2022, Vol. 49
2. 复旦大学附属中山医院妇瘤科 上海 200032;
3. 复旦大学附属中山医院厦门医院检验科 厦门 361015;
4. 复旦大学附属中山医院吴淞医院检验科 上海 200940
2. Department of Gynecological Oncology, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China;
3. Department of Laboratory Medicine, Zhongshan Hospital Xiamen Branch, Fudan University, Xiamen 361015, Fujian Province, China;
4. Department of Laboratory Medicine, Wusong Hospital, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200940, China
DNA损伤是导致肿瘤的诱因之一, DNA双链断裂（DNA double-strand break, DSB）是最严重的损伤形式。在正常情况下, 机体通过损伤修复通路来维持基因组的完整性和稳定性, 其中同源重组（homologous recombination, HR）是DSB的主要修复方式。乳腺癌易感基因1（breast cancer gene 1, BRCA 1）和乳腺癌易感基因2（breast cancer gene 2, BRCA 2）是参与HR的重要基因。BRCA 1/2基因变异会造成蛋白功能缺陷, 导致基因组不稳定。携带胚系BRCA 1/2基因变异（germline BRCA 1/2 mutations, gBRCAm）的个体终生罹患乳腺癌的风险显著增加[1-2]。同时携带gBRCAm的乳腺癌患者对聚ADP核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase, PARP）抑制剂更敏感[3-5]。携带gBRCAm的乳腺癌患者预后较差, 无进展生存期和总生存期均低于未携带变异患者[6]。美国国家综合癌症网络指南建议对乳腺癌患者进行常规gBRCAm检测[2, 7-8]。
BRCA 1/2基因变异位点和类型较多, 随机分布于整条基因序列, 无明确热点。目前, 多采用二代测序（next-generation sequencing, NGS）和多重连接依赖性探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA）检测gBRCAm。BRCA 1/2基因变异存在地域、种族和癌种的异质性, 因此研究乳腺癌患者的BRCA 1/2基因变异谱对风险评估、诊疗管理具有重要的意义。本文采用NGS检测146例未经筛选的乳腺癌患者的gBRCAm, 分析乳腺癌gBRCAm类型和分布情况, 并探讨其与临床特征的关系。
资料和方法研究对象 选取2019年6月至2021年4月于复旦大学附属中山医院就诊的146例乳腺癌患者。入组标准：经活检或手术病理确诊为乳腺癌。排除标准：（1）合并其他原发肿瘤；（2）转移乳腺癌；（3）伴有其他全身性严重疾病的患者。其中男性患者2例, 女性患者144例, 中位年龄为（53.7±13.3）岁。本研究获得复旦大学附属中山医院伦理委员会批准（批件号：B2021-056）, 且获得患者知情同意。
胚系BRCA 1/2基因变异检测 采集146例患者EDTA-K2抗凝全血, 采集到的2 mL全血按血液DNA核酸提取试剂盒（厦门艾德生物医药股份有限公司）说明书流程提取基因组DNA。采用Qubit dsDNA HS试剂（美国ThermoFisher公司）检测DNA浓度, 保证投入量为50 ng。根据BRCA 1/2基因突变检测试剂盒（厦门艾德生物医药股份有限公司）要求建库。采用Qubit dsDNA HS和DNA 1000试剂（美国Agilent公司）对文库质检, 要求浓度 > 0.5 ng/µL, 片段分布在260~400 bp, 无明显引物二聚体及杂峰。使用Miseq Dx和Miseq V2芯片测序（美国Illumina公司）。采用艾德“人类1/2基因高通量测序数据分析软件”（v1.1.4）ADXHS-gBRCA-CNV模块分析测序数据, 获得gBRCAm预分类结果。所有样本满足平均有效测序深度 > 300, 测序质量 > 75%, 比对率85%, 覆盖度100%。本检测包括BRCA 1基因（NM_007294.3）外显子2、3、5~24以及BRCA 2基因（NM_000059.3）外显子2~27及外显子-内含子连接区、UTR区（非翻译区）和启动子区的点突变和插入缺失突变。根据美国医学遗传学与基因组学学会（American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG）遗传解读原则, 基于人群数据、计算数据、功能数据、共分离数据等证据将变异分为5类, 包括良性、疑似良性、意义不明确、疑似致病和致病变异, 本文提及的gBRCAm为疑似致病和致病变异。对检出的疑似致病或致病变异进行一代测序验证。采用MLPA对分析软件输出的大片段重排（large rearrangement, LR）进行验证。
临床资料 收集乳腺癌患者一般临床资料和组织病理资料, 包括发病年龄、确诊时肿瘤发生部位、前哨和腋窝淋巴结状态、组织学分级、雌激素受体（estrogen receptor, ER）、孕酮受体（progesterone receptor, PR）和人表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factor receptor-2, HER-2）。
