2022, Vol. 49
2. 上海交通大学医学院附属仁济医院麻醉科 上海 200127;
3. 上海市普陀区妇婴保健院病理科 上海 200062;
4. 上海市普陀区妇婴保健院麻醉科 上海 200062
2. Department of Anesthesiology, Renji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200127, China;
3. Department of Pathology, Shanghai Putuo Maternity andInfant Health Hospital, Shanghai 200062, China;
4. Department of Anesthesiology, Shanghai Putuo Maternity and Infant Health Hospital, Shanghai 200062, China
子宫内膜异位症（以下简称内异症）是一种常见的、以疼痛为典型症状的妇科临床疾病，通常伴有不孕症。子宫内膜异位病变组织和腹膜液中存在由一系列炎症细胞、细胞因子和趋化因子的异常改变而形成的炎症微环境[1-2]。内异症引起的疼痛可能与内异症病灶周期性出血引起的局部炎症反应、病灶异常生长导致的外周神经和中枢神经敏感引起的疼痛敏化以及腹腔内慢性炎症相关[3]。多项研究显示，来自炎症性子宫内膜病变的持续伤害导致了感觉传入的持久中枢敏化[4-5]。目前，内异症引起疼痛的具体机制尚不清楚。瞬时受体电位香草酸1（transient receptor potential cation channel subfamily Ⅴ member 1，TRPV1）在结构上与有毒热感和电压门控钙、钠、钾通道有关[6]。瞬时受体电位锚定蛋白1（transient receptor potential ankyrin 1，TRPA1）为TRPV1的受体，在结构上与非选择性阳离子通道相关，主要位于辣椒素敏感的肽感觉神经元上[7]。TRPA1作为细胞损伤信号的传感器，参与炎症和免疫反应，在刺激（痒）或疼痛的感觉中介导物理和化学刺激的转换[8]。TRPV1与类风湿关节炎、骨关节炎和肠易激综合征（irritable bowel syndrome，IBS）等导致的慢性疼痛疾病相关[9]，可增强和整合对疼痛诱导刺激的反应，如酸中毒、氧化应激或炎症介质[10]。TRPV1/TRPA1异构体在感知环境危害以及增强炎症疼痛感方面发挥重要作用，可以促进持续性疼痛[11]。Fattori等[12]研究显示，内异症疼痛模型小鼠的病变组织中存在降钙素基因相关肽、TRPA1和TRPV1表达的神经纤维。内异症还可激活表达TRPA1和TRPV1的背根神经节神经元（nuclear factor kappa B subunit 1，NF-κB）中的信号通路。
本研究拟通过植入的方法建立小鼠内异症模型，联合TRPA1激动剂肉桂醛（cinnamaldehyde）和TRPA1拮抗剂HC-030031，探讨TRPA1/TRPV1异聚体在小鼠内异症子宫内膜组织中的表达情况，分析TRPA1/TRPV1异聚体与内异症缩宫素介导疼痛的相关性，同时验证TRPA1和TRPV1对炎症因子的影响作用。
材料和方法试剂及仪器 戊酸雌二醇、缩宫素[阿拉丁试剂（上海）有限公司]，Cinnamaldehyde、HC030031（美国Sigma-Aldrich公司），TRPV1、TRPA1多克隆抗体（德国Novus公司），β-actin抗体（英国Abcam公司），反转录试剂盒（加拿大Fermentas公司），HiScript Reverse Transcriptase（RNase H）和SYBR Green Master Mix（南京诺唯赞生物科技股份有限公司），RIPA裂解液和蛋白酶磷酸酶抑制剂（美国Thermo公司），小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2 ELISA检测试剂盒（上海江莱生物科技有限公司）。实时荧光定量PCR仪（型号：QuantStudio 6，美国ABI公司），正置荧光显微镜（型号：Eclipse C1，日本Nikon公司），水平电泳仪（型号：JY300，北京君意东方电泳设备有限公司）。
