2021, Vol. 48
脑卒中包括出血性脑卒中和缺血性脑卒中，其发病率高、致残率高、死亡率高且复发率高[1]，已成为危害居民健康的常见难治性疾病。在我国，脑卒中引起的死亡率和致残率由1990年的第三位上升到2017年的首位[2]。缺血性脑卒中在我国脑卒中患者中占69.6%~70.8%[3-4]。缺血性脑卒中是大脑血管闭塞引起的脑组织缺血、缺氧和坏死，最终导致神经功能障碍[5]。近年来，机械取栓术治疗缺血性脑卒中已取得巨大进步，但由于取栓时间窗的局限性，仅可对少数患者进行有效救治[6]，目前药物治疗仅限于重组组织纤溶酶原激活剂[7]，因此研发新的有效治疗手段势在必行。
麝香保心丸（Shexiang Baoxin pill，SBP）的组成（质量百分比）为麝香6%、人参提取物27%、牛黄4%、肉桂24%、苏合香酯8%、蟾酥4%及冰片19%，具有芳香温通、益气通心的功效，是一种多靶点、多作用途径的治疗药物[8]。作为一种传统中药复方制剂，SBP可有效缓解心绞痛、改善血流动力学，已广泛用于治疗心血管疾病[9]。目前关于SBP治疗急性缺血性脑卒中的临床研究较少，在动物实验方面尚未见报道。本实验通过建立小鼠大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，观察SBP对小鼠缺血性脑卒中产生的影响，并探索其中的分子作用机制，以期为SBP治疗缺血性脑卒中的临床应用提供理论和实验依据。
材料和方法主要实验试剂及仪器 本研究中96只健康雄性C57BL/6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可号：SCXK（沪）2017-0011，体质量22~25 g。饲养条件：12 h的明暗循环，平均室温约24 ℃，相对湿度约50%，自由进食和饮水。动物实验符合上海交通大学医学院动物伦理相关规范。
SBP（上海和黄药业有限公司），线栓（广州佳灵生物技术有限公司），氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazole chloride，TTC）、戊巴比妥钠（美国Sigma公司），GAPDH抗体（美国Cell Signaling Techonology公司），Iba-1抗体、NF-κb p-p65抗体（美国Abcam公司），免疫荧光（immunofluorescence，IF）二抗、BCA蛋白质检测试剂盒、Western blot二抗（美国Thermo公司），DAPI染色试剂盒、细胞核蛋白质与细胞质蛋白质抽提试剂盒、山羊血清、RIPA蛋白裂解液（上海碧云天生物技术有限公司），逆转录试剂盒、Syber Green（日本TaKara公司），qRT-PCR引物[铂尚生物技术（上海）有限公司]。
体式显微镜、石蜡切片机、激光共聚焦显微镜（德国Leica Microsystems公司），组织研磨仪（上海净信实业发展有限公司），酶标仪、NanoDropTM分光光度计（美国ThermoFisher公司），化学发光凝胶成像系统（美国Aplegen公司）。
实验分组与给药 将C57BL/6小鼠随机分为假手术（Sham）组，模型（ischemia/reperfusion，I/R）组、低剂量（22.5 mg/kg）麝香保心丸（low-dose SBP，LSBP）组、高剂量（45 mg/kg）麝香保心丸（high-dose SBP，HSBP）组，每组24只，用药剂量参考文献报道[10]。用生理盐水配置成混悬液，灌胃给药，每日1次，连续给药4周，分别给予假手术与MCAO手术。
MCAO模型的建立 参考文献[11]建立MCAO模型。小鼠称重，50 mg/kg戊巴比妥钠腹腔麻醉，行左侧MCAO手术。动物四肢及头部固定于木板上，沿颈正中线切开皮肤，钝性分离颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉。在体式显微镜下，首先在颈总动脉近心端打一活结，再在颈内动脉远心端打一活结，接着结扎颈外动脉远心端，在近心端打一松结，并在两个结之间做斜切口，快速插入线栓，使之头端稍微超过颈外动脉松结的位置，此时将颈内动脉处活结松开，并调整线栓的进线方向，使线栓头部沿颈内动脉进入，缓慢推动，直至有少许阻力感，停止推动线栓，并在颈内动脉处打活结固定线栓。1 h后缓慢退出线栓，将颈外动脉近心端结扎，松开颈总动脉活结，实施血流再灌注。逐层缝合皮肤，将动物放回笼中，待其自然苏醒，正常饮食。手术期间，用加热垫使肛温维持在（37.0±0.5）℃。术后动物出现步态不稳或前肢瘫痪则用于实验，单纯手术而未进线栓的动物作为假手术组。
