2022, Vol. 49
2. 复旦大学附属华山医院检验科 上海 200040
2. Department of Clinical Laboratory, Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China
病原菌是各种感染性疾病的病原体之一，临床常见的病原菌有金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、大肠埃希菌、鼠伤寒沙门氏菌等。实验室检测病原菌主要通过两类方法，第一类是传统方法，包括涂片镜检、分离培养、免疫学检测等，第二类是分子检测技术，包括PCR、基因测序、基因芯片、质谱等。传统方法灵敏度低、易漏检，分子检测技术则花费高昂、对操作人员和实验室设备的要求高。因此，急需开发快速、简单、成本低、灵敏度高的检测方法。基于纳米材料构建的适配体传感器具有灵敏度高、特异性好、操作简便、价格低廉等优势，有望替代传统诊断工具检测和量化病原菌。本文介绍了适配体传感器常用的纳米材料的特性和优势，以及基于比色法、荧光法和电化学法构建的适配体传感器检测各种病原菌的研究进展，对于拓展适配体相关的认识有积极意义。
传统生物传感器的识别元件是抗体和酶，由于分子生物学和基因工程的巨大进步，识别元件进一步扩展到核酸分子。1990年Tuerk等[1]发现噬菌体的T4 DNA聚合酶可与两种特定的RNA序列结合，其一是在噬菌体mRNA中发现的野生型序列，这种RNA被定义为噬菌体T4 DNA聚合酶特异的RNA适配体。适配体由单链寡核苷酸（ssDNA或ssRNA）经折叠形成，长度通常为20~60个碱基，可由指数富集的配体系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）选择得到。首先将目标分子与单链寡核苷酸文库孵育，获得适配体-目标分子复合物，分离去除非特异性序列。然后将适配体从复合物中洗脱，使用PCR扩增特定的适配体序列并进入下一轮的筛选，经过几轮选择后适配体与靶标物质的亲和力增强[2]。在筛选针对病原菌的特异性适配体过程中，最常用的筛选方法是全细胞筛选（Cell-SELEX），即靶标物质是整个细菌细胞，筛选得到的适配体可以和病原菌实现特异性结合，在快速检测病原菌方面具有巨大的潜力[3]。适配体具有优异的稳定性，其3D折叠结构可与各种病原菌形成稳定的复合物，相较于抗体更能抵抗酸碱度和温度的变化，即使在热变性和化学变性后仍可恢复到最初的构象。而且SELEX选择的适配体对其靶标物质具有很高的亲和力和特异性，其解离常数低至pmol/L~nmol/L。适配体传感器将适配体作为生物识别元件，结合生物传感技术，对各种病原菌进行选择性和灵敏识别，在临床病原菌的检出等方面具有广阔的应用前景。然而，用于病原菌检测的适配体传感器仍存在核酸适配体与纳米材料结合不稳定、结合效率低以及检测灵敏度不足等问题，而且临床样本中病原菌的浓度较低且菌株复杂，因此增加了临床病原菌检出难度。因此，构建特异性高、敏感性高的适配体传感器是提高临床病原菌检测效能的关键。
纳米材料是生物传感器的重要组成部分，可用于识别元件的固定和检测信号的放大[2]。纳米技术领域的发展促进了各种新型纳米材料的合成，纳米材料显著提高了适配体的载量，从而进一步提高病原菌检测的灵敏度。常用的纳米材料包括金属和金属氧化物纳米粒子、碳纳米材料、二氧化硅纳米粒子和量子点，不同的纳米材料有不同的特性。
适配体传感器中常用的纳米材料
金属和金属氧化物纳米粒子 金属和金属氧化物纳米粒子包括金纳米粒子（gold nanoparticles，AuNPs）、银纳米粒子（silver nanoparticles，AgNPs）、铂纳米粒子（platinum nanoparticles，PtNPs）、氧化铁纳米粒子（iron oxide nanoparticles，IONPs）和钼纳米粒子等，其中AuNPs在适配体传感器中的应用最为广泛，它具有合成方便、高稳定性、形貌可控等优势，为病原菌的检出提供了良好的传感器检测平台[4]。