内异症模型建立及动物分组 28只BALB/c雌性小鼠（8周龄，18~21 g）购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，生产许可证：SCXK（沪）2017-0005。所有动物实验经上海市普陀区妇婴保健院伦理委员会批准，批准号：2016伦审第（1）号。实验时间为2017年10月至2018年10月，动物均在SPF级环境饲养，12 h/12 h光暗周期。将28只小鼠随机选取8只作为供体组，造模前1周供体组皮下注射戊酸雌二醇（0.2 mg/只），1周后对小鼠实施安乐死后将其以仰卧位固定于手术台，沿正中线剖开腹腔，分离双侧子宫系膜，除去浆膜和子宫肌层，生理盐水反复漂洗，去除子宫表面的血迹，分离子宫系膜，在生理盐水中切碎子宫内膜（碎片≤1 mm3），全程保持无菌操作，将切碎的子宫内膜经18号针头注射到实验组小鼠腹腔内。取脐下偏正中线处的左下腹为进针点（0.5 mL/只），1只供体小鼠对应2只受体小鼠，构建内异症小鼠模型，每个模型操作时间限制为5 min[13]。
将20只实验组小鼠分为4组：假手术组（Sham）、模型组（Model）、肉桂醛+模型组（Model+ Cinnamaldehyde）和TRPA1拮抗剂+模型组（Model+HC030031），每组5只。内异症小鼠模型建立1天后，模型组给予灌胃溶剂；肉桂醛+模型组给予灌胃肉桂醛（10 mg/kg），每3天1次；TRPA1拮抗剂+模型组给予灌胃HC-030031（2.5 μg/kg），每天1次。给药2周，继续饲养2周。称重、处死并解剖小鼠，取异位子宫内膜病灶，收集血清和腹腔灌洗液。
疼痛行为学 建模（给药）后7、14、21和28天腹腔注射缩宫素20 IU/kg，观察30 min内出现的扭体反应，记录扭体次数。
实时荧光定量PCR检测小鼠子宫内膜组织中TRPV1/TRPA1的基因表达 取100~200 mg组织块，研钵里磨碎（加液氮辅助），磨碎的组织放入1.5 mL无RNA酶EP管中，加入1 mLTrizol浸泡，混合均匀，用于抽提或‒20 ℃冻存。按照Trizol提取试剂使用说明抽提组织中的总RNA，根据操作说明书RNA反转录成cDNA。根据目的基因序列信息设计并合成qPCR检测引物（表 1）。
| Primer name | Primer sequence（5'-3'） | Products |
| mmu ACTB-2F | CTGGTCGTACCACAGGCATT | 537 bp |
| mmuACTB-2R | TGCTAGGAGCCAGAGCAGTA | |
| mmuTRPA1-F4 | CTCCCCGAGTGCATGAAAGT | 543 bp |
| mmu TRPA1-R4 | CGCTATTGCTCCACATTGCC | |
| mmu TRPV1-F3 | GGGCGAGACTGTCAACAAGA | 558 bp |
| mmu TRPV1-R3 | CGGCTCTATTGCTCCCTGAG |
以反转录的cDNA为模板，用目的基因特异性引物和内参引物扩增待检测的目的基因片段和看家基因，将样品放入IQ5荧光定量PCR仪，SYBR Green法荧光定量PCR以分析各基因的表达，用ΔΔCt法定量各基因的相对表达。
免疫荧光检测小鼠子宫内膜组织中TRPV1/TRPA1蛋白表达和定位 小鼠子宫内膜组织经多聚甲醛固定、脱水和石蜡包埋后切片（5 µm）。切片脱蜡后进行抗原修复，PBS洗涤3次，每次5 min。切片上滴加BSA，室温孵育1 h。去除封闭液，切片上滴加PBS配备的一抗，分别孵育抗体TRPA1（1:500）和TRPV1（1:500）。切片平放于湿盒内4 ℃孵育过夜。次日，置于PBS（pH=7.4）中脱色，PBS洗涤3次，每次5 min。切片干燥后在圈内滴加与一抗相应种属的荧光标记二抗覆盖组织，室温孵育1 h。于PBS中脱色，洗涤3次，每次5 min。切片干燥后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10 min。用抗荧光淬灭封片剂封片，于荧光显微镜下观察切片并采集图像。
ELISA检测小鼠血清及腹腔灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2的表达 称取标本，加入PBS，用液氮迅速冷冻，保存备用。标本融化后保持2~8 ℃，加入PBS，匀浆充分，2 000~3 000×g离心20 min，收集上清。按ELISA试剂盒说明书进行样品检测，计算细胞因子浓度。
