对于大部分器官功能衰竭患者来说，器官移植是延续生命的唯一希望，但器官短缺困境长期存在，制约临床器官移植开展。美国政府器官捐献网站（https://www.organdonor.gov）数据显示：2022年6月，在美国器官移植等待者超过10.6万，而2021年全年实施器官移植仅4万例。在中国，每年因器官功能衰竭而需要器官移植的患者约有30万，而每年完成器官移植数量约2万例，供需比例严重失衡。异种移植由于供体器官来源不受数量和时间的制约，可以更好地满足临床需要，最有可能成为解决这一难题的有效方法。

2021年底至今，美国连续报道4例转基因猪器官移植到人体的异种器官移植试验^[1-4]。这些临床最新进展，彻底打破了该领域持续30年的沉静，引发了全世界的广泛关注。特别是2022年1月7日，美国马里兰大学医学中心Griffith等首次将基因修饰猪的心脏移植给晚期心脏病患者，患者术后没有出现严重排斥反应，猪心也开始发挥正常功能^[2]。尽管这位接受猪心移植的57岁患者在术后2个月去世，但此次手术为异种移植研究提供了诸多有价值的科学数据^[5]。这是人类首次成功将转基因猪心脏移植到患者体内，必将作为器官移植发展道路上的里程碑载入史册。

心脏作为异种移植研究最多的实体器官之一，可以很好诠释异种移植的发展历程。在本篇综述中，我们将简要回顾心脏异种移植的历史，重点阐述临床异种移植研究现状及面临的挑战，为迎接即将到来的异种移植临床试验做准备。

异种移植历史   异种移植是指将动物源性的活细胞、组织、器官，或者经体外异种材料培育的人源性细胞、组织、器官，以移植、接种或注射的方式植入人体内的过程^[6]。1964年，James Hardy完成首例黑猩猩-人的异种心脏移植手术，患者术后2 h死亡^[7]。1977年，Barnard分别用狒狒和黑猩猩心脏先后完成两例异种心脏移植，患者术后分别存活5.5 h和4天^[7]。此后，最著名的异种心脏移植试验当属1984年Bailey将一颗狒狒心脏移植给一名出生12天的婴儿，移植手术虽然获得成功，但患者术后20天仍因排斥反应死亡^[8]。该异种心脏移植案例极大推动了社会对儿童器官捐献的关注，这远比移植本身更具有意义。尽管免疫抑制药物研发取得进展，但异种移植效果却没有明显改善，说明单纯靠药物并不足以跨越异种移植的鸿沟。1996年Baruah在印度实施的猪心异种移植是20世纪最后1例文献报道的人体异种心脏移植试验^[9]。

由于对人畜共患病特别是猪逆转录病毒感染的担忧，1999年美国FDA规定：因缺乏有效手段检测和预防猪逆转录病毒感染措施，在这个问题没有得到有效解决之前，禁止开展异种移植临床试验^[10]。2000年，国际心肺移植协会也发表声明，鉴于前期异种移植人体试验结果普遍不佳，建议开展人体异种移植之前，在非人灵长类动物（non-human primate，NHP）模型中保证至少60%实验动物术后存活时间达到3个月^[11]。之后的时间，虽然在全世界范围内没有再开展异种心脏移植临床试验，但在异种移植的基础研究和动物实验方面都取得了巨大的进展。特别是2021年9月之后，美国多个移植中心连续开展4例异种移植人体试验，被称为异种移植的“破冰之旅”，标志着停滞多年的异种移植临床试验又向前迈进了一大步^[4]。

异种移植的免疫壁垒  与同种异体器官移植相比，异种移植由于物种之间存在遗传背景巨大差异，移植后的异种器官容易遭受更强烈、更复杂的排斥反应。几种主要类型的排斥反应为：超急性排斥反应（hyperacute rejection，HAR），急性体液性异种移植排斥反应（acute humoral xenograft rejection，AHXR）和急性细胞性排斥反应（acute cellular rejection，ACR）。除了免疫排斥之外，异种移植后凝血功能失调和炎症反应也变得更加突出，均可导致移植失败。

