验动物科学部动物福利和伦理小组的批准(伦理号:201808001Z)。实验动物随机分为2组, 每组6只。
动物模型的建立 按照已经出版的建模方法[8], 以浓度为0.5 mg/mL的OVA(美国Sigma公司)和20 mg/mL的Al(OH)3生理盐水溶液共0.2 mL对小鼠进行腹腔注射致敏, 致敏3次, 每周1次(第1、8和15天), 然后用浓度为40 mg/mL的OVA生理盐水溶液0.02 mL滴入小鼠鼻孔进行激惹, 每天1次(第22天至29天), 共8次, 即为AR小鼠; 对照组只用生理盐水(正常组)(图 1)。打喷嚏和挠鼻次数在最后一次激惹结束后10 min进行计数。
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| 图 1 AR小鼠模型的建模步骤 Fig 1 Protocols of AR mice models |
小鼠NALT和外周血单个核细胞的获取 处死小鼠, 去掉其前牙和面颊部肌肉, 由硬腭后半部边缘以细针头小心获取NALT组织, 并将该组织放入添加了10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的RPMI 1640培养基中, 然后将其通过70 μm Falcon细胞筛网滤过, 并用三羟甲基氨基甲烷-氯化铵缓冲液(0.83% NH4Cl和20 mmol/L Tris/Cl)裂解红细胞; AR小鼠外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)的获取采用常规摘除小鼠眼球法。
nuocyte细胞的获取 NALT细胞悬液在4 ℃温度和200×g离心10 min后进行流式细胞仪检测。根据多项相关研究所证实的nuocyte细胞膜表面分子表达的特点即CD3CD4CD8CD19CD11bCD11cFcεR1 (lineage)-ICOS+进行设门, 细胞用200 μL流式细胞液(1%牛血清白蛋白溶液和0.1% PBS溶液)洗涤, 并与兔血清在室温下共培养5 min以封闭Fcγ, 然后再用流式细胞液洗涤3次, 将细胞调成浓度为1×108/mL, 分别用50 μL结合了荧光素异硫氰酸酯-葡聚糖的一抗(抗CD3、CD4、CD8、CD19、CD11b、CD11c、FcεR1的抗体, 美国MyBioSource公司或美国BioLegend公司)在4 ℃温度下染色30 min, 随后用结合了藻红蛋白的单克隆抗体(抗ICOS的抗体, 美国MyBioSource公司)再染。再次洗涤, 并与结合了生物素的50 μL兔抗小鼠的二抗IgG共培养, 随后加入50 μL结合了链霉亲和素的藻红蛋白(丹麦Dako公司), 对照组只用与上述抗体同型的一抗染色。样品用装备了ACSDIVA软件系统(美国BD Biosciences公司)的LSR Ⅱ型流式细胞仪进行分析, 并用FlowJo version 10进行数据输出。
nuocyte细胞体外培养和rmIL-33干预 nuocyte细胞分离、提纯后调成6 × 107/mL浓度, 并在含有10% FBS、1%青霉素/链霉素、0.1% β-巯基乙醇、10 ng/mL小鼠重组(recombinant, rm)IL-7(美国MyBioSource公司)和10 ng/mL小鼠rmIL-33(美国MyBioSource公司)的RPMI培养基中体外培养6天。然后收集nuocyte细胞, 重新加入100 ng/mL小鼠rmIL-33(美国MyBioSource公司)培养3天, ELISA法检测细胞上清液中IL-13和IL-10的浓度。
IL-13 shRNA慢病毒的构建及转染 IL-13 shRNA序列的选择和含有该序列慢病毒的构建均由生工生物工程(上海)股份有限公司提供, 用293T细胞包装慢病毒, 以PANC细胞检测慢病毒转染效率, 4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚(4′, 6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)作为核染色的空白对照, 构建完成后, 将其以1× 109 TU/mL的滴度加入nuocyte细胞培养基进行转染, 3天后, 用ELISA法检测培养基上清液中IL-13和IL-10的浓度。
具体方法分别按照小鼠IL-13和IL-10 ELISA试剂盒(美国MyBioSource公司)所规定的步骤进行。
