2022, Vol. 49
2. 上海市影像医学研究所 上海 200032;
3. 复旦大学附属中山医院中医-中西医结合科 上海 200032
2. Shanghai Institute of Medical Imaging, Shanghai 200032, China;
3. Department of Integrative Medicine, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China
胰腺癌起病隐匿，是临床上最常见的恶性肿瘤之一，具有“癌症之王”的称号[1]。由于胰腺癌病因复杂，诊断困难，确诊时只有10%~20%的患者能够进行手术切除[2]。虽然近年来肿瘤患者的存活率有所提高，但胰腺癌患者的五年生存率仍维持在8%。目前胰腺癌一线治疗药物如吉西他滨常常会对患者产生毒副作用，导致患者产生耐药性，而其他治疗手段如根治性手术切除、放化疗等效果也不甚理想，因此寻找更有效的治疗方法十分重要。前期有研究报道传统中药里含有大量生物活性成分，能够增强化疗药物的治疗效果，减少肿瘤患者治疗过程中的不良反应，减缓癌痛，从而提高生存质量[3-4]。根据临床表现，中医辩证认为胰腺癌核心病机为湿热蕴毒，主要治疗原则为清热燥湿，解毒抑癌[5]。目前关于胰腺癌的辩证分型尚无统一标准，不同的中医学家利用辨证论治的思想以中焦脾虚作为胰腺癌内因，以其出现的毒热、湿阻、痰凝、气滞、血瘀等表象认为胰腺癌的临床表现与中焦湿热毒邪相关，而湿热毒邪内蕴则是本病首要病机和发病的内在条件[6]。本研究通过辨证论治以清热解毒、燥湿消结、祛邪抑癌原则为主，以清热解毒、燥湿抑癌中药组成治疗方剂。该治疗方剂包括黄连、苦参、山慈菇、青黛、姜黄、牛黄及雄黄。本实验拟观察燥湿解毒复方对小鼠胰腺癌细胞株皮下荷瘤生长的影响，并利用生物信息学数据库推断该燥湿解毒复方针对胰腺癌的潜在治疗靶点及相关生物学通路，为中医药治疗胰腺癌提供更多实验依据。
材料和方法瘤株和实验动物 鼠源胰腺癌Panc02细胞株由复旦大学附属中山医院胰腺外科惠赠。6~7周龄C57BL/6雄性小鼠共40只，购自上海杰司捷实验动物有限公司（实验动物合格证编号为20180004024014）。实验小鼠饲养于复旦大学附属中山医院中心实验室无特殊病原体（specific pathogen free，SPF）环境中。该实验设计方案经复旦大学附属中山医院动物实验伦理委员会批准（批件号：2020-069）。小鼠由普通饲料喂养，保证自由进食，水源充足，光照时间为12 h，饲养温度为18~28 ℃，日温差≤3 ℃，相对湿度达40%~70%。
主要试剂与耗材 RPMI-1640，胎牛血清，0.25% Trypsin-EDTA，无菌磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Saline，PBS，Gibco，pH 7.4），均购自美国Gibco公司；T25、T75透气培养瓶（美国Corning公司）；游标卡尺（得力集团有限公司）。
小鼠胰腺癌细胞株皮下荷瘤模型的建立 取对数生长期且生长状态良好的Panc02细胞，弃掉培养基后使用无菌PBS清洗，加入0.25%胰酶消化细胞。待显微镜下观察到细胞之间出现间隙后，使用含有10%胎牛血清的培养基终止消化后离心（r=17.9 cm，1 000 r/min，5 min）。弃去上清液，用无菌PBS清洗一遍，最后用PBS重悬后将细胞置于冰上备用。使用1 mL微量注射器吸取细胞悬液0.1 mL（2×106个细胞）并缓慢注入小鼠背部皮下，注射后局部穿刺点按压1 min后观察有无渗漏。以上所有实验操作均在超净工作台内进行，实验过程严格遵照无菌要求。每日检查小鼠的一般状况，观察及触诊肿瘤的生长状况并做好瘤体质量的测量及记录。
