2022, Vol. 49
脓毒症是机体对感染反应失调所致的危及生命的器官功能障碍，胃肠道是严重脓毒症累及最严重的器官之一[1]。脓毒症患者并发胃肠功能障碍可促使病情迅速进展，延长住院时间，增加患者的病死率，是脓毒症患者预后不良的独立危险因素之一[2]，临床上已将肠道功能障碍列为评价危重患者预后的关键指标之一。因而，胃肠功能障碍的防治成为脓毒症治疗的关键。
多肽组学是研究体液、器官、组织和细胞中的全部内源性多肽[3]。多肽因具有其独特的生物学活性，如抗氧化、抗凋亡、免疫调节等，在心血管、神经、肿瘤等系统发挥重要作用[4-6]。目前多肽组学在脓毒症疾病中也逐渐受到关注，Wakabayashi等[7]发现8种血液标志物肽，用于预测脓毒症患者弥散性血管内凝血（disseminated intravascular coagulation，DIC）并发症。研究者们亦开始从多肽角度不断探索治疗脓毒症的新手段，如抗菌肽（antimicrobial peptide，AMP）和宿主防御肽（host defense peptides，HDP）已经开始用于新的抗菌药物和宿主反应调节疗法的开发[8]；多肽VSAK能够维持组织葡萄糖摄取并减弱脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）引起的促炎反应[9]。而多肽在脓毒症肠道功能障碍的发生发展报道鲜见。因此，本研究从多肽组学角度出发探索脓毒症肠道功能障碍的发生发展，有望为脓毒症肠道功能障碍患者的临床治疗提供新的研发线索。
材料和方法脓毒症小鼠模型构建 雄性SPF级C57BL/6小鼠，购自上海灵畅生物科技有限公司，生产许可号：SCXK（沪）2018-0003。动物实验符合伦理要求，并获得复旦大学附属中山医院动物伦理委员会的批准（伦理审查号：201804001Z）。采用盲肠结扎穿孔（cecum ligation and puncture，CLP）法建立脓毒症小鼠模型[10]，分为假手术组（n=3）和脓毒症组（n=3）。
肠组织多肽提取 术后24 h以脊椎脱臼法处死实验小鼠，取距离回盲部2 cm处回肠组织，生理盐水冲洗去除肠内容物，装入冻存管于液氮中保存。将肠组织于液氮中研磨成粉末，移入预冷的EP管并加入萃取液，冰上均质化1 min，超声碎裂，离心（4 ℃，14 000×g，30 min），取上清并转移到3K超滤管（美国Millipore公司）中，4 ℃，12 000×g离心，收集流穿液，C18除盐柱除盐，冻干备用。
液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测多肽 色谱流动相由溶剂A（0.1%甲酸水溶液）和溶剂B（0.1%甲酸ACN溶液）组成。基于非标记定量技术，将除盐冻干后的肽段溶于30 μL溶剂A（0.1%甲酸水溶液）后经由配备在线纳喷离子源的LC-MS/MS进行分析。整套系统为串联EASY-nano-LC 1200的Q Exactive™质谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）。共上样3 μL（分析柱Acclaim PepMap C18，75 μm×15 cm），120 min梯度分离：5%~35%溶剂B（0.1%甲酸ACN溶液），溶剂B相梯度从0起始，在106 min以非线性梯度升高到60%，1 min内升高到100%，维持13 min。柱流量控制在300 nL/min。每组3个样本，每个样本进样3次。Q Exactive™质谱仪在数据依赖采集模式下运行，自动在MS和MS/MS采集间切换。质谱参数设置如下：质谱的一级质谱质量范围：m/z=300~1800；电喷雾电压2 kV；动态排除持续时间20 s；MS分辨率为70 000，MS/MS分辨率为17 500；母离子的电荷量设置2~7。通过PEAKS Studio version X（加拿大Bioinformatics Solutions公司）分析串联质谱图；PEAKS DB对数据库uniprot_proteome_mus_musculus_201902（54185 entries）搜库，设置非酶切。搜库参数碎片离子质量容许误差：0.05 g/mol，母离子质量容许误差：10 ppm，可变修饰：氧化（M）15.99，脱酰胺化（NQ）0.98。肽段经过1%错误发现率（false discovery rate，FDR）和1条唯一多肽匹配数质控过滤，最终鉴定的多肽。我们将每组中在2个以上的样品中定量到的肽段计为有效的鉴定结果，取均值；每组中在2个以上的样品中没有定量到的肽段计为无效的鉴定结果，计为0。
