2023, Vol. 50
宫颈癌是女性第四位恶性肿瘤[1]。2018年，全球宫颈癌的新发病例数约为57万例，死亡病例数达31.1万例[2]。我国是宫颈癌高发地域之一，宫颈癌发病率和死亡率存在明显的区域差异，近十几年其发病率和死亡率逐年上升[3-6]。目前手术和放化疗是治疗宫颈癌的主要方式，但疗效有限，易复发。而新型免疫治疗，如抗体靶向治疗、过继细胞治疗等，疗效也不理想[7-10]，其原因均与宫颈癌细胞的不可控生长息息相关。因此，仍需寻求能够有效抑制宫颈癌细胞增殖的治疗靶点[11]。跨膜蛋白33(transmembrane protein 33，TMEM33)是瞬态受体电位(transient receptor potential，TRP)离子通道家族(也称为TRPP2)的成员之一，由6个跨膜片段组成。研究表明其参与内质网未折叠蛋白反应的正向调节，内质网管状网络组织的调节和内质网应激的反应[12-13]。近来研究报道TMEM33可能参与乳腺癌的进展，但TMEM33在多种肿瘤中的表达及其功能尚不清楚。
本研究使用基因表达谱数据动态分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA)数据库，发现TMEM33与宫颈癌的总生存率及无病生存率都密切相关，并应用RNA干扰技术下调TMEM33，探究其对宫颈癌细胞周期和生长的影响。
材料和方法主要试剂 胎牛血清、DMEM高糖培养液、Opti-MEM培养液均购自美国Thermofisher公司；X-TREMEGENE™转染试剂购自德国Merck公司；BCA蛋白定量试剂盒与ECL化学发光液购自美国Thermofisher公司；兔抗人TMEM33多克隆抗体购自美国OriGene公司；RIPA裂解液、CyclinD1、P21、Bcl-2与Bax多克隆抗体购自美国CST公司；小鼠抗人GAPDH单克隆抗体购自北京康为世纪生物科技有限公司；靶向TMEM33 siRNAs由上海吉玛生物科技有限公司合成；CCK-8试剂盒、Annexin Ⅴ-FITC/碘化丙啶(propidiumiodide，PI)、细胞凋亡检测试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司；PVDF膜购自美国Bia-Rad公司；其余试剂均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。
生物信息学分析 GEPIA数据库(http://gepia.cancer-pku.cn/)用于分析宫颈癌总生存率和无病生存率相关基因表达水平。通过GEPIA数据库分析得到TMEM33在卵巢癌以及宫颈癌组织中的表达水平。进一步分析TMEM33的表达水平与宫颈癌患者的总生存率及无病生存率之间的关系。
细胞培养 宫颈癌细胞系SiHa与HeLa购自上海中科院细胞库。SiHa与HeLa细胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中恒温培养，取对数生长期的细胞转染以进行后续实验。
TMEM33干扰序列的设计 根据NCBI提供的TMEM33序列(NM_018126.3)设计RNA干扰序列，经过基于局部序列排比检索基本工具(Basic Local Alignment Search Tool，BLAST)排除与其他基因同源的靶序列，共得到2条有效干扰序列。针对TMEM33(NM_018126.3)基因的特异siRNA序列：siTMEM33#1正义链(5'-3')UGAAUUUCAGA-AUAUUUUGdTdT，反义链(5'-3') CAAAAUAU-UCUGAAAUUCAdTdT；siTMEM33#2正义链(5'-3')UCAUUAUUAUGUGUUCAACdTdT，反义链(5'-3') GUUGAACACAUAAUAAUGAdTdT。
实验分组 实验分为3组：siTMEM33#1干扰组、siTMEM33#2干扰组、阴性对照组(非特异性siRNA)。
siRNAs转染SiHa/HeLa细胞 取对数生长期的宫颈癌细胞接种于10 cm培养皿中，细胞浓度为1×106个/孔。每孔加入约1.5 mL无抗生素的Opti-MEM培养基，当细胞融合度达到40%~60%时，参照X-TREMEGENE™说明书的方法将各组siRNAs分别转染至SiHa/HeLa细胞中，使siRNAs终浓度达到100 nmoL，同时以非特异性siRNA作为阴性对照组，每组设置3个复孔。