统计学方法 数据分析采用SPSS 23.0软件。计数资料以率表示。采用χ2检验和Fisher精确检验比较gBRCAm在乳腺癌中的分布, 探讨其与临床特征的关系。所有均为双侧检验, 以P < 0.05为差异有统计学意义。
结果胚系BRCA 1/2基因变异在乳腺癌中的分布 在146例乳腺癌患者中, 检出18例患者携带gBRCAm, 人群变异频率为12.3%, 其中8例发生BRCA 1基因变异, 10例发生BRCA 2基因变异。在癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）数据库中乳腺癌患者携带gBRCAm频率为5.3%[9]。本研究中乳腺癌患者携带gBRCAm的频率显著高于TCGA数据库报道（P=0.023）, 且携带BRCA 1和2基因变异频率分别为5.5%和6.9%, 分布无明显偏向（图 1）。
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| TCGA: The Cancer Genome Atlas. 图 1 不同研究中乳腺癌患者携带gBRCAm的频率 Fig 1 Prevalence of gBRCAm from patients with breast cancer in different studies |
胚系BRCA 1/2基因变异分布和类型特征 94.4%（17/18）的变异发生于外显子, 仅5.6%（1/18）的变异发生于内含子剪接区。16.7%（3/18）的肿瘤患者携带的变异发生于BRCA 1基因的外显子11, 38.9%（7/18）的肿瘤患者携带的变异发生于BRCA 2基因的外显子11, 乳腺癌患者携带的变异多见于BRCA 2基因的外显子11。在检出的18个不同变异中, 移码突变是最主要的变异类型（61.1%）, 无义突变、大片段重排和剪接突变比例分别为16.7%、11.1%和5.5%, 检出1例（5.5%）同义突变（图 2A）。BRCA 1基因中检出5种不同类型的变异, 而BRCA 2基因中仅检出3种不同类型的变异（图 2B）。在BRCA 1和BRCA 2基因上各检出1例LR携带者, 均为大片段缺失。在检出的变异中, 乳腺癌患者携带BRCA 2基因c.5682C > G的频率最高, 但未发现热点或潜在始祖突变, 其中NM_000059.3：c.6043_6055del13C为新发现变异, 未见其他文献和ClinVar数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar）报道。变异在蛋白功能和结合域的分布如图 3A和3B所示, 大部分变异发生于BRCA 1和BRCA 2蛋白的重要功能区和结构域上。
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| A: Spectrum of gBRCAm in breast cancer patients; B: Mutational landscape of BRCA 1 and BRCA 2, respectively. 图 2 乳腺癌患者胚系BRCA 1/2基因变异类型和分布 Fig 2 Variation type and distribution of gBRCAm in breast cancer patients |
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| A: Locations of germline mutations in BRCA 1;B: Locations of germline mutations in BRCA 2 图 3 胚系BRCA 1/2基因变异在蛋白功能和结合域的分布 Fig 3 Distributions of gBRCAm in functional domains and protein binding regions |
胚系BRCA 1/2基因变异与乳腺癌临床和病理特征的关系 146例乳腺癌患者中, 收集到94例患者的一般临床资料和组织病理资料。在不同乳腺癌人群中胚系BRCA 1/2基因变异情况存在差异, 胚系BRCA 1/2基因变异多见于早发乳腺癌（P < 0.001）、肿瘤家族史（P=0.008）、双侧乳腺癌（P=0.001）和三阴型乳腺癌（P=0.025）, 且BRCA 1基因变异与三阴型乳腺癌发生密切相关（P=0.007, 表 1）。进一步分析发现胚系BRCA 1/2基因变异与肿瘤分级（P=0.031）、PR状态（P=0.040）和HER2状态（P=0.039）相关, 但与前哨和腋窝淋巴结转移（P=0.048和0.085）和ER状态（P=0.260）无关（表 2）。在ER和PR阳性组中, 携带BRCA 2基因变异的乳腺癌患者显著多于携带BRCA 1基因变异的患者（P=0.041和P=0.026）。BRCA 1基因变异携带患者中, 三阴型和Luminal B型分别为75%和25%, 而BRCA 2基因变异携带患者中, 57.1%为Luminal B型, 28.6%为Luminal A型, 14.3%为HER2表达型。
| [n(%)] | |||||||||||||||||||||||||||||
| Categories | Non-carriers （n=79） |
gBRCA 1/2 carriers （n=15） |