进行异种移植首先需要选择能提供合适的、能满足人类生理需求的动物。虽然NHP（主要指旧大陆猴，如大猩猩、狒狒、猕猴等）与人类在免疫、解剖及生理学方面更接近，但是由于担心存在病毒交叉感染风险，而且数量稀少、繁殖不易，并不适合作为供体。现在，人们更倾向选择将猪作为供体。猪作为异种心脏移植供体有诸多优势：容易饲养及便于进行基因改造，心脏大小与人匹配且便于获取，相对较低的感染风险，伦理和情感上更容易为社会大众所认可。基于上述理由，目前猪被广泛作为开展各种异种心脏移植研究和临床应用的潜在供源^[12]。猪-NHP模型是测试灵长类动物对转基因猪器官或组织的免疫反应以及新型免疫抑制方案效果的标准模型，作为进入临床试验前的最后一步，它被认为是测试人类异种移植免疫反应的最佳试验场。

当一个野生型猪器官被移植到人类或NHP后，移植物通常在数分钟到数小时内被迅速破坏，这一过程被称为HAR，是异种移植的最大障碍。HAR是一种体液免疫排斥反应，由受体血清中预存天然抗体与猪内皮细胞表面的异种抗原表位相结合，触发并激活补体系统，促进内皮细胞活化和损伤，进一步引起血小板聚集和微血管血栓形成，移植物血管系统被迅速破坏而导致移植物失功。目前研究已经证实，存在于猪血管内皮细胞表面的α-1，3-半乳糖（α-1，3-galactosyl，α-Gal）、N-羟乙酰神经氨酸（N-glycolylneuraminic acid，Neu5Gc）和Sd（a）血型是引起HAR和AHXR的3种主要异种抗原，人类或NHP类动物体内95%的预存抗猪抗体主要针对这3种异种抗原^[13]。在猪心移植到人类或NHP类动物之前，消除这3种异种抗原导致的HAR和AHXR是首先需要攻克的壁垒。

2003年，α-Gal基因敲除猪（GTKO猪）首次培育成功，是异种移植领域的一个里程碑^[14]。此后，随着基因编辑技术的不断进步，尤其是成簇的规律间隔的短回文重复序列-cas9（CRISPR/cas9）技术的应用，生产具有多个编辑基因的源猪变得越来越容易和快速。在α-Gal基因敲除猪的基础上，又相继成功培育出GGTA1/CMAH或GGTA1/B4GalNT2双基因敲除猪（DKO猪）和GGTA1/CMAH/B4GalNT2三基因敲除猪（TKO猪）。TKO猪的培育成功基本消除了异种抗原引起的HAR，为异种移植跨越物种免疫屏障清除了主要障碍。但是，通过TKO猪红细胞与狒狒或旧大陆猴血清抗体结合试验发现，狒狒体内血清中仍有部分预存抗体可针对TKO猪红细胞产生细胞毒性反应，据此推测除了上述3种主要异种抗原，猪体内还可能存在“第四种”异种抗原^[15]。有关“第四种”抗原的结构、性质和具体功能，以及在人体内是否有针对“第四种”异种抗原的预存抗体存在，还需要进一步研究证实。

受体补体系统激活是导致异种移植失败的另一个危险因素。以往方法是用药物提前抑制补体活化进行预防，但仅仅起到短期效果，而且还增加了感染风险。目前的主要方法是利用基因修饰方法使猪心表达人补体调节蛋白，通过大量补体调节蛋白抑制受体补体系统激活。猪本身拥有的多种补体调节蛋白（complement pathway regulatory proteins，CRPs）与人类相似，但仍不足以保护其内皮细胞免受人类补体系统的攻击^[8]。因此，将人CRPs基因（如hCD46、hDAF及hCD59等）导入猪细胞，起到保护移植器官免受补体系统攻击的作用，延长移植器官存活时间^{[12, 16]}。用于异种移植的第一种转基因猪，就是通过基因修饰技术使猪移植器官表达人补体调节蛋白衰变加速因子（decay acceleration factor，DAF），减少受体补体系统激活，使其免遭排斥损伤^[17]。

