2020, Vol. 47
2. 复旦大学附属妇产科医院妇科 上海 200011
2. Department of Gynecology, Obstetrics and Gynecology Hospital, Fudan University, Shanghai 200011, China
复发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）是一种常见的妇产科疾病，对患者及其家庭造成极大的精神压力[1]。研究报道染色体异常、自身免疫系统紊乱、内分泌失调等均会导致流产，但目前仍有半数RSA患者的病因不明[2-4]。顺利妊娠的必要条件是胎盘绒毛正常的血管发生和血管新生，并且与多种促血管生成因子和抑制因子协调作用[5-6]。近些年研究发现血管生成素(angiopoietin，Ang)家族是由血管内皮细胞分泌的一类与血管生成有关的蛋白质生长因子[7]。血小板反应蛋白（thrombospondin，TSP）是一种多功能糖蛋白，对血管生成起着重要作用[8]。而微血管密度（microvessel density, MVD）是血管形成的量化指标，CD34等是其标记物[9]。本研究选取2015年6月—2016年6月收入妇产科的50例流产清宫术患者为研究对象，通过检测患者新鲜绒毛中Ang及TSP的表达水平，并检测CD34阳性和MVD，分析其与血管生成的关系，为临床治疗提供理论依据。
资料和方法一般资料 选取2015年6月—2016年6月复旦大学附属妇产科医院妇科50例流产清宫患者为研究对象，对照组为正常妊娠行人工流产者，RSA组为≥2次自然流产者，每组25例。对照组年龄为20~38岁，平均年龄为（29.81±2.58）岁。纳入标准：（1）本次妊娠无流产症状；（2）孕周≤10周；（3）超声确诊早孕，可见胚芽及心管搏动；（4）既往有正常分娩史而无不良孕产史。RSA组年龄为20~39岁，平均年龄为（30.51±2.42）岁。纳入标准：（1）超声检查子宫发育正常；（2）孕周≤10周；（3）夫妇染色体核型检查正常；（4）甲状腺功能检查正常；（5）无血栓形成倾向；（6）排除免疫及感染因素影响。两组患者孕周、孕次、年龄差异均无统计学意义。本研究获本院医院伦理委员会批准，所有患者自愿签署知情同意书，并在人工流产时留取标本。
Ang和TSP相关指标表达的检测 采用免疫组化SP法检测两组患者新鲜绒毛组织中Ang-1、Ang-2的表达；试剂盒购于上海恪敏生物科技有限公司，严格按照说明书进行操作。采用图像分析软件Image通过检测阳性产物的积分光密度值(IOD值)，对Ang-1、Ang-2、TSP-1和TSP-2行半定量分析。阳性反应越强烈则染色越深，对于Ang，IOD值越大，表达水平越高。而对于TSP，染色越深则IOD值越小，表达水平越高。
CD34阳性和MVD的判定方法 对两组患者的组织血管进行免疫组化染色，CD34阳性指血管内皮细胞胞质染色呈棕黄色。微血管判断标准：根据CD34标记的血管内皮的数目计数微血管数量，将管腔 < 8个红细胞的血管或血管内皮细胞簇(包括单个内皮细胞着色)作为一个计数单位。MVD计算方法：计数5个视野内的微血管数目，取其平均值为MVD。
统计学方法 采用软件SPSS 20.0进行数据统计分析，计量资料以x±s表示，采用t检验；计数资料采用χ2检验，检验标准均为α=0.05。数据相关分析采用pearson相关分析法。P < 0.05为差异有统计学意义。
结果两组患者绒毛组织中Ang-1、Ang-2的表达水平及Ang-1/Ang-2值的比较 两组患者的绒毛组织中均有Ang-1、Ang-2表达，RSA组绒毛组织中Ang-1、Ang-2的表达显著高于对照组（P < 0.05），Ang-1/Ang-2值显著高于对照组(c2=3.54, P=0.001, 表 1）。
| (x±s) | |||||||||||||||||||||||||||||
| Group | Ang-1 | Ang-2 | Ang-1/Ang-2 | ||||||||||||||||||||||||||
| RSA (n=25) | 76.4±10.3 | 74.4±10.6 | 1.1±0.3 | ||||||||||||||||||||||||||
| Control (n=25) | 28.9±7.0 | 37.9±7.5 | 0.8±0.3 | ||||||||||||||||||||||||||
| t | 19.07 | 14.05 | c2=3.54 | ||||||||||||||||||||||||||
| P | 0.001 | 0.001 | P=0.01 | ||||||||||||||||||||||||||