TTC染色 造模24 h后，用异氟烷麻醉小鼠，采取心脏灌流法，用生理盐水将小鼠血液排出，随后处死小鼠（每组6只），取脑组织。将脑组织和大脑切片槽，置于-20 ℃冰箱15 min后，行冠状位切片，厚度为2 mm/片，切好的脑片放入2%染液中，避光置于37 ℃恒温箱15 min，取出脑片，摄像。用Image J软件计算梗死面积并定量。
脑组织含水量 按上述方法处理小鼠，取完整的左侧脑组织，用电子天平称取湿重，放入恒温电热干燥箱（105 ℃）烘烤72 h，称取干重。按Elliott公式计算脑组织含水量：含水量（%）=（湿重-干重）×100%/湿重。
免疫荧光染色 按上述方法处理小鼠，再缓慢灌注4%多聚甲醛，取小鼠脑组织，去除嗅球及小脑，4%多聚甲醛浸泡过夜。二甲苯和梯度酒精行透明和脱水处理，再行石蜡包埋，制作厚度5 μm的冠状切片，55℃烘箱过夜。第二天，用二甲苯和梯度酒精行脱蜡，柠檬酸和柠檬酸钠行抗原修复，5%山羊血清溶液37 ℃恒温箱封闭1 h，孵育Iba-1（1∶100，英国Abcam公司）抗体稀释液4℃过夜，次日PBS清洗3次，每次5 min，最后DAPI室温孵育5 min，封片。用激光共聚焦显微镜观察梗死侧Iba-1的表达情况。
qRT-PCR 按上述方法处理小鼠，取左侧脑组织，放入1.5 mL无酶离心管中，加入1 mL TRIZOL和预冷的磁珠，用组织研磨仪将组织打碎。加入200 μL氯仿，手动剧烈摇晃1 min，4 ℃下12 000×g离心15 min，将上清吸至另一离心管，加入等体积异丙醇，手动剧烈摇晃1 min，4 ℃下12 000×g离心10 min，白色RNA沉淀在管底，去上清，加入1 mL用DEPC水配置的75%乙醇溶液，4℃下7 500×g离心5 min，去上清，室温晾干20 min。加入适量DEPC水，吹打数次，溶解RNA。用Nanodrop测定样本浓度，再利用逆转录试剂盒（日本Takara公司）按说明书将RNA反转为cDNA，最后将cDNA稀释至50μL，用于qRT-PCR检测。按Syber Green试剂盒说明书配制实时荧光定量反应体系，加入荧光定量专用384孔板中进行反应，根据循环数检测基因表达水平。qRT-PCR引物由铂尚生物技术（上海）有限公司提供（表 1）。
| Gene name | Sequences | Species |
| TNF-α | F: 5’-CCCTCACACTCAGATCATCTTCT-3’ R: 5’-GCTACGACGTGGGCTACAG-3’ |
Mouse |
| IL-1β | F: 5’-GCAACTGTTCCTGAACTCAACT-3’ R: 5’-ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT-3’ |
Mouse |
| MCP-1 | F: 5’-TTAAAAACCTGGATCGGAACCAA-3’ R: 5’-GCATTAGCTTCAGATTTACGGGT-3’ |
Mouse |
| CXCL-1 | F: 5’-CTGGGATTCACCTCAAGAACATC-3’ R: 5’-CAGGGTCAAGGCAAGCCTC-3’ |
Mouse |
| Arg-1 | F: 5’-CTCCAAGCCAAAGTCCTTAGAG-3’ R: 5’-AGGAGCTGTCATTAGGGACATC-3’ |
Mouse |
| Ym-1 | F: 5’-CAGGTCTGGCAATTCTTCTGAA-3’ R: 5’-GTCTTGCTCATGTGTGTAAGTGA-3’ |
Mouse |
| Mgl-1 | F: 5’-TGAGAAAGGCTTTAAGAACTGGG-3’ R: 5’-GACCACCTGTAGTGATGTGGG-3’ |
Mouse |
| Fizz-1 | F: 5’-CCAATCCAGCTAACTATCCCTCC-3’ R: 5’-ACCCAGTAGCAGTCATCCCA-3’ |
Mouse |
Western blot 按上述方法处理小鼠，取左侧脑组织，放入1.5 mL无酶离心管中，加入磁珠和含有PMSF的RIPA溶液，用组织研磨仪将组织打碎。按照细胞核蛋白质与细胞质蛋白质抽提试剂盒说明书，抽提细胞核蛋白质。依据BCA蛋白质检测试剂盒说明书，测定样品的蛋白质浓度，制作标准曲线，计算蛋白质浓度，加入相应的SDS蛋白质Loading缓冲液，混匀后放入100 ℃金属浴恒温器加热10 min，置于冰上。采用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质，再将蛋白质转移至PVDF膜上，使用5%脱脂奶粉室温封闭1 h后，将PVDF膜加入TBST中，摇床晃动1 min，加入相应一抗，4 ℃孵育过夜，次日用TBST洗膜3次，再加入相应的二抗，室温孵育1 h，最后用TBST洗膜3遍，每遍5 min。将PVDF膜放入超灵敏多功能成像仪中，加入显影液，反应后曝光得到不同目的条带，采用Image J软件分析蛋白质灰度值。