生物信息学分析 采用在线计算工具（http://web.expasy.org/compute_pi/）获得差异多肽的等电点（isoelectric point，PI）和分子量（molecular weight，MW）；Blast2GO version 5进行功能注释；GOATOOLS进行差异蛋白功能富集，揭示多肽蛋白前体可能发挥的作用，以确定多肽潜在的生理功能。为了进一步探索差异表达多肽及其前体蛋白的生物学意义，本研究采用KOBAS（http://kobas.cbi.pku.edu.cn/）进行差异多肽的前体蛋白通路分析，KOG（EuKaryotic Orthologous Groups）数据库对鉴定到的差异多肽的前体蛋白进行基于序列相似度的功能分类注释及预测，使用STRING v10.5（www.string-db.org）分析蛋白-蛋白相互作用网络。
统计学分析 EAKS DB搜库数据结果使用R语言aov（）函数进行ANOVA分析，显著性（Significance） > 13（P < 0.05）为差异有统计学意义。
结果脓毒症小鼠肠组织差异表达多肽 将萃取得到的小鼠肠组织内源性多肽样本进行质谱分析，共鉴定到458条多肽序列，涉及129个前体蛋白（卡值标准：1.0% FDR，1条唯一多肽匹配数）。每组中在2个以上的样品中定量到的肽段计为“有效的鉴定结果”，取平均值；每组中在2个以上的样品中没有定量到的肽段计为“无效的鉴定结果”，计为0，Significance > 13（P < 0.05）为差异有统计学意义。得出差异上调的多肽有101个，下调的多肽有9个（其中下调9条多肽肽段及对应前体蛋白分别为GPKGFGRGGAESHTFK-Crip1；GFGRGGAES-HTFK-Crip1；SASNRIIAAKDHA-Rps21；SNRII-AAKDHA-Rps21；SEGTKAVTKYTSSK-H2bc14；NKTGKAVSYLGPK-Atox1；TPEELGLDKV-Cox5a；AGDKLVVVDFS-Txn；AAGDKLVVVDF-Txn）（图 1）。
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| 图 1 脓毒症小鼠肠道组织多肽差异表达的内源性多肽聚类分析 Fig 1 Cluster analysis of differentially expressed endogenous peptides in intestinal tissues of mice with sepsis |
差异表达多肽的理化特征 全部差异表达的内源性多肽MW的分布范围在600~2 400 g/mol，其中在上调多肽中，MW主要集中在800~1 800 g/mol；而在下调多肽中，MW主要集中在1 000~1 400 g/mol（图 2A）；PI的分布范围在3~12，大部分多肽PI集中在4~6（图 2B）。MW和PI的分布在一个比较宽的范围，但大多数多肽的MW低于3 000 g/moL，证实了分离的多肽的纯度。了解差异多肽PI，为后续多肽的分离纯化奠定基础。
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| A: MW of differentially expressed peptides; B: PI of differentially expressed peptides. 图 2 脓毒症小鼠肠道组织差异表达内源性多肽的特点 Fig 2 Characteristics of differentially expressed endogenous peptides in intestinal tissues of mice with sepsis |
差异表达内源性多肽前体蛋白的GO与Pathway分析 我们对差异内源性多肽的前体蛋白进行GO与Pathway分析，来预测差异内源性多肽的潜在功能。GO分析结果主要包括：生物学过程、细胞组分及分子功能集簇。生物学过程涉及（图 3A）：蛋白质折叠、蛋白质分解、蛋白质稳定、凋亡过程的负调节、细胞因子分泌的正性调节、氧化还原过程、MAPK活性的激活等；细胞组分包括（图 3B）：细胞质、细胞外间隙、髓鞘、核仁、核糖体等；分子功能集簇包含（图 3C）：相同的蛋白结合、钙黏蛋白结合、ATP结合、G蛋白耦联受体结合、核糖体的结构成分、蛋白激酶结合等。Pathway分析主要涉及代谢途径、心肌收缩、抗原处理和呈递、氧化磷酸化、MAPK信号通路、细胞凋亡等途径（图 3D）。