CD4+ T细胞的获取 小鼠CD4+ T细胞的分离、提纯按照相关试剂盒EasySepTM Mouse CD4+ T Cell Isolation Kit (加拿大STEMCELL公司)所规定的步骤进行, 该方法获得的CD4+ T细胞得率高、纯度高, 方便下一步实验; 将分选出的CD4+ T细胞调成浓度5 × 105/mL并移入T细胞培养基(1640, 10% FBS, 1%青霉素-链霉素, 50 μmol/L β-巯基乙醇, 100 U/mL IL-2)中体外培养6天, 然后把nuocyte细胞加入CD4+ T细胞培养基中, 共培养3天, 检测CD4+IL10+细胞占CD4+ T细胞的百分比。
CD4+IL10+细胞的检测 流式细胞仪检测CD4+IL10+细胞占CD4+ T细胞的百分比, 方法和步骤同上述“nuocyte细胞的获取”, 一抗分别用结合了FITC的抗CD4抗体和结合了PE的抗IL-10抗体, 所得数据用FlowJo 10进行分析。
统计学分析 采用GraphPad Prism 6统计软件分析所得数据。因数据经检验呈正态分布, 而样本量又较小, 所以组内差异的比较采用t检验, 组间差异的比较采用方差分析。本试验中数据用x±s表示, P < 0.05为差异有统计学意义。
结果AR小鼠模型的建立 小鼠采用经典方式建模, OVA腹腔内致敏, OVA及其佐剂鼻内激惹(图 1)。末次激惹后10 min, 分别计数小鼠打喷嚏和挠鼻次数, 发现AR组与正常组比较, 差异具有统计学意义, AR模型明显超过正常小鼠(t=54.44, P < 0.000 1;t=33.75, P < 0.000 1)。提示AR小鼠模型建立成功。
nuocyte细胞的鉴定 建模后, 用流式细胞仪设门技术, 分选、提纯NALT中nuocyte细胞。nuocyte细胞被鉴定为CD3CD4CD8CD19CD11bCD11cFcεR1 (lineage)-ICOS+(图 2A和B), 而且AR小鼠的nuocyte细胞数较正常小鼠显著增多(图 2C)。
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| A:NALT nuocytes from normal mice; B:NALT nuocytes from AR mice; C:Comparison of nuocytes numbers in normal and AR mice.AR:Allergic rhinitis. 图 2 小鼠AR模型的NALT中nuocyte细胞的流式细胞仪分析 Fig 2 Flow cytometry analysis of NALT nuocytes from AR mice models |
nuocyte细胞的转染率 IL-13 shRNA慢病毒转染nuocyte细胞的效率以分析绿色荧光蛋白在转染的PANC细胞中的表达量来评估, 感染复数设置为10, IL-13 shRNA的转染率为98.28%;IL-13的转录抑制率以分析其mRNA在PANC细胞中的含量来评估, 当感染复数设置为10时, IL-13 shRNA的抑制率为90.5%。nuocyte细胞的转染定性评估见图 3A和3B。
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| A:Blank control, blue fluorescence indicated DAPI staining (× 400);B:Positive staining of nuocytes, green fluorescence indicated transfection of nuocytes by lentivirus with IL-13 shRNA (× 400). 图 3 IL-13 shRNA慢病毒转染nuocyte细胞 Fig 3 Transfection of nuocytes by lentivirus with IL-13 shRNA |
nuocyte细胞对rmIL-33的反应 nuocyte细胞的特点是合成和释放Ⅱ型细胞因子如IL-13, 也可以释放少量的抑制性细胞因子IL-10。为了检测OVA诱导NALT来源的nuocyte细胞是否具有其相应的功能, 我们用ELISA法检测体外培养的此种细胞是否分泌IL-13和IL-10, 以及是否受IL-13 shRNA慢病毒转染的影响。结果发现, 转染前rmIL-33干预后体外培养的细胞大量释放IL-13和IL-10, IL-13与IL-10浓度均显著高于干预前, 差异有统计学意义(t=22.62、11.93, P均 < 0.000 1, 图 4A、B)。这证明OVA诱导产生的nuocyte细胞具有其正常的功能。而转染后, rmIL-33干预后体外培养的nuocyte细胞释放IL-13没有明显升高, 与干预前相比较, 其浓度差异无统计学意义(图 4C)(t=1.67, P=0.14), 而IL-10的浓度干预后显著高于干预前(图 4D)(t=30.45, P < 0.000 1)。转染前IL-13的浓度明显高于转染后(图 4E)(t=22.54, P < 0.000 1), IL-10的浓度明显低于转染后(图 4F)(t=9.29, P < 0.000 1), 差异均有统计学意义。