两组患者绒毛组织中TSP-1、TSP-2的表达水平及TSP-1/TSP-2值的比较 两组患者的绒毛组织中均有TSP-1、TSP-2表达，RSA组绒毛组织中TSP-1的表达显著低于对照组，TSP-2的表达显著高于对照组，TSP-1/TSP-2比值显著低于对照组（c2=23.57，P＜0.001，表 2）。
| (x±s) | |||||||||||||||||||||||||||||
| Group | TSP-1 | TSP-2 | TSP-1/TSP-2 | ||||||||||||||||||||||||||
| RSA (n=25) | 184.6±2.9 | 195.6±2.7 | 0.94±0.02 | ||||||||||||||||||||||||||
| Control (n=25) | 194.9±3.0 | 176.6±5.9 | 1.11±0.03 | ||||||||||||||||||||||||||
| t | 12.34 | 14.64 | c2=23.57 | ||||||||||||||||||||||||||
| P | 0.001 | 0.001 | P < 0.001 | ||||||||||||||||||||||||||
两组患者绒毛组织的MVD值比较 RSA组绒毛组织中的MVD值为20.0±1.4，对照组绒毛组织中的MVD值为29.9±3.8，RSA组的MVD值显著低于对照组（t=12.22, P < 0.001）。
RSA组患者绒毛组织中各指标的相关性分析 结果显示Ang-1的表达与MVD呈负相关性（r=-0.314，P < 0.05），Ang-2的表达与MVD呈正相关性（r=0.951，P < 0.05），TSP-1、TSP-2的表达与MVD值呈负相关性（r=-0.746，r=-0.773，P < 0.05）。
讨论妊娠是一个复杂的过程，在妊娠早期胚胎发育过程中，血管发生和血管新生形成血管系统，而血管生成受多种血管相关因子协调作用，包括促血管生成因子、抑制因子等，因此影响血管系统形成的因素均可能导致流产[10]。另一方面，血管相关因子影响妇女的卵巢及子宫内膜血流灌注和功能，而妊娠结局与卵巢和子宫内膜功能密切相关，因此血管相关因子的表达异常可能引起RSA[11]。
Angs家族包括Ang-1和Ang-2，两者均可作用于内皮特异性受体酪氨酸激酶Tie-2，从而影响血管内皮形成[12]。研究发现在妊娠过程中，Ang-1及Ang-2的正常表达有助于胚胎正常生长发育，而其过度表达会造成血管缺陷，从而导致胚胎死亡，引发RSA[13]。MVD作为一种量化血管生成的指标，可用于微血管生成计数，以反映血管生成程度。本研究结果显示，RSA组绒毛组织中Ang-1、Ang-2及Ang-1/Ang-2值显著高于对照组，推测RSA患者体内绒毛组织的Ang-1、Ang-2高度表达可能会导致RSA，尤其是Ang-1高表达。
TSP包括TSP-1和TSP-2，其对血管生成起重要作用，其表达异常将会影响血管生成，从而影响胚胎的血液供应，严重者将导致流产[14]。TSP-1作为一种内源性血管生成抑制因子，对血管内皮生长因子具有拮抗作用，但也有研究表明TSP-1可以促进血管生成[15]。本文研究结果显示RSA组绒毛组织中TSP-1表达水平显著低于对照组，与TSP-1促进血管生成作用的观点相符。TSP-2表达水平显著高于对照组，TSP-1/TSP-2值显著低于对照组，同理推测RSA患者体内绒毛组织TSP-2的高表达可能通过影响血管生成而导致流产。
本研究结果显示，RSA组的绒毛组织中MVD值显著低于对照组，说明RSA的发生受患者绒毛组织中血管生成程度降低的影响。RSA组患者绒毛组织中，Ang-1表达与MVD值呈负相关性，Ang-2表达与MVD值呈正相关性，TSP-1、TSP-2表达与MVD值均呈负相关性。与上述推测相符，进一步证实Ang-1、TSP-2高表达可能导致流产发生。可能由于样本量小的原因，本研究中Ang-2和TSP-1在相关性分析中未达到预期效果。
综上所述，RSA患者绒毛组织中均有Ang-1、Ang-2、TSP-1和TSP-2表达，在妊娠过程中绒毛组织的血管生成非常重要，其正常表达对维持正常妊娠具有重要作用。RSA的机制可能为Ang、TSP异常表达导致血管生成障碍，从而影响胚胎发育，导致流产。鉴于本研究为血管生成相关因子、MVD与RSA的相关性研究，且病例数有限，在扩大样本量的基础上还需详细研究上述三者的因果关系，为RSA患者病因研究提供新的理论。
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