gBRCA 1 carriers （n=8） |
gBRCA 2 carriers （n=7） |
P1 | P2 | |||||||||||||||||||||||
| Early-age onset breast cancer（≤35 y） | |||||||||||||||||||||||||||||
| Yes | 3（3.8） | 6（40.0） | 2（25.0） | 4（57.1） | <0.001 | 0.315 | |||||||||||||||||||||||
| No | 76（96.2） | 9（60.0） | 6（75.0） | 3（42.9） | |||||||||||||||||||||||||
| Familial cancer history | |||||||||||||||||||||||||||||
| Yes | 6（7.6） | 5（33.3） | 2（25.0） | 3（42.9） | 0.008 | 0.464 | |||||||||||||||||||||||
| No | 66（83.5） | 10（66.7） | 6（75.0） | 4（57.1） | |||||||||||||||||||||||||
| Unknown | 7（8.9） | 0（0） | - | - | |||||||||||||||||||||||||
| Bilateral breast cancer | |||||||||||||||||||||||||||||
| Yes | 1（1.3） | 4（26.7） | 1（12.5） | 3（42.9） | 0.002 | 0.282 | |||||||||||||||||||||||
| No | 78（98.7） | 11（73.3） | 7（87.5） | 4（57.1） | |||||||||||||||||||||||||
| Triple-negative breast cancer | |||||||||||||||||||||||||||||
| Yes | 12（15.2） | 6（40.0） | 6（75.0） | 0（0） | 0.025 | 0.007 | |||||||||||||||||||||||
| No | 67（84.8） | 9（60.0） | 2（25.0） | 7（100.0） | |||||||||||||||||||||||||
| P1：Non-carriers vs. gBRCA 1/2 carriers；P2：gBRCA 1 carriers vs. gBRCA 2 carriers. | |||||||||||||||||||||||||||||
| [n(%)] | |||||||||||||||||||||||||||||
| Characteristics | Non-carriers （n=79） |
gBRCA 1/2 carriers （n=15） |
gBRCA 1 carriers （n=8） |
gBRCA 2 carriers （n=7） |
P1 | P2 | |||||||||||||||||||||||
| Tumour grade | |||||||||||||||||||||||||||||
| Ⅰ | 9（11.4） | 0（0） | 0（0） | 0（0） | 0.031 | - | |||||||||||||||||||||||
| Ⅱ | 24（30.4） | 1（6.7） | 0（0） | 1（14.3） | |||||||||||||||||||||||||
| Ⅲ | 38（48.1） | 12（80.0） | 6（75.0） | 6（85.7） | |||||||||||||||||||||||||
| Unknown | 8（10.1） | 2（13.3） | 2（25.0） | 0（0） | |||||||||||||||||||||||||
| Sentinel lymph node | |||||||||||||||||||||||||||||
| Positive | 33（41.8） | 8（53.3） | 3（37.5） | 5（71.4） | 0.408 | 0.315 | |||||||||||||||||||||||
| Negative | 46（58.2） | 7（46.7） | 5（62.5） | 2（28.6） | |||||||||||||||||||||||||
| Axillary lymph node | |||||||||||||||||||||||||||||
| Positive | 24（30.4） | 8（53.3） | 3（37.5） | 5（71.4） | 0.085 | 0.315 | |||||||||||||||||||||||
| Negative | 55（69.6） | 7（46.7） | 5（62.5） | 2（28.6） | |||||||||||||||||||||||||
| PR status | |||||||||||||||||||||||||||||
| Positive | 47（59.5） | 4（26.7） | 0（0） | 4（57.1） | 0.040 | 0.026 | |||||||||||||||||||||||
| Negative | 32（40.5） | 11（73.3） | 8（100.0） | 3（42.9） | |||||||||||||||||||||||||
| ER status | |||||||||||||||||||||||||||||