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| A:Concentration of IL-13 in the cultures before transfection; B:Concentration of IL-10 in the cultures before transfection; C:Concentration of IL-13 in the cultures after transfection; D:Concentration of IL-10 in the cultures after transfection; E:Comparison of concentration of IL-13 in the cultures before and after transfection; F:Comparison of concentration of IL-10 in the cultures before and after transfection. 图 4 转染前后AR小鼠NALT来源的nuocyte细胞对rmIL-33干预后的反应 Fig 4 Response of NALT-derived nuocytes to rmIL-33 before and after transfection |
nuocyte细胞对CD4+ T细胞的诱导 为了证实nuocyte细胞对CD4+ T细胞的诱导作用及是否受IL-13 shRNA慢病毒转染的影响, 我们将转染前后NALT来源的该细胞与CD4+ T细胞培养基进行体外共培养, 结果发现CD4+IL10+细胞所占CD4+ T细胞百分比发生变化(图 5A和5B), 转染后的nuocyte细胞共培养后, CD4+IL10+细胞百分比明显升高(t=10.00, P < 0.0001)(图 5C)。这表明, nuocyte细胞受IL-13 shRNA慢病毒转染的影响, 促进CD4+ T细胞向CD4+IL10+细胞的分化。
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| A:Flow cytometry analysis of CD4+IL10+ cells in the cocultures before transfection, Q2 area indicated CD4+IL10+ cells; B:Flow cytometry analysis of CD4+IL10+ cells in the cocultures after transfection; C:Comparison of percentage of CD4+IL10+ cells in total CD4+ T cells before and after transfection. 图 5 nuocyte细胞对CD4+ T细胞的诱导 Fig 5 Induction of CD4+IL10+ cells from CD4+ T cells by nuocytes |
变态反应性炎症中适应性免疫系统Th2细胞是Ⅱ型细胞因子如IL-4、IL-5、IL-9和IL-13的主要来源, 但越来越多的研究证实, 固有免疫系统ILC2s也可以产生这类细胞因子, 并诱发Eos局部的浸润、肥大细胞的增殖、杯状细胞的增生和分泌的病理改变[9]。还有研究表明, IL-13可直接导致呼吸道高反应, Th2细胞并非是该细胞因子的主要来源, ILC2s才是[10]。有学者按照ILC的特点和功能将其分为3型:ILC1s、ILC2s和ILC3s, 每型都有相应的细胞种类。nuocyte细胞属于Ⅱ型; ILC2s还包括自然辅助细胞和固有辅助细胞Ⅱ型, 虽然这些细胞种类不同, 但它们共同的特点都是表达IL-25受体(IL-17BR)和IL-33受体(T1/ST2), 均可在IL-25和IL-33的作用下产生炎症介质IL-5和IL-13[11]。变态反应性炎症状态下, IL-25和IL-33主要由呼吸道上皮细胞产生[12], 虽然它们属于不同的细胞因子家族, 但却具有上述类似的细胞反应[13]。大量研究证实, 这两种细胞因子可以诱导Ⅱ型免疫反应, 用IL-25和/或IL-33干预后, 会产生大量Ⅱ型细胞因子如IL-5和IL-13, 并导致局部相应的病理改变[14-15]。