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| A: The top ten biological process categories; B: The top ten cellular component categories; C: The top ten molecular function categories; D: Mapping of precursor proteins to pathways. 图 3 脓毒症小鼠肠道组织差异表达内源性多肽对应前体蛋白的GO和Pathway分析 Fig 3 GO and Pathway analyses of precursor proteins from differentially expressed endogenous peptides in intestinal tissues of mice with sepsis |
差异表达内源性多肽前体蛋白KOG及互作网络分析 使用KOG数据库对鉴定到的差异内源性多肽的前体蛋白进行基于序列相似度的功能分类注释及预测，以柱形图展示鉴定前体蛋白的KOG功能分类情况，主要包括翻译后修饰、蛋白质转换、分子伴侣；翻译、核糖体结构和生物发生；细胞骨架；能量生产和转化；信号转导机制等（图 4A）。提交每组差异蛋白名至STRING官网，经分析得出前体蛋白相互作用网络图（图 4B）。
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| A: KOG analysis; B: Protein interaction network analysis. 图 4 脓毒症小鼠肠道组织差异表达内源性多肽对应前体蛋白的KOG和蛋白互作网络分析 Fig 4 KOG and protein interaction network analysis of precursor proteins from differentially expressed endogenous peptides in intestinal tissues of mice with sepsis |
肠道功能障碍相关的差异表达内源性多肽 基于上述差异内源性多肽及其前体蛋白的生物学功能和特征分析，我们取差异内源性多肽差异的显著性（Significance） > 13，最大比值（Max Ratio） > 14，且结合UniProt数据库分析多肽是否存在前体蛋白功能域，我们预测了15个可能与脓毒症肠道功能障碍相关的内源性多肽（图 5）；并在表 1中列出了多肽的质控评分、信号强度、差异的显著性、最大比值、前体蛋白及位于前体蛋白的功能域位置，提示这些肽可能参与了脓毒症肠道功能障碍的发生和发展。
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| 图 5 脓毒症肠道功能障碍相关的差异表达内源性多肽 Fig 5 Differentially expressed endogenous peptides associated with sepsis-induced intestinal dysfunction |
| Peptide | Quality | Average area | Significance | Max ratio | Accession | Protein | Peptidelocation | PTM/Processing（Position） | Differentially expressed |
| TPEELGLDKV | 4.00 | 1 060 000 | 60 | 64 | P12787 | Cox5a | 137-146 | 137-146 | Down |
| AGDKLVVVDFS | 2.83 | 2 730 000 | 60 | 64 | P10639 | Txn | 18-28 | 18-28 | Down |
| AAGDKLVVVDF | 1.04 | 4 910 000 | 60 | 64 | P10639 | Txn | 17-27 | 17-27 | Down |
| AAAGDKLVVVDF | 4.72 | 6 480 000 | 60 | 64 | P10639 | Txn | 16-27 | 16-27 | Up |
| HLEINPDHPIVETL | 13.92 | 135 000 | 60 | 64 | P11499 | Hsp90ab1 | 625-638 | 625-638 | Up |
| DLINNLGTIAK | 5.06 | 1 770 000 | 60 | 14.35 | P11499 | Hsp90ab1 | 97-107 | 97-107 | Up |
| HLEINPDHPIVET | 0.45 | 489 000 | 60 | 64 | P11499 | Hsp90ab1 | 625-637 | 625-637 | Up |
| KIDIIPNPQER | 0.35 | 884 000 | 60 | 64 | P11499 | Hsp90ab1 | 72-82 | 72-82 | Up |