最新的传感器构建方法将AuNPs与表面增强拉曼光谱（surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）相结合，SERS是一种基于不规则金属表面或拉曼活性纳米结构的光学增强现象，金属纳米材料因其优异的光学、电学和物理化学性质而成为应用最广泛的基底[5]。Zhu等[5]先使用水虎鱼和3-氨丙基-三乙氧基硅烷（3-aminopropyltriethoxysilane，APTES）对聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）膜的表面进行化学修饰，然后用PDMS膜包覆AuNPs，通过Au-S键连接适配体形成捕获底物，同时用巯基苯甲酸修饰的金银核壳纳米花和核酸适配体作为信号探针，形成“捕获底物-靶标-信号分子探针”的三明治结构。这种传感器对金黄色葡萄球菌的检出限（limit of detection，LOD）低至13 CFU/mL。金属纳米材料的加入成功构建了高灵敏度、高特异性的适配体传感器。
碳纳米材料 碳纳米材料已经成为检测细菌的常用传感器材料，可作为荧光淬灭剂用于荧光适配体传感器的制备[6]。碳纳米材料的侧壁和适配体碱基之间的π-π堆积相互作用促使适配体被牢牢吸附在碳纳米材料表面，因此碳纳米材料非常适用于适配体的固定[7]。常用的碳纳米材料包括碳纳米管、氧化石墨烯（graphene oxide，GO）、还原氧化石墨烯（reduced graphene oxide，RGO）、碳纳米线（carbon nanowires，CNWs）等，其中碳纳米管和石墨烯的应用最为广泛。
Shen等[8]合成了光稳定性高、蓝色荧光强、富含π电子的新型碳纳米粒子（carbon nanoparticles，CNPs）作为能量供体，选择近红外荧光羧基涂层量子点（quantum dots，QDs）作为能量受体，适配体和广谱糖肽抗生素万古霉素（vancomycin，Van）的组合可以双重识别金黄色葡萄球菌。QDs和CNPs的结合可以引起荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET），产生强烈的蓝色荧光淬灭，同时近红外荧光增强。在加入金黄色葡萄球菌后，FRET过程被破坏，蓝色荧光增强，近红外荧光减弱，LOD的敏感性高达1.0 CFU/mL。CNPs和QDs构建的荧光传感器对金黄色葡萄球菌有超高的特异性和敏感性，实现了在单细胞水平上筛查致病菌，有利于微量病原菌的检出。
二氧化硅纳米粒子 二氧化硅纳米粒子（silica nanoparticles，SiNPs）可与不同的识别元件形成缀合物，具有高度的生物相容性，被认为是生物医学的优秀候选材料[9-10]。在各种介孔材料中，介孔SiNPs具有高比表面积、易于表面改性、良好的生物相容性等优势，被用于装载各种分子，是一类有前途的多孔材料[11]。蛋白质A是金黄色葡萄球菌的毒力因子，通过将SiNPs制成多孔硅纳米薄膜，可固定适配体来捕获蛋白质A。基于多孔硅的光学性质制成的光学生物传感器，有望实现同时检测多种目标物质[12]。
量子点 QDs也称为半导体纳米晶体，具有光稳定性高、量子产率宽、发射光谱窄等优点，广泛用于细胞成像和分析[13]。QDs在单波长光激发下与适配体形成缀合物，从而实现高效的检测致病菌。Dong等[14]利用硫化镉QDs和三维氧化锌纳米线阵列组合成一种自供电的光电化学电极，对大肠埃希菌O157：H7的LOD低至1.125 CFU/mL，线性范围约10~107 CFU/mL。QDs的毒性作用是其在生物医学应用中的主要障碍，通过调节影响其毒性的因素，QDs的未来发展值得期待。
传感器的制备依赖于目标分子识别和信号转导放大，纳米材料不仅可以用于适配体的固定，还能将分子识别信号转化为可检测的比色、荧光和电化学信号，提供理想的信号转导[15]。下面介绍基于比色法、荧光法和电化学法构建的适配体传感器检测各种病原菌的研究进展（表 1）。
| Detection method for bacteria | Limit of detection | Linear detection range | Sample | Advantage and disadvantage |
| Colorimetric | ||||
| E. coli[17] | 1×102 CFU/mL | 10-1×108 CFU/mL | Complex food samples and microfluidic channel-based devices | This method was simple，fast and can be easily performed without any skilled manpower. However，the applicable sample types are limited and the results are difficult to accurately quantify the number of bacteria. |