统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件分析数据，定量数据以x±s表示，各组间数据差异比较采用One-way ANOVA法分析，采用GraphPad Prism 5.0软件制作柱状图，P＜0.05为差异有统计学意义。
结果MCAO模型建立 4组小鼠连续灌胃4周后，建立MCAO模型，并在24 h后取材（图 1）。
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| A: Groups of experiment; B: MCAO model (left side).CCA: Common carotid artery; ICA: Inter carotid artery; ECA: External carotid artery; BA: Basilar artery; PPA: Pterygopalatine artery; MCA: Middle cerebral artery. 图 1 小鼠实验分组以及MCAO模型建立 Fig 1 Experimental grouping and establishment of MCAO model |
SBP对小鼠脑梗死体积的影响 每组取6只小鼠，正常状态下小鼠无脑梗死。造模后，与Sham组相比，经TTC染色，I/R组梗死体积明显大于Sham组（P < 0.001）。经SBP灌胃预处理4周后，LSBP组和HSBP组梗死体积均明显小于I/R组，差异有统计学意义（LSBP vs. I/R，P=0.002；HSBP vs. I/R，P < 0.001），且SBP对梗死体积减小具有剂量正相关性，HSBP组梗死面积小于LSBP组梗死体积，差异有统计学意义（P=0.005）。因此，SBP可以减少缺血性脑卒中引起的梗死体积（图 2A~C）。
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| A: The representative photograph of TTC staining for each group; B: Quantification of ischemic infarct volume; C: Quantification of ischemic infarct size; D: Quantification of brain water content. (1)P < 0.05;(2)P < 0.01;(3)P < 0.001 (each group, n=6). 图 2 SBP减少小鼠缺血性脑卒中引起的梗死体积和脑水肿程度 Fig 2 SBP reduced the infarct size and infarct volume and cerebral edema caused by ischemic stroke in mice |
SBP对小鼠脑组织含水量的影响 每组取6只小鼠，与Sham组相比，I/R组脑组织含水量明显高于Sham组（P < 0.001），提示I/R组脑组织水肿程度大于模型组。经SBP灌胃预处理4周后，与I/R组相比，LSBP组和HSBP组脑组织含水量均明显少于I/R组，差异有统计学意义（LSBP vs. I/R，P=0.007；HSBP vs. I/R，P < 0.001），且SBP对脑水肿的改善与剂量正相关，HSBP组脑水肿程度轻于LSBP组，差异有统计学意义（P=0.036）。因此，SBP可以缓解缺血性脑卒中引起的脑水肿（图 2D）。
SBP对激活小胶质细胞数量的影响 每组取6只小鼠，经IF检测，与Sham组相比，I/R组Iba-1+细胞数量明显增加（P < 0.001），Iba-1可作为激活小胶质细胞的标记物[12]，这提示I/R组激活的小胶质细胞数量增加。在缺血性脑卒中的急性期，大量激活的小胶质细胞提示炎症反应加重。经SBP灌胃预处理4周后，与I/R组相比，LSBP组和HSBP组Iba-1+细胞数量明显下降，差异有统计学意义（LSBP vs. I/R，P=0.007；HSBP vs. I/R，P < 0.001），且SBP对小胶质细胞激活的抑制作用具有剂量正相关性，HSBP组Iba-1+细胞数量少于LSBP组，差异有统计学意义（P=0.041）。因此，SBP可以减少缺血性脑卒中后激活小胶质细胞的数量（图 3）。