Western blot检测小鼠子宫内膜中TRPV1/TRPA1的蛋白表达 用PBS清洗小鼠子宫内膜组织，加适量液氮研磨，充分研磨后将组织匀浆转移至离心管；加入RIPA蛋白裂解液和蛋白酶磷酸酶抑制剂200 µL裂解蛋白，混匀冰浴40~60 min；4 ℃下11 000×g离心15 min，提取蛋白裂解液上清；采用BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）测定蛋白质浓度；根据浓度测定结果对蛋白浓度进行调整，保证不同组别间蛋白浓度一致；用样品将6×上样缓冲液稀释成1×上样缓冲液，煮沸5 min，于‒80 ℃保存；蛋白用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）12%分离胶（5%浓缩胶）电泳分离，电泳，聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜转膜，一抗孵育，增强型化学发光剂（enhanced chemiluminescence，ECL）显色，凝胶电泳仪成像，用Image J软件进行条带灰度分析。
统计学分析 各组样本qPCR检测至少重复3次，数据用Graphpad Prism 8.0软件分析；免疫荧光相对定量用Image-Pro Plus软件分析。Western blot结果用Image J（USA）软件分析。两组间差异分析用非配对t检验；3组及以上的组间差异比较用单因素方差分析。结果用x±s表示，P < 0.05为差异有统计学意义。
结果内异症小鼠疼痛行为学实验 建立小鼠内异症模型，探讨TRPV1/TRPA1异构体在内异症疼痛中的作用，并在小鼠体内进行催产素诱导的扭体实验（表 2）。催产素诱导的内异症小鼠扭动频率相比对照组显著增加，肉桂醛进一步放大了这一现象，HC-030031则减弱了内异症小鼠的扭动频率。
| (x±s) | |||||||||||||||||||||||||||||
| Group | 0 d | 7 d | 14 d | 21 d | 28 d | ||||||||||||||||||||||||
| Sham | 5.6±1.1 | 4.8±1.3 | 6.2±1.6 | 4.6±1.1 | 4.8±2.2 | ||||||||||||||||||||||||
| Model | 22.8±4.9（1） | 23.6±3.5（1） | 25.2±3.3（1） | 25.8±2.3（1） | 26.0±2.1（1） | ||||||||||||||||||||||||
| Model+Cinnamaldehyde | 23.0±1.2（1） | 30.0±3.5（1）（2） | 31.2±3.7（1）（2） | 34.2±5.8（1）（2） | 35.2±6.2（1）（2） | ||||||||||||||||||||||||
| Model+HC-030031 | 20.8±3.7（1） | 21.0±2.2（1） | 16.4±2.7（1）（3） | 17.0±4.2（1）（2） | 17.2±5.3（1）（2） | ||||||||||||||||||||||||
| （1） vs. Sham group，P＜0.01；vs. Model group，（2） P＜0.05，（3） P＜0.01. | |||||||||||||||||||||||||||||
qPCR检测小鼠子宫内膜TRPV1/TRPA1 mRNA表达 qPCR检测小鼠子宫内膜组织中TRPV1/TRPA1 mRNA表达结果如图 1所示。与假手术组相比，模型组，肉桂醛+模型组以及TRPA1拮抗剂+模型组的TRPV1 mRNA表达显著上调；肉桂醛和HC-030031对模型组TRPV1 mRNA表达的作用不显著（图 1A）。与假手术组相比，模型组、肉桂醛+模型组的TRPA1 mRNA表达显著上调；肉桂醛显著上调模型组的TRPA1 mRNA表达，而HC-030031显著抑制模型组的TRPA1 mRNA表达（图 1B）。
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| (1) vs. Sham group, P < 0.01; (2) vs. Model group, P < 0.01. 图 1 各组小鼠子宫内膜组织中TRPV1/TRPA1 mRNA表达 Fig 1 Expression of TRPV1/TRPA1 mRNA in endometrial tissues of mice in each group |
Western blot检测小鼠子宫内膜组织中TRPV1/TRPA1蛋白表达 与假手术组相比，模型组、肉桂醛+模型组和TRPA1拮抗剂+模型组的TRPV1蛋白表达显著上调；肉桂醛和HC-030031对模型组TRPV1蛋白表达的作用不显著（图 2A、2B）。与假手术组相比，模型组、肉桂醛+模型组的TRPA1蛋白表达显著上调，肉桂醛显著上调模型组的TRPA1蛋白表达，而HC-030031显著抑制模型组TRPR1蛋白表达（图 2A、2C）。