nuocyte细胞除了分泌Ⅱ型细胞因子促进炎症反应外, 也可以产生和释放少量IL-10。目前关于nuocyte细胞的研究重心大都放在IL-5和IL-13两种细胞因子上, 而对于该细胞分泌的IL-10及其可能的作用研究甚少。但该细胞既然释放IL-10, 可能就会有相应的功能, 而IL-10又有诱导CD4+T细胞向CD4+IL10+细胞分化的作用, 因此我们课题组假设nuocyte细胞来源的IL-10可能会影响T辅助细胞向CD4+IL10+细胞的分化。本研究即是初步探讨体外小鼠nuocyte细胞中IL-13的干预是否会影响IL-10的产生和释放, 并进一步探讨后者对CD4+T细胞向CD4+IL10+细胞分化可能造成的影响。
本研究中, 用OVA建模后, 小鼠打喷嚏和挠鼻次数明显增加, 说明AR小鼠模型建立成功。我们选择AR小鼠NALT中的nuocyte细胞, 是因为炎症状态下的该细胞数目不仅增多(本研究中也显示AR小鼠的nuocyte细胞数较正常小鼠显著增多), 而且处于激活状态, 方便对其功能进行研究。获得了AR小鼠的nuocyte细胞后, 在体外对其功能进行了检测, 发现其在转染前受到小鼠rmIL-33的干预后大量释放IL-13, 并释放少量的IL-10, 说明该细胞功能正常。随后, 我们构建了IL-13 shRNA, 并以慢病毒为载体体外转染到nuocyte细胞中, 以抑制IL-13基因在该细胞中的表达。我们没有直接用IL-13基因敲除小鼠, 因为IL-13-/-小鼠建模不成功会对研究造成较大影响(数据尚未发表), 而携带有IL-13 shRNA的慢病毒转染稳定, 且只影响nuocyte细胞产生和释放IL-13的功能, 结果更客观与可靠。结果发现, nuocyte细胞经转染后, rmIL-33的干预没有使nuocyte细胞释放IL-13的浓度升高, 与干预前相比较, IL-13的浓度差异不具有统计学意义, 但分泌IL-10的浓度差异具有统计学意义, 干预后显著高于干预前。IL-13的浓度变化转染前明显高于转染后, 差异具有统计学意义, IL-10的浓度变化转染前明显低于转染后, 差异也具有统计学意义。这说明, nuocyte细胞中IL-13基因转录的阻滞可以使抑制性细胞因子IL-10的产生和释放增加, 可能在两种细胞因子的基因序列之间有某种联系, 目前其机制尚不清楚。我们又将转染前后的nuocyte细胞加入体外培养的CD4+ T细胞中, 以评估该细胞对CD4+IL10+细胞的分化是否有诱导作用。结果发现CD4+IL10+细胞所占CD4+ T细胞百分比发生变化, 转染后的nuocyte细胞共培养后CD4+IL10+细胞百分比明显升高。这表明该细胞受IL-13 shRNA慢病毒转染的影响, IL-13释放量减少, 而IL-10释放量增加, 后者可通过其位于CD4+ T细胞上的相应受体, 调节该细胞向CD4+IL10+细胞的分化[16]。
nuocyte细胞也可以产生和释放IL-5, 但其量甚微, 该细胞的主要特点是产生IL-13, 并在局部组织(如肠道和肺组织)中实施相应功能[3-4], 所以本研究中未检测IL-5, 而IL-13 shRNA的作用是否也会影响IL-5的产生, 后者浓度的改变是否也会诱导CD4+IL10+细胞比例增加, 尚待进一步研究。
CD4+IL10+细胞可通过产生和分泌IL-10抑制局部的炎症反应, 就AR或哮喘等呼吸道的变态反应性炎症而言, 该细胞通过释放IL-10, 后者通过其受体激活抑制气道炎症的通路, 从而减轻鼻黏膜或支气管黏膜的变应性炎症[17]。因此, 可以考虑设计某种药物或其他相关治疗方法, 通过抑制nuocyte细胞中IL-13基因的转录表达, 从而增加IL-10的产生和释放, 在直接抑制炎症反应的同时, 诱导CD4+ T细胞向CD4+IL10+细胞转化, 后者再释放IL-10, 继续抑制局部的炎症。
本研究发现体外小鼠nuocyte细胞中IL-13基因的干预可以促进CD4+ T细胞向CD4+IL10+细胞的分化, 但IL-13浓度的降低与IL-10的释放增多之间是否存在某种调控机制, 以及IL-13 shRNA是否会直接影响IL-10的表达, 尚待进一步研究。
| [1] |
DULLAERS M, DE BRUYNE R, RAMADANI F, et al. The who, where, and when of IgE in allergic airway disease[J]. J Allergy Clin Immunol, 2012, 129(3): 635-645.