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| A: Representative immunofluorescence staining of Iba-1 in ipsilateral brain sections 24 h after sham operation or MCAO in all groups (400×); B: Quantitative analyses of Iba-1+ cells/total cells. (1)P < 0.05;(2)P < 0.01;(3)P < 0.001 (each group, n=6). 图 3 SBP减少小鼠缺血性脑卒中后激活小胶质细胞的数量 Fig 3 SBP reduced the number of activated microglia caused by ischemic stroke in mice |
SBP对炎症因子表达的影响 每组取6只小鼠，经qRT-PCR检测，与Sham组相比，I/R组M1型和M2型小胶质细胞标志性炎症因子（M1型：TNF-α、IL-1β、MCP-1、CXCL1；M2型：Arg-1、Ym-1、Mgl1、Fizz1）表达均明显增加，差异有统计学意义（Arg-1：P=0.001 7；其他P均 < 0.001），提示炎症反应加重。经SBP灌胃预处理4周后，与I/R组相比，LSBP组和HSBP组M1型小胶质细胞标志性炎症因子表达水平明显下降，差异有统计学意义（IL-1β：LSBP vs. I/R，P=0.0047；MCP-1：LSBP vs. I/R，P=0.009；CXCL1：LSBP vs. I/R，P=0.044；其他P均 < 0.001）。且SBP对M1型炎症因子表达的抑制作用具有剂量正相关性，HSBP组M1型炎症因子表达水平低于LSBP组，差异有统计学意义（TNF-α：P < 0.001；IL-1β：P=0.031；MCP-1：P=0.007；CXCL1：P=0.028）。与I/R组相比，LSBP组和HSBP组M2型炎症因子表达水平均有所增加，部分差异有统计学意义（Arg-1：LSBP vs. I/R，P=0.067，HSBP vs. I/R，P=0.0083；Ym1：LSBP vs. I/R，P=0.036，HSBP vs. I/R，P < 0.001；Mgl1：LSBP vs. I/R，P=0.014，HSBP vs. I/R，P=0.004；Fizz1：LSBP vs. I/R，P=0.193，HSBP vs. I/R，P=0.047）。因此，SBP可以促进小胶质细胞由M1型向M2型极化（图 4）。
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| A-D: mRNA expression of M1 activated microglia markers; E-H: mRNA expression of M2 activated microglia markers.(1)P < 0.05;(2)P < 0.01;(3)P < 0.001 (each group, n=6).NS: No significance. 图 4 SBP促进小鼠缺血性脑卒中后小胶质细胞由M1型向M2型极化 Fig 4 SBP promoted M1 pro-inflammatory phenotype to M2 anti-inflammatory phenotype polarization in microglia caused by ischemic stroke in mice |
SBP对NF-κB信号通路相关蛋白质水平的影响 每组取6只小鼠，经Western blot检测，与Sham组相比，在细胞核内I/R组p-p65/p65水平明显增高（P < 0.001）。经SBP灌胃预处理4周后，LSBP组和HSBP组p-p65/p65的水平都有所减少，差异有统计学意义（LSBP vs. I/R，P=0.007；HSBP vs. I/R，P < 0.001），且SBP对p-p65/p65的抑制作用具有剂量正相关性，HSBP组p-p65/p65水平低于LSBP组，差异有统计学意义（P=0.008）。因此，SBP可以抑制细胞核内NF-κB通路的激活，从而减轻缺血性脑卒中带来的炎症反应（图 5）。
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| A: Representative Western blot analysis of p-p65 and p-65 in ipsilateral brain tissues nuclear (GAPDH was used as a loading control); B: Quantifications of Western blot results. (2)P < 0.01;(3)P < 0.001 (each group, n=6). 图 5 SBP抑制小鼠缺血性脑卒中引起的NF-κB信号通路激活 Fig 5 SBP attenuated the activation of NF-κB signaling pathway caused by ischemic stroke in mice |