中药复方汤剂制备 中药组合方剂包括黄连30 g，苦参20 g，山慈菇20 g，青黛10 g，姜黄20 g，牛黄5 g以及雄黄2 g，此治疗方剂以70 kg/d人体剂量为标准配置。将黄连30 g、苦参20 g、山慈菇20 g、姜黄20 g研磨成粉末后装入煎药包中，放入陶瓷砂锅中浸泡10 min使药物完全被水渗透以便于有效成分的溶解。头煎时加入700 mL纯净水煎熬30 min，两煎时加入800 mL纯净水煎熬50 min以便使药物之间充分作用，同时使药物中的有效成分能够彻底溶出从而增强疗效。然后用文火煎熬浓缩至100 mL后冷却并使用无菌纱布过滤药液，最后加入青黛10 g、牛黄5 g和雄黄2 g充分搅拌混匀后分装至50 mL离心管（浓度：1.07 g/mL），置于4 ℃冰箱保存。
胰腺癌皮下成瘤小鼠分组与给药 C57BL/6雄性小鼠荷瘤7天后，根据人和小鼠体表面积等效剂量比值计算公式[7]，将小鼠随机分为4组，分别为高剂量给药组[27.82 g生药/（kg·d）]，中等剂量给药组[13.91 g生药/（kg·d）]，低剂量给药组[6.96 g生药/（kg·d）]以及PBS对照组，每组10只。每日上午定时灌胃给药1次，共21天。
观察项目及计算方法 每日灌药前称量并记录小鼠体质量。测量荷瘤的长径（a）和短径（b），按照肿瘤体积计算公式V=（a×b2）/2计算肿瘤体积，绘制肿瘤体积生长曲线[8]。给药21天后处死小鼠取出肿瘤组织进行称量，并按以下公式计算肿瘤抑制率：肿瘤抑制率%=（对照组平均瘤重-给药组平均瘤重）/对照组平均瘤重×100%。当肿瘤抑制率 > 30%，且经统计学处理有明显差异者（P < 0.05）认为有抗肿瘤作用[9]。
燥湿解毒复方活性成分与胰腺癌潜在靶点筛选 利用基于研究中药分子机制的在线生物信息学分析工具BATMAN-TCM（a Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine）（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）筛选复方针对胰腺癌的潜在靶点，探索中药-靶向途径/疾病关联网络和生物途径与突出的中药相关性靶标，探索配方分子生物学水平的治疗机制[10]。
蛋白质互作网络及基因本体论富集分析 借助STRING（https://string-db.org/）在线数据库对靶点基因进行蛋白质互作网络（protein-protein interaction network，PPI）分析[11]。筛选条件为（1）Protein Name：靶点蛋白；（2）Organism：Homo sapiens。每个节点（Node）代表不同的靶点，节点与节点之间的边（Edge）代表各靶点之间存在相互作用。根据程度值（Degree）由大到小的顺序进行靶点基因的基因本体论（Gene Ontology，GO）富集分析。GO富集结果主要包括生物过程（biological process，BP），根据P值筛选出排名前十的生物学过程。
靶点基因在胰腺癌中的表达及对患者总生存期的影响 借助GEPIA 2（http://gepia2.cancer-pku.cn/）数据库分析该复方中药内靶点基因在胰腺癌和癌旁组织中的差异表达[12]。设定的筛选条件为：（1）Gene：靶点基因；（2）Cancer name：PAAD（pancreatic adenocarcinoma）；（3）|Log2FC| Cutoff：1；P-value Cutoff：0.01。选择log2（TPM+1）作为柱状图纵坐标。进一步借助GEPIA 2分析靶点基因与胰腺癌患者总生存期之间的关系，设定的条件参数为：（1）Gene：靶点基因；（2）Methods：Overall Survival；（3）Group Cutoff：Median；Cutoff-High（%）：50；Cutoff-Low（%）：50；（4）Hazards Ratio：Yes；（5）Axis Units：Months.