[DOI]
|
| [2] |
MATSUSHITA K, KATO Y, AKASAKI S, et al. Proallergic cytokines and group 2 innate lymphoid cells in allergic nasal diseases[J]. Allergol Int, 2015, 64(3): 235-240.
[DOI]
|
| [3] |
NEILL DR, WONG SH, BELLOSI A, et al. Nuocytes represent a new innate effector leukocyte that mediates type-2 immunity[J]. Nature, 2010, 464(7293): 1367-1370.
[DOI]
|
| [4] |
BARLOW JL, BELLOSI A, HARDMAN CS, et al. Innate IL-13-producing nuocytes arise during allergic lung inflammation and contribute to airways hyperreactivity[J]. J Allergy Clin Immunol, 2012, 129(1): 191-198.e1-4.
[DOI]
|
| [5] |
DURHAM SR, YING S, VARNEY VA, et al. Cytokine messenger RNA expression for IL-3, IL-4, IL-5, and granulocyte/macrophage-colony-stimulating factor in the nasal mucosa after local allergen provocation:relationship to tissue eosinophilia[J]. J Immunol, 1992, 148(8): 2390-2394.
[URI]
|
| [6] |
GANDHI NA, PIROZZI G, GRAHAM NMH. Commonality of the IL-4/IL-13 pathway in atopic diseases[J]. Expert Rev Clin Immunol, 2017, 13(5): 425-437.
[DOI]
|
| [7] |
LIN L, DAI F, WEI JJ, et al. Allergic inflammation is exacerbated by allergen-induced type 2 innate lymphoid cells in a murine model of allergic rhinitis[J]. Rhinology, 2017, 55(4): 339-347.
[DOI]
|
| [8] |
HIROMURA Y, KISHIDA T, NAKANO H, et al. IL-21 administration into the nostril alleviates murine allergic rhinitis[J]. J Immunol, 2007, 179(10): 7157-7165.
[DOI]
|
| [9] |
PAUL WE. What determines Th2 differentiation, in vitro and in vivo?[J]. Immunol Cell Biol, 2010, 88(3): 236-239.
[DOI]
|
| [10] |
WALTER DM, MCINTIRE JJ, BERRY G, et al. Critical role for IL-13 in the development of allergen-induced airway hyperreactivity[J]. J Immunol, 2001, 167(8): 4668-4675.
[DOI]
|
| [11] |
SPITS H, ARTIS D, COLONNA M, et al. Innate lymphoid cells--a proposal for uniform nomenclature[J]. Nat Rev Immunol, 2013, 13(2): 145-149.
[DOI]
|
| [12] |
FAHY JV, LOCKSLEY RM. The airway epithelium as a regulator of Th2 responses in asthma[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2011, 184(4): 390-392.
[DOI]
|
| [13] |
MJÖSBERG JM, TRIFARI S, CRELLIN NK, et al. Human IL-25-and IL-33-responsive type 2 innate lymphoid cells are defined by expression of CRTH2 and CD161[J]. Nat Immunol, 2011, 12(11): 1055-1062.
[DOI]
|
| [14] |
FORT MM, CHEUNG J, YEN D, et al. IL-25 induces IL-4, IL-5, and IL-13 and Th2-associated pathologies in vivo[J]. Immunity, 2001, 15(6): 985-995.
[DOI]
|
| [15] |
SCHMITZ J, OWYANG A, OLDHAM E, et al. IL-33, an interleukin-1-like cytokine that signals via the IL-1 receptor-related protein ST2 and induces T helper type 2-associated cytokines[J]. Immunity, 2005, 23(5): 479-490.
[DOI]
|
| [16] |
RONCAROLO MG, GREGORI S, BATTAGLIA M, et al. Interleukin-10-secreting type 1 regulatory T cells in rodents and humans[J]. Immunol Rev, 2006, 212: 28-50.
[DOI]
|
| [17] |
GELFAND EW. Inflammatory mediators in allergic rhinitis[J]. J Allergy Clin Immunol, 2004, 114(5 Suppl): S135-S138.
[URI]
|