除了HAR和AHXR，ACR在异种移植中的研究报道相对较少。ACR包括固有免疫反应（主要由巨噬细胞、中性粒细胞、DC细胞和NK细胞参与）和适应性免疫反应（T细胞和B细胞参与）。通过直接通路和非直接通路活化的T细胞在ACR中发挥重要作用。虽然异种移植后ACR比同种移植更为常见和强烈，但仍可以通过阻断T细胞活化共刺激通路（如CD40-CD154和CD28-CD80/86通路）和有效的免疫抑制方案得到解决^[8]。

进一步研究发现，异种移植后除了需要克服HAR、AHXR和ACR，凝血功能失调问题也非常突出。异种移植后的凝血功能障碍主要表现为血栓性微血管病和全身消耗性凝血病。由于灵长类动物和猪在凝血/抗凝因子之间存在着不相容性，这种不相容性可导致凝血功能障碍^[18]。早期，研究者曾尝试通过优化术后抗凝治疗方案来解决凝血功能障碍问题，但效果欠佳。目前，研究人员利用分子生物学和基因编辑技术，在供体猪中导入人类凝血调节蛋白基因，使其过度表达人类凝血调节蛋白（如hTBM、hEPCR、hTFPI和hCD39），成为克服凝血障碍的重要途径。在猪-狒狒心脏移植模型中已证实，移植心脏上hTBM蛋白的过度表达对延长移植物存活时间具有独立保护作用。抗凝系统中的另一个关键角色是EPCR，不但在克服凝血障碍中发挥重要作用，它还具有抗炎症反应功能。

越来越多的证据表明，异种移植受体的全身炎症反应状态对移植物存活也起着相当大的作用。因此，一些表达人类抗炎基因（包括hHO1、hCD47和hA20）的基因编辑猪已被成功培育。通过研究证实，表达hHO1可保护猪主动脉内皮细胞免受异种移植排斥反应的损伤。进一步研究表明，与仅表达一种抗炎蛋白相比，多种抗炎蛋白的组合表达可以提供更有效的保护作用^[13]。

利用猪-NHP异种移植模型有助于更好地理解异种移植的免疫机制，这对于将异种移植过渡到临床应用至关重要。然而，由于人类和NHP免疫系统之间本身还存在差异，异种移植从动物试验过渡到临床仍有许多问题需要进一步阐明。

人畜共患病  在临床试验中，未知微生物感染带来的潜在风险应与试验的获益和安全相平衡。跨物种生物安全问题是异种移植领域的另一个令人担忧的问题，主要顾虑在于担心将猪病原体传播给人类。这其中最受关注的是猪内源性逆转录病毒（porcine endogenous retrovirus，PERV）。PERV分为3个亚型：PERV-A、PERV-B和PERV-C。PERV-A和PERV-B存在于所有种类猪体内，而PERV-C仅存在于部分猪中。虽然在几项体外研究中发现，PERV可以在细胞水平通过猪对人或者人对人进行传播，但庆幸的是，尚未证实在猪-NHP异种移植模型或猪来源细胞移植到人的临床试验中观察到PERV传播^[19]。因此，在真实世界中，PERV会给临床异种移植受体带来多大的感染风险还不清楚。目前，大多数猪病毒、细菌和真菌可以通过选择阴性供体动物、在无菌和隔离条件下繁殖、早期断奶和胚胎移植来消除^[20]。然而，由于PERV以多拷贝方式整合到猪基因组中，因此，以这种策略清除PERV是不可能的。2015年，Yang等^[21]使用CRISPR/Cas9灭活了无PERV-C猪细胞中的所有PERV-A和PERV-B基因组。2017年，同一课题组在猪原代细胞系中灭活了所有PERV，并通过体细胞核移植成功培育出健康的PERV灭活猪^[22]。通过这种策略，可以消除异种移植中PERV传播的潜在风险。