统计学处理 数据以x±s表示，各组间差异检验采用SPSS 22.0统计软件进行单因素方差分析。靶点基因在胰腺癌组织和正常组织中的表达差异采用t检验，靶点基因与胰腺癌患者预后的关系采用Kaplan-Meier方法进行分析并采用Log-Rank进行检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
结果不同剂量治疗方剂对肿瘤生长曲线的影响 实验过程中荷瘤小鼠生长状态及精神状态良好，进食饮水正常。从给药第8天开始，各组小鼠肿瘤体积开始出现差异，中等剂量给药组以及高剂量给药组小鼠肿瘤体积生长曲线平稳但未停滞。低剂量给药组和对照组小鼠肿瘤体积生长曲线陡直，生长速度较快并且生长趋势基本一致（图 1）。
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| A: High-dose [27.82 g crude drug/(kg·d)] administration group; B: Medium-dose [13.91 g crude drug/(kg·d)] administration group; C: Low-dose [6.96 g crude drug/(kg·d)] administration group; D: Control (phosphate buffered saline) group.(1)P < 0.05. 图 1 不同剂量燥湿解毒复方对C57BL/6小鼠胰腺癌细胞株Panc02皮下荷瘤生长曲线的影响 Fig 1 The effects of different doses of the compound prescription of detoxication of dryness-dampness on the growth curve of pancreatic cancer cell line Panc02 in C57BL/6 mice |
不同浓度治疗方剂对荷瘤小鼠体质量以及抑瘤作用的影响 统计结果表明，给药前和给药21天后4组小鼠体质量差异均无统计学意义。但在给药过程中，高剂量给药组中部分小鼠在给药早期出现体质量下降，在给药中后期时体质量逐渐恢复，推测可能与该方剂中雄黄等成分的毒副作用相关，其机制仍需进一步探讨。抑瘤结果提示该治疗方剂的抗肿瘤作用具有明显的药物浓度依赖性，与对照组和低剂量组相比，高剂量组[27.82 g生药/（kg·d）]与中等剂量组[13.91生药/（kg·d）]的抗肿瘤作用较为明显，其抑瘤率分别为50.00%和43.75%（表 1）。
| (x±s) | |||||||||||||||||||||||||||||
| Group | Dosage [g crude drug/（kg·d）] | The number of mice（n） | The weight of mice（g） | Tumor weight（g） | Tumor inhibition rate（%） | t | P | ||||||||||||||||||||||
| Before experiment | After experimnt | Before experiment | After experimnt | ||||||||||||||||||||||||||
| High-dose | 27.82 | 10 | 6 | 25.04±1.19 | 24.88±1.85 | 0.16±0.08 | 50.00 | -3.875 | 0.002 | ||||||||||||||||||||
| Medium-dose | 13.91 | 10 | 8 | 24.74±1.33 | 24.38±1.14 | 0.18±0.06 | 43.75 | -3.941 | 0.002 | ||||||||||||||||||||
| Low-dose | 6.96 | 10 | 8 | 25.56±1.28 | 25.49±1.51 | 0.23±0.04 | 28.12 | -3.142 | 0.007 | ||||||||||||||||||||
| Control | - | 10 | 8 | 25.75±2.18 | 26.15±3.80 | 0.32±0.08 | - | ||||||||||||||||||||||