| KLEVDPNIQAV | 4.31 | 5 200 000 | 60 | 19.51 | P11679 | Krt8 | 83-93 | 83-93 | Up |
| DPSVQQDIKFLP | 3.07 | 433 000 | 60 | 64 | P20029 | Hspa5 | 106-117 | 106-117 | Up |
| NSFTVRNDITLL | 2.98 | 1 610 000 | 60 | 64 | Q9CR35 | Ctrb1 | 113-124 | 113-124 | Up |
| PMFIVNTNVPR | 2.93 | 3 770 000 | 60 | 64 | P34884 | Mif | 02-12 | 02-12 | Up |
| SGAEASFLSSMIK | 1.10 | 930 000 | 60 | 64 | O09049 | Reg3g | 81-93 | 81-93 | Up |
| SLQEIQTPIIK | 0.49 | 2 100 000 | 60 | 64 | Q8R0I0 | Ace2 | 84-94 | 84-94 | Up |
| HIMGQNVADYM | 0.13 | 746 000 | 60 | 64 | P47962 | Rpl5 | 198-208 | 198-208 | Up |
脓毒症发生时，往往伴有肠道黏膜完整性破坏及肠道内菌群失衡，导致肠上皮的多种紊乱，例如上皮细胞凋亡增加、屏障功能障碍和细胞因子产生，进而促进脓毒症的进展[11-12]，因此，肠道功能障碍被认为是脓毒症病情加重的重要驱动力。探索脓毒症肠损伤的病理机制将会极大地促进对脓毒症肠功能障碍机制的理解。
本研究中我们通过质谱检测脓毒症肠道组织内源性多肽，共鉴定到458条多肽序列，110条多肽存在差异表达，其中101条多肽上调，9条多肽下调。一般来说，多肽作为其前体蛋白的水解产物，常保留前体蛋白的部分空间结构及作用位点，能够通过激活或拮抗其前体蛋白的作用靶点发挥与前体蛋白相似或相反的生物功能[13]。因此，我们通过前体蛋白的生物信息学分析以预测差异多肽的功能。GO与Pathway分析显示前体蛋白主要参与调控代谢途径、抗原处理和呈递、氧化磷酸化、MAPK信号通路、细胞凋亡等途径；KOG及蛋白互作网络分析显示：前体蛋白相互作用，形成互作网络，可能通过翻译后修饰、蛋白质转换、分子伴侣；翻译、核糖体结构和生物发生；能量生产和转化；信号转导机制等发挥分子功能。据此，我们推断差异内源性多肽可能通过上述分子功能及生物途径参与脓毒症肠道功能障碍的发生发展。
根据内源性多肽差异显著性，以及是否位于前体蛋白的功能域，我们预测出脓毒症肠道功能障碍相关的15条多肽。我们研究中发现前体蛋白细胞色素c氧化酶亚基5a（Cox5a）参与脓毒症诱导心肌线粒体损伤[14]。推测肠道组织鉴定到的来源Cox5a的肽段TPEELGLDKV可能通过线粒体途径参与脓毒症肠道功能障碍的发生。多肽PMFIVNTNVPR来源巨噬细胞迁移抑制因子（Mif），研究发现Mif参与炎性反应及免疫应答[15]，MIF互变异构酶抑制剂可使得MIF的活性减弱或消失，显著降低炎症因子的释放，提高脓毒症小鼠的存活率[16]。PMFIVNTNVPR处于Mif的质子受体激活位点区域，且位于Mif的功能区域（2-115aa），我们推测该小肽分子可能参与调控炎症反应。SLQEIQTPIIK来源血管紧张素转化酶2（ACE2），ACE2是膳食氨基酸稳态、先天免疫、肠道微生物生态学和结肠炎传染性易感性的关键调节剂[17-18]。因此我们推测SLQEIQTPIIK在脓毒症肠道功能障碍中亦可能扮演重要角色。SGAEASFLSSMIK来源胰岛再生源蛋白3-gamma（Reg3g），Reg3g在肠道炎症疾病中发挥重要作用[19]。SGAEASFLSSMIK定位于Reg3g的81-93aa，属于Reg3g的功能域内（47-171aa），SGAEASFLSSMIK在脓毒症小鼠肠道高表达，推测可能通过调节肠道炎症参与脓毒症肠道功能障碍的发生。
综上所述，本研究首先提供了脓毒症肠道功能障碍相关多肽发生差异表达的概况，通过生物信息学分析，发现了15条显著差异表达的内源性多肽，并分析了其参与脓毒症肠道功能障碍发生发展可能的作用机制，提示这些多肽可能是脓毒症肠道损伤过程中的关键生物活性多肽，为脓毒症肠道功能障碍机制的研究提供了新的方向和打下了重要基础。然而，本研究仍具有一定局限性，需要扩大样本量挖掘更多脓毒症肠道功能障碍相关内源性多肽，进一步实验探索差异内源性多肽在脓毒症肠道功能障碍中的调控作用及机制。
作者贡献声明 陈玉梅 多肽提取，数据分析，论文撰写。杨依霖 构建动物模型，生物信息学分析。杜施霖，宋振举，童朝阳 论文审核和修订。
利益冲突声明 所有作者均声明不存在利益冲突。
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