猪圆环病毒（porcine circovirus，PCV）是另一类常见的猪感染病毒，属于圆环病毒科病毒属，是已知的、最小的动物感染病毒之一。猪圆环病毒是一种单链DNA病毒，可以在感染细胞的核内自主复制，利用宿主的聚合酶进行基因组扩增。目前，已知PCV有4个血清型，分别命名为PCV1~PCV4型。PCV可以严重侵害猪的免疫系统，导致患猪免疫力下降，形成免疫抑制^[23]。研究者在接受猪心移植的狒狒体内检测到PCV3存在，但是否对宿主造成危害还不明确^[24]。

通过指定的无病原体繁殖来消除提供外源性无感染器官、组织和细胞可能是异种移植相对于同种异体移植的一个主要优势，可以显著减少受者感染人畜共患病的风险。但是，异种移植仍可能面临一些理论上未知的病原体以及某些已知病原体在免疫抑制环境中衍生出新问题的挑战。

基因编辑猪心脏异种移植动物实验的突破  通过对异种移植免疫排斥和凝血功能失调的研究，利用分子生物学和基因编辑技术，大量基因修饰猪被培育出来，以弥合跨物种的分子不相容性，应对不同时期、不同类型的异种移植排斥反应以及凝血功能障碍等异种移植面临的挑战。在基因修饰和新的免疫抑制方案的双重加持下，移植到NHP体内的基因编辑猪心存活率不断提高，存活时间也不断延长。

最初，在猪-NHP异位心脏移植模型中，野生型猪心移植后很快出现HAR，存活时间一般仅为数分钟至数小时。2003年GTKO猪问世，来源于GTKO猪或者合并表达一个或多个hCRPs基因的猪心移植后存活时间明显延长^[14]。2012年，Mohiuddin等^[25]将GTKO/hCD46基因修饰猪心脏移植入狒狒腹腔内，同时使用以抗CD154抗体为基础的免疫抑制方案，猪心最长存活时间达到了236天。但是，他们在实验中发现异种移植后在移植物内容易出现血栓微血管病，导致受体因出血而死亡，推测可能与使用抗CD154抗体有关。为此，Mohiuddin团队将hTBM基因导入GTKO/hCD46供体猪，并改用抗CD40抗体阻断共刺激通路的免疫治疗方案。结果表明，异位移植猪心最长存活时间延长到945天，中位存活时间为298天^[26]。此外，受体没有因系统消耗性凝血病或血小板减少症而死亡。本研究证实了基于抗CD40抗体的免疫治疗方案的有效性和安全性，也提示了hTBM对于调节异种移植凝血功能障碍的重要作用。但是，腹部异位心脏移植毕竟只是非工作型模型，在心功能评估方面存在不足。近年来，在工作模式的异种猪心脏移植方面的研究也取得了相当大的进展。2011年，猪-NHP功能性心脏移植最长存活时间为57天^[27]。2018年Langin等报道了狒狒支持生命的异种心脏移植的存活时间延长到195天^[28]。与以往的研究方案不同，两个步骤对于延长狒狒功能性异种移植物的存活至关重要。首先，为减少猪心缺血再灌注损伤，猪心获取后在体外用8 ℃含氧灌注液间断灌注保存，而非经典的静态冷藏保存。其次，为了避免移植心脏在狒狒体内过度生长，术后采用控制血压、减少皮质类固醇剂量和抗增殖药物替西罗莫司进行联合治疗。此后，Goerlich等^[29]通过敲除供体猪生长激素受体基因可以抑制移植后猪心的过度生长。2022年，Mohiuddin团队再次刷新了猪心异种移植存活记录，达到了264天^[30]。他们利用最新的基因编辑技术进行多种基因组合，培育出最多“9-基因”修饰猪：敲除3个异种抗原基因（GGTA1、CMAH、B4GalNT2），导入2个人类补体调节基因（hCD46、hDAF），2个人类抗凝血基因（hTBM、hEPCR），2个人免疫调节基因（hCD47、hHO1）。通过对这些不同基因的优化组合，达到最佳移植效果。此外，敲除供体猪的生长激素受体基因，很好地解决了猪心移植后过度生长的问题。