该燥湿解毒复方治疗胰腺癌的潜在靶点 利用BATMAN-TCM数据库共检索出该燥湿解毒复方在胰腺癌治疗中的8个关键靶点蛋白，分别是APP、PLK1、PPARG、CA2、EGFR、RARB、NTSR1、TYMS。其中山慈菇在胰腺癌中的潜在靶点为APP、PLK1、PPARG，青黛的潜在靶点为CA2、EGFR，姜黄的潜在靶点为CA2、PPARG、RARB，牛黄的潜在靶点为EGFR、PPARG，黄连的潜在靶点为EGFR，苦参的潜在靶点为CA2、EGFR、NTSR1、RARB、TYMS，雄黄的潜在靶点为TYMS。
PPI网络及基因功能富集分析 利用STRING数据库对以上靶点进行PPI网络构建（图 2）。GO分析显示该燥湿解毒复方治疗胰腺癌的潜在靶点在生物过程方面主要涉及调节骨吸收、细胞对维生素A的反应、星形胶质细胞活化、对超氧阴离子的正向调节、苏氨酸磷酸化的调节、肝细胞再生、一碳代谢过程、RNA聚合酶Ⅱ对pri-miRNA转录的调控和柱状上皮细胞的发育等（表 2）。
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| CA2:Carbonic anhydrase 2;PPARG: Peroxisome proliferator activated receptor gamma; APP: Amyloid precursor protein; NTSR1:Neurotensin receptor 1; RARB: Retinoic acid receptor beta; EGFR: Epidermal growth factor receptor; PLK1:Polo like kinase 1;TYMS: Thymidylate synthetase. 图 2 基于STRING数据库构建靶点蛋白的蛋白-蛋白相互作用网络 Fig 2 Protein-protein interactions (PPI) of target proteins were constructed based on the STRING database |
| GO-term | Description | Gene | Strength | False discovey rate |
| GO：0045780 | positive regulation of bone resorption | CA2，EGFR | 2.41 | 0.021 8 |
| GO：0033189 | response to vitamin A | PPARG，TYMS | 2.41 | 0.021 8 |
| GO：0048143 | astrocyte activation | APP，EGFR | 2.39 | 0.021 8 |
| GO：0032930 | positive regulation of superoxide anion generation | APP，EGFR | 2.39 | 0.021 8 |
| GO：0010800 | positive regulation of peptidyl-threonine phosphorylation | APP，PLK1 | 2.21 | 0.030 0 |
| GO：0097421 | liver regeneration | EGFR，TYMS | 2.20 | 0.030 7 |
| GO：0006730 | one-carbon metabolic process | CA2，TYMS | 2.10 | 0.037 3 |
| GO：0031100 | animal organ regeneration | PPARG，EGFR，TYMS | 1.99 | 0.011 8 |
| GO：1902893 | regulation of pri-miRNA transcription by RNA polymerase Ⅱ | APP，PPARG | 1.97 | 0.047 1 |
| GO：The Gene Ontology；CA2：Carbonic anhydrase 2；EGFR：Epidermal growth factor receptor；PPARG：Peroxisome proliferator activated receptor gamma；TYMS：Thymidylate synthetase；APP：Amyloid precursor protein；PLK1：Polo like kinase 1. | ||||
靶点基因在胰腺癌和正常胰腺组织中的表达差异 GEPIA 2数据库包含179例胰腺癌组织和171例正常胰腺组织。数据分析显示APP、PLK1、PPARG、CA2、EGFR、RARB、NTSR1、TYMS在胰腺癌组织中均呈显著高表达，差异具有统计学意义（图 3，P < 0.05）。