Western blot检测蛋白表达 收集各组转染后的细胞蛋白，用RIPA裂解液在冰上裂解细胞并提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白质浓度并将细胞蛋白浓度尽量调整一致。取50 μg各组样品总蛋白，用10%的SDS-PAGE进行凝胶电泳，电泳后将分布在胶上的蛋白通过转膜转移至PVDF膜上，用浓度5% BSA的封闭液室温下封闭2 h，分别加入各种多克隆抗体(体积稀释比例为1∶1 000，5% BSA)以及GAPDH单克隆抗体(1∶5 000，5% BSA)，于4 ℃孵育过夜；次日，洗膜3次，每次5 min后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶5 000)，室温反应1 h。TBST洗膜3次，用ECL试剂进行显影。使用GE Healthcare Life Sciences公司的ImageQuant™ LAS 4000 mini成像仪检测发光信号。
CCK-8法检测转染siRNA后SiHa/HeLa细胞的增殖能力 将2×103个转染24 h后的各组宫颈癌细胞分别接种于96孔板中，每组设置6个复孔。将96孔板置于细胞培养箱继续培养中，分别在0、24、48和72 h时向每孔加入10 μL CCK-8，继续孵育1 h，酶联免疫仪(美国Bio-Rad公司，Model 680)在450 nm波长处检测各孔的吸光度值。以时间为横轴，以吸光度值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期的改变 使用凋亡检测试剂盒，根据说明书，用不含EDTA的胰蛋白酶(0.25%)消化收集转染后的各组宫颈癌细胞，用预冷的PBS洗涤细胞2次后，加入500 μL结合缓冲液悬浮细胞，随后加入5 μL AnnexinⅤ-FITC混匀染色，最后加入5 μL PI，混匀后室温避光孵育15 min，用流式细胞仪(美国BD公司，FACSCanto System)检测各组细胞的凋亡情况。
PI染色后收集细胞并用预冷的PBS洗涤细胞2次后，用70%的乙醇在-20 ℃下固定过夜。PBS洗涤细胞2次，加入PI，使其终浓度达到50 μg/mL，同时加入无DNA酶污染的RNA酶至终浓度为50 μg/mL。染色20 min后PBS洗涤，用流式细胞仪检测各组细胞的细胞周期分布。
统计学分析 使用GraphPad Prism 6.0软件进行统计学分析，所得数据以x±s表示，2个独立样本比较采用配对t检验，多组之间差异采用单因素ANOVA分析，P < 0.05为差异有统计学意义。
结果TMEM33在宫颈癌组织中的表达水平及其对宫颈癌患者预后的影响 我们使用GEPIA数据库(http://gepia.cancer-pku.cn/)找出前500个与宫颈癌总生存率和无病生存率相关的基因。其中共有58个基因与宫颈癌总生存率和无病生存率都相关(图 1A)。在这些基因中，我们发现TMEM33在多达18种肿瘤(包括宫颈癌和卵巢癌)组织中都呈高表达(图 1B、1C)，提示TMEM33可能作为一个原癌基因促进肿瘤进展。进一步分析TMEM33对宫颈癌患者预后的影响，结果显示高表达TMEM33的宫颈癌患者具有更差的总生存率(图 1D)和无病生存率(图 1E)。上述结果进一步佐证了TMEM33作为一个原癌基因促进肿瘤进展的可能性。
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| A: Venn diagram to screen common genes between genes associated with OS and genes associated with DFS. B: GEPIA was used to show the cancers with high expression of TMEM33 in TCGA dataset. C: Expression of TMEM33 in cervical cancer samples and ovarian cancer samples compared with normal samples. D-E: Survival plots for TMEM33 mRNA expression association with OS and DFS in GEPIA-CESC. 图 1 TMEM33高表达与宫颈癌患者预后 Fig 1 High TMEM33 expression associated with the prognosis of patients with cervical cancer |