| Positive | 54（68.4） | 8（53.3） | 2（25.0） | 6（85.7） | 0.260 | 0.041 | |||||||||||||||||||||||
| Negative | 25（31.6） | 7（46.7） | 6（75.0） | 1（14.3） | |||||||||||||||||||||||||
| HER-2 status | |||||||||||||||||||||||||||||
| Positive | 30（38.0） | 1（6.7） | 0（0） | 1（14.3） | 0.039 | 0.467 | |||||||||||||||||||||||
| Negative | 49（62.0） | 14（93.3） | 8（100.0） | 6（85.7） | |||||||||||||||||||||||||
| Ki67 status | |||||||||||||||||||||||||||||
| ≥15% | 66（83.5） | 15（100.0） | 8（100.0） | 7（100.0） | - | - | |||||||||||||||||||||||
| <15% | 13（16.5） | 0（0） | 0（0） | 0（0） | |||||||||||||||||||||||||
| P1：Non-carriers vs. gBRCA 1/2 carriers；P2：gBRCA 1 carriers vs. gBRCA 2 carriers. | |||||||||||||||||||||||||||||
BRCA 1/2基因属于抑癌基因, 其编码蛋白参与DNA损伤修复、基因转录调控和细胞周期调节等多种细胞生命活动过程。基因功能缺陷会增加乳腺癌的发生风险。目前国内有多项针对乳腺癌患者BRCA 1/2基因变异的研究, 但不同研究中的BRCA 1/2基因变异特征以及其与临床特征间的关系存在一定差异[10-15], 这与入组患者的疾病背景差异有关, 因此本中心希望通过区域性数据的积累和研究, 建立区域化的BRCA 1/2基因变异特征数据库。本研究采用NGS检测146例未经筛选的乳腺癌患者gBRCAm, 分析乳腺癌gBRCAm类型和分布情况, 研究其与临床特征的关系, 为患者的精准诊疗积累相关人群数据。
本研究中乳腺癌患者携带gBRCAm频率为12.3%, 高于数据库报道和其他国内未经筛选的乳腺癌人群[10-13]。94.4%变异发生于外显子区域, 移码变异、无义变异和大片段重排是最常见的致病和疑似致病的变异类型。检出的大部分变异处于BRCA 1和BRCA 2蛋白的重要功能区和结构域。BRCA 1蛋白由N末端RING区（外显子2~7）、多蛋白结合点和功能区（外显子11~13）和C末端BRCT区（外显子16~24）[16]。本研究中16.7%变异发生于BRCA 1基因的外显子11, 该区域发生的变异可能影响BRCA 1蛋白参与DNA修复、细胞周期或核定位的功能, 与早发乳腺癌和卵巢癌相关[14]。BRCA 2蛋白由DNA结合区、3个寡核苷酸结合区、塔区、8个BRC重复区、N末端PALB 2结合区和C末端RAD 51结合区构成[16]。38.9%变异发生于BRCA 2基因的外显子11, 该区域发生的变异可能影响同源重组过程中其与RAD 51蛋白的相互作用[14]。研究显示BRCA 1基因发生LR多于BRCA 2基因[17], 而本研究中在BRCA 1基因和BRCA 2基因各发生了1例LR, 由于入组患者人数少未发现这种偏向。BRCA 1基因发生LR多于BRCA 2基因的主要原因在于Alu介导的HR是导致LR的主要机制, 且BRCA 1基因中Alu密度高于BRCA 2基因[18-19]。女性罹患乳腺癌的风险随BRCA 1/2基因变异类型、发生位置改变而改变[20]。
本研究中40%携带gBRCAm的乳腺癌患者确诊的平均年龄在35岁以下, 低于未携带变异患者。低分化级别乳腺癌、三阴型乳腺癌和双侧乳腺癌患者多携带gBRCAm, 在不同淋巴结状态的患者中差异无统计学意义, 与其他研究报道一致[10, 15]。BRCA 1基因变异在三阴型乳腺癌的比例高达33.3%；激素受体表达在携带gBRCAm的乳腺癌中差异较大。研究报道, BRCA 1基因抑制ER在乳腺癌和前列腺癌细胞中的表达[21], 因此本研究中BRCA 1基因变异倾向于ER、PR阴性表达, 而BRCA 2基因变异倾向于ER、PR阳性表达, 而HER-2在亚组分析中倾向于阴性表达。
综上, 本研究通过NGS检测中国区域性人群未经筛选的乳腺癌患者gBRCAm特征, 研究gBRCAm与乳腺癌临床特征的关系。本研究纳入乳腺癌患者例数较少, gBRCAm组和不同突变亚组的例数较少, 可能造成研究结果的偏倚；本研究为单中心研究, 无法全面勾勒中国人群gBRCAm, 仅能作为区域性特征的研究, 因此需要多中心研究积累中国人群数据库。我们正在不断累积乳腺癌患者gBRCAm的数据, 深入研究不同癌肿的变异图谱, 并联合患者不同治疗方式进行全面分析, 以期为肿瘤患者个体精准诊疗和癌症风险评估等奠定基础。
作者贡献声明 黄斐 样本检测, 数据统计, 论文构思、撰写和修订。陈馨宁, 郁俐 样本检测。姜惠琴, 史庭燕 患者入组, 临床资料收集。沈敏娜 样本收集。潘柏申, 王蓓丽, 郭玮 研究指导。张春燕 实验设计, 论文修改和指导。
利益冲突声明 所有作者均声明不存在利益冲突。
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