| S. typhimurium[18] | 33 CFU/mL | 33-3.3×106 CFU/mL | Pure medium and milk samples | |
| V. parahemolyticus[19] | 10 CFU/mL | 1×102-1×107 CFU/mL | Complex food samples | |
| S. typhimurium[20] | 11 CFU/mL | 11-1.1×105 CFU/mL | Milk samples | |
| FRET | ||||
| P. aeruginosa[28] | 100 CFU/mL | 1.28×103-2.0×107 CFU/mL | Complex food samples | This method comprehended huge advantages including the facile operation procedure，high sensitivity and selectivity，which possesses excellent performance in trace analysis. However，the cost of reagents and instruments is high. |
| V. parahaemolyticus[29] | 25 CFU/mL | 50-1×106 CFU/mL | Complex food samples | |
| S. typhimurium[29] | 35 CFU/mL | |||
| E. coli[31] | 17 CFU/mL | 85-85×107 CFU/mL | Complex food samples | |
| Electrochemical | ||||
| M. tuberculosis antigen MPT64[35] | 10 fg/mL | 20-106 fg/mL | Human serum | This method had eminent performance in the detection of bacteria with wide linear range，great selectivity and a low detection limit. But the stability needs to be further improved. |
| M. tuberculosis secretory protein MPT64[39] | 0.34 fg/mL | 5.0-106 fg/mL | Human serum | |
| Glucose[36] | （0.08±0.02）μmol/L | Small molecules and whole cells | ||
| E. coli O157：H7[36] | 4 CFU/mL |
基于不同检测方法的适配体传感器
比色适配体传感器 比色法由于操作简单、成本低廉、检测信号肉眼可见而被广泛应用。AuNPs是比色分析中最常用的纳米材料，作为纳米组装单元，AuNPs的比表面积大，有助于适配体通过静电作用吸附到表面，避免了相互聚集，使其成为比色适配体传感器的良好信号转换器[16]。
Gupta等[17]构建了一种检测大肠埃希菌的传感器，当适配体与大肠埃希菌结合时，肉眼可见颜色从红色变成蓝色，该传感器的LOD是102/mL。Chen等[18]提出了一种基于链霉亲和素磁珠-双适配体夹心的新型AuNPs比色传感器（图 1），存在鼠伤寒沙门氏菌时复合物呈红色，不存在时则无互补产物与探针杂交，复合物的颜色呈蓝灰色。该传感器的线性范围是33~3.3×106 CFU/mL，在培养基中的LOD是33 CFU/mL。在对实验的阳性结果进行复核时，确定未与死亡的鼠伤寒沙门氏菌和12种非鼠伤寒沙门氏菌发生交叉反应，证明了比色适配体传感器的高度选择性。未来这种比色传感器很有可能应用于血液样品中的鼠伤寒沙门氏菌的现场检测（point of case testing，POCT）。