显然，上述异种移植研究领域所取得的诸多重大进展，已经初步具备了开展异种心脏移植临床试验的基本条件，基本符合了国际心肺移植学会2000年发表的关于开展异种移植临床试验建议的标准。2021年9月以来，美国多个移植中心连续开展4例异种移植人体试验，标志着异种移植临床研究又向前迈进了一大步，也可以认为是“水到渠成”的结果。这4例研究的数据和前期动物实验结果表明，将不同的转基因猪与不同的免疫抑制疗法结合起来，对于开展异种器官的有效移植是必要的。

监管与伦理  考虑到人类器官供应严重短缺和异种移植在临床前研究中不断取得突破，开展人体临床试验已势在必行。利用多基因修饰猪作为异种移植供体是一种必然趋势。新的基因编辑技术使得在短时间内培育出各种类型的基因修饰猪成为可能。因此，在猪-NHP模型中确定最佳的基因工程器官源猪和免疫抑制方案是进一步临床研究的关键步骤。此外，今后可能会有未知的异种抗原被发现，从而产生新的基因敲除或转基因供体猪，并在猪-NHP异种移植模型进行研究和证实。

随着临床开展异种移植的步伐不断临近，关于临床异种移植的监管挑战和伦理问题在全球范围内再次被提出。2003年，美国FDA曾发布了全面的异种移植指南，建议全世界的各个国家监管机构应该重新考虑异种移植的指导方针和法规，以便在临床前研究数据的支持下，更好地设计和安全地进行异种移植的临床试验^[31]。然而，是否有监管机构认为目前的证据足以推进临床异种移植尚未可知。2021年底开展的3例猪肾-人异种移植试验，受体均为脑死亡患者，规避了开展临床试验相关监管和伦理要求。2022年1月7日施行的猪心-人异种移植，则利用“Compassionate use”原则向FDA提出申请，紧急授权下实施手术，属于特殊情况下开展的人体临床试验。但是，这种模式在今后大规模或多中心异种移植临床试验不可能复制。而且，在心室机械性辅助+同种异体心脏移植时代，如何对相关临床异种移植试验进行设计及如何选择合适受体（既能保证临床试验的科学性和有效性，又能充分保护受试者的权益），仍面临诸多伦理和法律的挑战。

结语  国内异种移植研究经过多年的发展和积累，也已基本形成了从供体基因编辑猪培育/养殖、动物实验到临床应用一整套完整的研究体系，但整体研究水平与美国相比仍有差距。2022年4月，在国家卫生健康委员会指导下，中国器官移植发展基金会发布《中国人体异种器官移植临床试验专家共识》，明确指出，对于异种器官移植应本着“鼓励研究、审慎发展”的态度，科学评价研究进展、清醒认知相关风险。此前，中办、国办印发的《关于加强科技伦理治理的意见》中也明确了科技伦理原则和治理要求、科技伦理治理体制、科技伦理治理制度保障等方面内容，也为异种器官移植、基因编辑等科技伦理治理明确了界限^[32]。

美国4例异种移植的尝试虽具有一定的科学探索意义，但从动物实验跨越到真正临床应用，并非易事。正如黄洁夫教授表示，作为医学实验探索，异种移植研究有其必要性。免疫排斥、跨物种生物安全、伦理风险等是现阶段异种移植面临的重大隐患和主要障碍。虽然未来异种移植市场具有巨大的发展潜力，但从实验研究到真正意义的临床应用，异种移植还有很长的路要走。

作者贡献声明  杨兆华  资料收集，综述构思与撰写。王春生  综述构思与修订。

利益冲突声明  所有作者均声明不存在利益冲突。