MCAO模型诱导的小鼠脑卒中是研究缺血性脑卒中的经典模型，该方法无需开颅，对动物损伤小，其病理学改变与人类脑中风相似[13]。本研究对8周龄雄性小鼠给予线栓法建立MCAO模型，结果显示I/R组小鼠出现梗死体积和脑水肿，大量小胶质细胞激活，且引起炎症风暴，这些变化与既往MCAO模型结果相一致[14]。上述表现在LSBP组和HSBP组中得到缓解，提示SBP可改善缺血性脑卒中引起的脑损伤。
缺血性脑卒中是指由于血管阻塞引起的脑血流循环障碍，进而引起脑组织缺血缺氧，最终导致组织病理性坏死的一系列过程[15]。脑卒中及缺血后再灌注是复杂的病理生理性变化，机制错综复杂[16]。有学者提出，炎症反应是导致缺血性脑损伤的重要因素之一[17]。
SBP是一种多成分、多靶点的复合中成药，主要由中药麝香、人参提取物、蟾蜍、苏合香脂、冰片、牛黄和肉桂组成[8]。由于SBP具有扩张冠状动脉、抑制血管壁炎性因子、改善心肌缺血等作用，且安全性高，不良反应较少，已经广泛用于冠心病的治疗[18]。由于脑血管疾病与心血管疾病有相似的发病机理，根据心脑同治原则，将SBP应用于脑梗死患者的临床治疗已取得一定的效果[19]。然而，对于SBP治疗缺血性脑卒中仅应用于部分临床研究，在动物实验方面尚无报道。部分缺血性卒中患者会发生脑心综合征，严重时可致心律失常和心肌缺血[20]。SBP可有效缓解急性缺血性脑卒中引起的脑心综合征[21]。本实验通过观察SBP对小鼠缺血性脑卒中产生的保护作用，并探索其中的分子机制。对于患有心肌梗死和缺血性脑卒中的人群，以及患有心肌梗死且属于缺血性脑卒中的高危人群，是否给予SBP治疗心肌梗死，并预防和改善缺血性脑卒中的预后，值得进一步研究。
在小鼠脑卒中急性期，由于脑组织微环境缺血缺氧，导致脑组织大量坏死，从而形成梗死面积及脑水肿，这与人的病理生理过程极为相似，可导致神经功能损伤以及颅高压的形成[11]。本研究中，我们发现SBP可减轻缺血性脑卒中引起的小鼠大脑梗死及脑水肿，从而缓解这一症状。
小胶质细胞是大脑内负责监视和吞噬的固有免疫细胞，由其分泌介导的炎症反应是缺血性脑卒中的重要病理生理机制[22]。在急性缺血性损伤早期，小胶质细胞迅速激活，并在短时间内迅速聚集在损伤区域。尽管小胶质细胞在缺血性脑卒中里发挥双重作用，但是通常认为在急性损伤早期，小胶质细胞大量激活表明炎症反应加重，而在损伤的慢性期小胶质细胞则在修复过程中起至关重要的作用[23]。本研究结果表明，SBP可以抑制小胶质细胞的激活，从而抑制级联炎症反应，最终减轻脑损伤。小胶质细胞和巨噬细胞一样，具有两种表型，即M1型和M2型。传统观点认为，M1型小胶质细胞主要分泌促炎因子，如TNF-α、IL-1β、MCP-1、CXCL1；M2型小胶质细胞主要分泌抑炎因子，如Arg-1、Ym-1、Mgl1、Fizz1[24]。本研究发现，SBP可以促进小胶质细胞由M1型向M2型极化，达到减轻炎症风暴的作用。
大量国内外研究证明，脑缺血后的组织损伤与NF-κB信号通路的激活密切相关，NF-κB是NF-κB/Rel蛋白家族成员，广泛存在于小胶质细胞、星型胶质细胞和神经元细胞。NF-κB是一种多向性转录调节蛋白，在静息状态时，NF-κB与其抑制因子IκB结合，形成复合物存在于胞质内，没有生物活性，但在缺血缺氧的条件下，NF-κB可以被激活，可诱导IκB蛋白的磷酸化，并通过泛素-蛋白酶体通路将其靶标快速降解，释放NF-κB进入细胞核并与DNA结合，从而启动下游靶基因转录，参与并调控炎症反应，在缺血性脑卒中的炎症反应中起至关重要的作用[25]。本研究发现SBP可有效减少细胞核内NF-κB表达量，从而抑制下游炎症因子转录，减轻炎症反应，对小鼠缺血性脑卒中引起的脑损伤起到保护作用。
SBP含有多味中药，其单体化学成分甚为复杂，本研究未分离出发挥主要作用的具体成分，这是我们课题组后期研究方向。综上所述，SBP可改善小鼠缺血性脑卒中引起的炎症微环境，减轻脑组织损伤，缓解脑水肿，从而对损伤的脑组织起到保护作用，其作用机制可能与促进小胶质细胞由M1型向M2型转化和抑制NF-κB信号通路激活有关。本研究结果为SBP在缺血性脑卒中治疗中的应用提供了理论和实验依据，本课题组将继续深入研究SBP保护脑组织保护的其他相关机制。
作者贡献声明 邵帅 实验研究，论文撰写。陈彦霖，地里热巴提·地力木拉提 实验设计，资料分析。贾锋 实验指导，论文修改。
利益冲突声明 所有作者均声明不存在利益冲突。
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