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| A: TRPV1/TRPA1 protein expression was detected by Western blot; B and C: Quantitative analysis of TRPV1 and TRPA1 protein expression (n=3). (1) vs. Sham group, P < 0.01; (3) vs. Model group, P < 0.01. 1: Sham group; 2: Model group; 3: Model+ Cinnamaldehyde group; 4:Model+ HC-030031 group. 图 2 各组小鼠子宫内膜组织中TRPV1/TRPA1蛋白表达 Fig 2 Protein level of TRPV1/TRPA1 in endometrial tissues of mice in each group |
ELISA检测各组小鼠血清及腹腔冲洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2的含量 与假手术组相比，模型组小鼠血清（图 3A~3D）以及腹腔冲洗液（图 3E~3H）中IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2的含量显著升高；肉桂醛进一步促进上述作用，而HC-030031显著抑制模型组小鼠血清以及腹腔冲洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2的含量升高。
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| A-D: Concentrations of IL-1β, IL-6, TNF-α and PGE2 in peripheral blood; E-H: Concentration of IL-1β, IL-6, TNF-α and pGE2 in abdominal rinse solution. 1: Sham group; 2: Model group; 3: Model+ Cinnamaldehyde group; 4: Model+ HC-030031 group.(1) vs. Sham group, P < 0.01; (2) vs. Model group, P < 0.01. 图 3 ELISA检测各组小鼠外周血和腹腔灌洗液的炎性因子含量 Fig 3 Concentrations of inflammatory cytokines in serum and peritoneal irrigation fluid of mice in each group |
免疫荧光检测各组小鼠子宫内膜组织中TRPV1/TRPA1蛋白表达共定位 如图 4所示，肉桂醛+模型组小鼠内异症组织中TRPV1伴TRPA1蛋白含量最高；与假手术组相比，模型组小鼠的TRPV1/TRPA1共表达显著上调；TRPA1拮抗剂+模型组及假手术组小鼠的TRPV1/TRPA1蛋白表达最低，这提示TRPV1/TRPA1异构体可能与小鼠内异症疼痛呈正相关。
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| A: TRPV1/TRPA1 in endometrial tissues by immunofluorescence staining, showing merged fields with TRPV1 (green), TRPA1 (red) and DAPI (blue); B-C: Fluorescence intensity of TRPV1 and TRPA1. (1) vs. Sham group, P < 0.01; (2) vs. Model group, P < 0.01. 1: Sham group; 2: Model group; 3: Model+ Cinnamaldehyde group; 4: Model+ HC-030031 group. 图 4 免疫荧光检测各组小鼠子宫内膜组织中TRPV1/TRPA1蛋白表达共定位 Fig 4 Co-localization of TRPV1/TRPA1 protein expression in endometrial tissues of mice in each group |