下调TMEM33可显著抑制宫颈癌细胞增殖并促进凋亡 鉴于TMEM33在宫颈癌组织中高表达，我们使用siRNAs靶向下调内源性TMEM33的表达，并观察宫颈癌细胞的生物学特性改变。应用Western blot检测发现，与阴性对照组相比，转染siTMEM33#1、siTMEM33#2均可有效下调SiHa/HeLa细胞中的TMEM33蛋白表达(P < 0.05，图 2A)。CCK-8法检测宫颈癌细胞增殖情况，结果显示siTMEM33#1、siTMEM33#2转染组细胞的增殖能力均明显低于阴性对照组(t=8.403，P < 0.05，图 2B)。流式细胞术检测发现，转染组细胞的凋亡水平均显著高于阴性对照组(t=5.355，P < 0.05，图 2C)。
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| A: Western blot results for TMEM33 expression validated in SiHa/HeLa cells after transfection for 48 h. B: CCK-8 assay was performed to detect the proliferation of SiHa/HeLa after siRNAs transfection. C: Flow cytometry was performed to assess cell apoptosis ratio of SiHa/HeLa after siRNAs transfection. (1) vs. siNC, P < 0.01. 图 2 下调TMEM33能抑制宫颈癌细胞增殖并促进其凋亡 Fig 2 Downregulation of TMEM33 inhibited proliferation and promoted apoptosis in cervical cancer cells |
TMEM33表达下调可影响细胞周期以及凋亡相关蛋白的表达 流式细胞术检测发现，下调TMEM33可显著减少宫颈癌细胞S时相的分布(P < 0.05，图 3A)。Western blot检测发现：与阴性对照组相比，siTMEM33#1、siTMEM33#2转染组细胞中抗凋亡基因BCL-2表达显著下降，而促凋亡基因Bax表达明显上升；TMEM33下调后，细胞周期蛋白CyclinD1表达降低，而P21则升高(t=21.72，P < 0.05，图 3B)。
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| A: Cell cycle was assessed by flow cytometric analysis in SiHa/HeLa after siRNAs transfection. B: Western blot was used to analyze the indicated proteins in SiHa/HeLa after siRNAs transfection. (1) vs. siNC, P < 0.01. 图 3 下调TMEM33影响细胞周期以及凋亡相关蛋白的表达 Fig 3 Downregulation of TMEM33 affects the cell cycle and the expression of apoptosis-related proteins |
TMEM是一种含有跨膜结构域的膜蛋白成分，作为细胞膜的结构组分，广泛存在于所有生物膜结构中，参与细胞内结构包括线粒体、内质网、溶酶体和高尔基体的组成。许多TMEM家族成员作为通道蛋白，可通过不断地改变构象来控制物质的跨膜转运[13]。TMEM33是内质网跨膜蛋白家族中的一员，含有3个跨膜结构域，在整个进化过程中保持保守。TMEM33在血管生成调节、急性损伤、炎症反应、抗病毒免疫反应等生物学过程中都发挥重要作用。TMEM33是血管生成所需的内质网钙离子信号机制的组成部分，能介导内皮细胞钙离子流动，对内皮尖端细胞丝状伪足形成和内皮细胞迁移都至关重要，TMEM33能激活ERK和诱导Notch信号传导以调节血管形成；全部或特异性敲除内皮细胞中TMEM33的表达，会破坏血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的许多下游效应，包括ERK的磷酸化Notch信号通路和血管生成[14]。