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| Red: Pancreatic cancer tissues; Grey: Normal pancreatic tissues. (1)P < 0.05. 图 3 靶点基因在胰腺癌与正常胰腺组织中的表达 Fig 3 The expression level of target genes in pancreatic cancer tissues in comparison to those in normal tissues |
靶点基因表达对胰腺癌患者总生存率的影响 为进一步研究靶点基因表达水平与胰腺癌患者生存期的关系，我们利用GEPIA 2数据库生存分析功能发现EGFR和PLK1高表达组的患者生存率降低（图 4，P < 0.05），提示EGFR和PLK1与胰腺癌患者预后存在相关性。
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| 图 4 靶点基因表达水平与胰腺癌患者总生存率的关系 Fig 4 The relationships between the target genes expressions and overall survival (OS) in patients with pancreatic cancer |
胰腺癌发病率逐年升高，预计到2030年将成为全球第二大致死癌症。由于其发展快、病程短、易转移，多数患者初诊时即伴有远处脏器的转移从而丧失了最佳治疗时机[13-14]。在中医里，胰腺癌属“癥瘕”“膵癥”范畴，其核心病机为“湿热蕴毒”。该燥湿解毒复方针对胰腺癌核心病机以苦参、黄连、山慈菇、青黛、姜黄、牛黄、雄黄组成。方中苦参、黄连燥湿清热为君，牛黄、雄黄解毒清热为臣，山慈菇、青黛佐君药解毒，姜黄使臣药破瘀。中医药物学经典著作《神农本草经》记载：苦参味苦寒，主心腹结气，症瘕积聚，黄疸。黄连味苦寒，主热气。雄黄味苦平寒，主寒热，鼠瘘恶创，疽痔死肌。牛黄味苦平，主惊痫，寒热，热盛狂痓。李时珍《本草纲目》记载：姜黄辛苦大寒，无毒，主治癥瘕血块，心腹结积。《要药分剂》曰：青黛除热解毒，兼能凉血。《中药大辞典》谓山慈菇消肿散结，化痰解毒。现代研究表明用中医治疗胰腺癌能有效改善晚期胰腺癌患者的生存质量，提高患者的带瘤生存期[15]。例如清胰化积方能够显著提高晚期胰腺癌患者的五年生存率以及中位生存期[16]，为胰腺癌从湿热解毒论治提供了更多科学依据。
本实验研究表明：与对照组比较，高剂量以及中等剂量的燥湿解毒复方均能够有效抑制胰腺癌细胞皮下荷瘤小鼠的肿瘤生长，抑瘤率分别为50.00%和43.75%，抑瘤率呈剂量依赖关系。借助BATMAN-TCM在线数据库我们推测出该燥湿解毒复方治疗胰腺癌的潜在靶点蛋白包括APP、PLK1、PPARG、CA2、EGFR、RARB、NTSR1、TYMS。GO分析结果推测这些靶点在人体内参与的生物学过程可能包括调节骨吸收、细胞对维生素A的反应、星形胶质细胞活化、对超氧阴离子的正向调节、苏氨酸磷酸化的调节、肝细胞再生、一碳单位的代谢过程、RNA聚合酶Ⅱ对pri-miRNA转录的调控、柱状上皮细胞的发育等。以上大部分生物学过程在肿瘤细胞生长过程中都发挥重要作用[17-19]，靶向抑制这些生物学过程在癌症治疗中具有重要临床意义。
通过生物信息学数据库分析发现这些关键靶点基因在胰腺癌组织中的表达均显著上调，对这些关键靶点进行生存分析发现在胰腺癌患者中EGFR和PLK1高表达提示预后不良。EGFR已被证实与实体肿瘤的生长、分化与增殖相关。在胰腺癌患者中，EGFR与胰腺癌患者的分期、转移以及分化相关[20]。PLK1是一种能够抑制肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤细胞生长的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，抑制PLK1的表达能有效抑制肿瘤细胞的增殖[21]。由于EGFR和PLK1与胰腺癌的发生发展密切相关，针对EGFR和PLK1的靶向治疗将为胰腺癌患者的早期诊断、预后及治疗提供极大的帮助。
本研究基于动物实验及生物信息学结果推测该燥湿解毒复方在胰腺癌治疗方面具有较好的临床应用前景，但其确切作用机制仍有待进一步探讨。
作者贡献声明 王小林 论文构思、撰写和修订。雷洋洋 论文撰写，实验操作，数据采集和统计分析。李建柯，高珊珊 论文修订，实验操作，数据采集。蔡定芳 实验设计，论文修订。
利益冲突声明 所有作者均声明不存在利益冲突。
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