内异症是一种雌激素依赖性炎症性疾病，疼痛为内异症患者主要的临床症状之一，即使经过治疗，疼痛仍然持续。内异症相关疼痛的多种机制包括痛觉敏化、炎症和外周和中枢神经系统疼痛处理的改变。免疫细胞分泌的细胞因子（如IL-1β、IL-6和TNFα等）分布在腹膜液中可能对内异症起到促痛剂的作用，直接引起TRPV1通道的兴奋性改变，使得周围神经敏感，或引发复杂的反馈作用，放大微环境炎症反应和疼痛的产生[14]。TRPV1和TRPA1是在炎症信号通路中起关键作用的阳离子通道，在内异症相关疼痛中的作用机制尚未可知。我们通过构建内异症小鼠模型，结合TRPA1抑制剂和激动剂，分析TRPA1/TRPV1异聚体对内异症小鼠疼痛和炎性因子的影响，为内异症相关疼痛的治疗提供科学依据。
本研究结果显示，TRPV1/TRPA1异构体在内异症小鼠中表达上调；TRPA1激动剂肉桂醛对内异症引起的小鼠疼痛的减轻作用较小；TRPA1抑制剂HC-030031对内异症引起的小鼠疼痛的减轻作用更为显著，说明TRPV1/TRPA1异构体的形成可能与内异症小鼠缩宫素诱导的疼痛有关。肉桂醛进一步促进内异症小鼠血清及腹腔灌洗液炎症因子含量，而HC-030031则对其有显著抑制作用，提示TRPV1/TRPA1异聚体可能有利于感知响应炎症微环境，进行信号传导，增强疼痛感。
研究表明，抑制TRPV1和TRPA1通道可通过线粒体裂变/融合蛋白抑制Toll样受体4（toll-like receptor 4，TLR4）/NF-κB和NLR家族Pyrin域蛋白3（NLR family pyrin domain containing 3，NLRP3）/caspase-1通路起到抗肺部炎症的作用[15]。另一项研究得出类似结果，即TRPV1和TRPA1通道抑制剂能够减少脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的小鼠急性肺损伤[16]。TRPA1以及TRPV1在结构上与非选择性阳离子通道相关，主要位于辣椒素敏感肽能感觉神经元[7]。TRPV1和TRPA1通道可以响应炎症因子、热刺激物等，被激活后可将外周信号传输到中枢等多通道，从而诱导启动慢性炎症疾病的免疫系统反应[17]。TRPV1和TRPA1在感知环境危害以及增强炎症疼痛感方面发挥重要作用。研究证实TRPV1-TRPA1相互作用可能形成主要依赖于钙离子的异质通道[18]。跨膜蛋白100与TRPA1和TRPV1共表达并形成复合物，选择性增强TRPA1活性，并削弱TRPA1和TRPV1的关联，而TRPA1和TRPV1是关键的疼痛介质[11]。包括TRPV1和TRPA1在内的瞬时感受器电位通道已成为炎症性疼痛的潜在传感器和转导器。TRPV1/TRPA异聚体调节内异症疼痛的潜在机制需进一步体内外研究证明[19]。
研究显示，内异症可分为免疫优势期和激素优势期两个阶段。内异症的早期起始阶段（72 h以内）在很大程度上受到先天免疫系统的调控。在内异症早期的动物模型中，炎症因子和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的mRNA和蛋白水平均升高，但这种变化与雌二醇治疗无关。同时炎症细胞通过非内质网依赖的方式被招募到腹腔。子宫内膜异位早期阶段免疫系统信号主导雌二醇介导的信号，随后可能出现激素占主导地位的发展阶段[20]。Krisztina等[20]研究发现，雌激素可能通过调节炎症细胞因子巨噬细胞迁移抑制因子而上调大鼠子宫内膜组织中TRPA1和TRPV1的表达。本研究表明内异症小鼠外周血和腹腔灌洗液炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2的含量增加，TRPA1抑制剂HC-030031显著抑制炎性因子的表达，尚缺乏TRPA1和TRPV1在临床内异症样本中的表达数据以及细胞功能验证。因此，需要进一步的体外研究证实TRPA1/TPPV1异聚体和炎性因子在内异症疼痛发展的相互作用关系。
综上所述，本研究初步探讨了小鼠内异症模型中TRPV1/TRPA1在内异症相关疼痛中的作用，TRPV1/TRPA1表达水平可以作为评估内异症相关疼痛程度的参考，靶向TRPV1/TRPA1异聚体可能成为治疗内异症疼痛的选择之一。
作者贡献声明 朱海 实验操作，数据收集，论文撰写。王一，贺奕博 数据统计和分析，论文修订。俞卫锋 研究设计和指导，论文修订。
利益冲突声明 所有作者均声明不存在利益冲突。
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