TMEM33可通过与多囊蛋白-2 (polycystin-2，PC-2)相互作用，以PC-2依赖的方式降低细胞内钙含量，导致组织蛋白酶易位，抑制内质网应激下的自噬通量以及对凋亡的敏感性，影响肾小管上皮细胞内钙的稳态，从而导致急性肾损伤[15]。在吸入性肺损伤发病机制的初步研究中，发现TMEM33 mRNA是微小RNA(microRNA-146a，miR-146a)的作用靶点，参与Toll样受体/核因子-κB(Toll-like receptors/Nuclear factor kappa-B，TLRs/NF-κB)信号通路的调控[16]。在动物研究中，病毒成分可刺激TMEM33上调，显著抑制干扰素IFNφ1启动子活性和mRNA水平，阻断IFN反应，从而显著削弱宿主细胞的抗病毒能力[17]。
TMEM33与肿瘤的发生、转移和耐药密切相关。TMEM33是一种新发现的内质网应激诱导分子，可调节未折叠蛋白反应信号传导，而内质网应激导致未折叠蛋白反应信号级联激活，可诱导凋亡细胞死亡、自噬、致癌、转移和/或对癌症治疗的耐药性，提示TMEM33可能是癌细胞内质网应激反应事件的决定因素[18]。研究表明TMEM33是未折叠蛋白信号通路中PERK-eIE2α-ATF4和IRE1-XBP1轴的新型调节器，TMEM33可与磷酸化ERK结合，导致乳腺癌细胞中p-eIF2α和p-IRE1α及其各自下游效应物ATF4-CHOP和XBP1-S的蛋白表达水平增加，促进乳腺癌细胞的转录增殖；同时，TMEM33过表达还导致凋亡相关基因(caspase-7)和自噬体标志物(LC3II)的表达增加[18]，自噬与肿瘤细胞对各种治疗的耐药性有关。比较TMEM33在激素耐药乳腺癌细胞(LCC9、MCF7RR)和敏感乳腺癌细胞(LCC1和MCF7)中的表达水平，发现前者的TMEM33 mRNA表达水平更高。与非复发性乳腺肿瘤相比，早期复发性乳腺癌标本中的TMEM33呈高表达[18]。文献报道TMEM33作为丙酮酸激酶M2异构体(pyruvate kinase M2，PKM2)的下游效应子，受重要的跨膜转录因子(nuclear factor erythroid 2‐like 1，NRF1)转录调控，可调节产脂转录因子SREBP(sterol regulatory element binding protein)表达，从而影响脂质代谢[19]。在小鼠实验中，PKM2全基因敲除后，TMEM33上调，通过募集RNF5(RING-finger protein 5，一种E3泛素连接酶)促进SREBP裂解激活蛋白(SREBP-cleavage activating protein，SCAP)的降解，继而小鼠的血浆总胆固醇水平升高，移植瘤的生长加速。提示TMEM33是脂质代谢的真正调节因子，其对维持脂质稳态和促进肿瘤生长有重要作用[19]。然而，TMEM33在宫颈癌领域的研究，目前国内外文献均未见报道。因此，我们率先尝试在宫颈癌细胞中开展TMEM33相关的实验：体外实验结果表明下调TMEM33可显著抑制宫颈癌细胞增殖，同时促进细胞凋亡。肿瘤细胞不可控性生长的原因在很大程度上是由于基因组完整性受损，导致机体的损伤修复机制失调。细胞周期在DNA损伤修复中扮演重要的角色，细胞周期的S时相是DNA进行复制的时期。本研究发现，下调TMEM33会影响宫颈癌的细胞周期，结果显示TMEM33干扰后可显著减少宫颈癌细胞S时相的分布，同时细胞凋亡关键基因BCL-2表达下降、Bax表达上调，细胞周期蛋白CyclinD1降低、P21升高(P < 0.05)。这些结果表明：TMEM33可能通过调节细胞周期，影响细胞凋亡相关基因与细胞周期蛋白的表达，从而促进宫颈癌细胞的生长。细胞周期的变化，凋亡相关基因以及细胞周期相关蛋白水平的改变，提示TMEM33对于维持宫颈癌细胞的生长不可或缺。
本研究结果表明TMEM33可能是宫颈癌预后的潜在分子标记物。后续还有待于宫颈癌组织样本和动物实验的验证，以期进一步证实其原癌基因的特点和潜在的分子机制。
作者贡献声明 董晶 数据采集，论文构思、撰写和修订。商双 数据采集。高蜀君论文构思。谢锋 数据统计和分析，模型运算，论文修订。
利益冲突声明 所有作者均声明不存在利益冲突。
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