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| 图 1 基于SMBs-Apt1三明治结构的比色传感器检测鼠伤寒沙门氏菌的示意图 Fig 1 Schematic illustration of proposed SMBs-Apt1 sandwich based colorimetric sensor for the detection of S. typhimurium |
除最常用的AuNPs外，磁性纳米粒子（magnetic nanoparticles，MNPs）、混合纳米共轭系统等也常用于构建比色适配体传感器。Sun等[19]将适配体和MNPs相结合作为捕获探针，G-四链体DNA酶作为信号放大元件，构建了一种检测副溶血弧菌的比色适配体传感器，其线性范围是102~107 CFU/mL，LOD是10 CFU/mL。Wu等[20]基于ZnFe2O4还原氧化石墨烯（ZnFe2O4/RGO）的类过氧化物酶活性检测鼠伤寒沙门氏菌，ZnFe2O4/RGO催化过氧化氢氧化3，3'，5，5'-四甲基联苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）生成蓝色产物，线性范围是11~1.1×105 CFU/mL，LOD是11 CFU/mL。实验样品经平板计数得到的结果与比色适配体传感器的结果一致。虽然比色适配体传感器具有灵敏度高、选择性好的优势，但也有一些局限性，比如样品原有颜色的干扰、制备过程耗时长、不能在临床诊断中实现多靶标分析等[21]。
荧光适配体传感器 荧光适配体传感器的特点是灵敏度高、线性范围宽、检出速度快、可以对多种靶标物质进行选择性识别。常用的荧光材料有上转换纳米粒子（upconversion nanoparticles，UCNPs）、氧化石墨烯、碳量子点（carbon quantum dots，CQDs）等[22-23]。荧光适配体传感器的设计需要用荧光团或淬灭剂分别标记供体或受体，FRET常用荧光团标记供体，用淬灭剂标记受体，选择合适的供体与受体对于提高FRET的效率和传感器的性能至关重要[24]。二维GO是一种良好的荧光淬灭剂，和核苷酸碱基之间存在π-π堆积相互作用，能够很好地吸附ssDNA[25]。与二维GO相比，零维氧化石墨烯量子点（graphene oxide quantum dots，GOQDs）具有独特的优点，如强发光效应、均匀的尺寸分布、优异的生物相容性、低毒性等[26-27]。Gao等[28]设计了一种基于GOQDs检测铜绿假单胞菌的荧光适配体传感器（图 2），不存在铜绿假单胞菌时，5-羧基荧光素（fluorescein amidite，FAM）标记的互补DNA（FAM-cDNA）与适配体的部分序列杂交，FAM的荧光被适配体相连的GOQDs淬灭。存在铜绿假单胞菌时，适配体作为生物识别元件与其结合，FAM-cDNA解除在量子点上的吸附，恢复荧光。该传感器的线性范围是1.28×103~2.0×107 CFU/mL，LOD是100 CFU/mL。
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| 图 2 基于GOQDs的荧光适配体传感器检测铜绿假单胞菌的示意图 Fig 2 Schematic illustration of proposed GOQDs based fluorescent aptasensor for the detection of P. aeruginosa |
Duan等[29]设计了一种同时检测副溶血弧菌和鼠伤寒沙门氏菌的传感器，他们将绿色发光量子点（green-emitting quantum-dots，gQDs）和红色发光量子点（red-emitting quantum-dots，rQDs）作为供体进行双荧光共振能量转移，将新型无定型碳纳米粒子作为受体。副溶血弧菌的适配体修饰gQDs，鼠伤寒沙门氏菌的适配体修饰rQDs，在碳纳米材料的作用下，两种量子点的荧光都被强烈淬灭。当加入两种靶标物质形成量子点-适配体-靶标物质复合物后，抑制量子点的荧光淬灭，荧光重新出现。该传感器的线性范围是50~1×106 CFU/mL，副溶血弧菌的LOD是25 CFU/mL，鼠伤寒沙门氏菌的LOD是35 CFU/mL。
与传统荧光材料相比，稀土元素掺杂的UCNPs（rare-earth doped UCNPs，RE-UCNPs）作为新一代荧光材料，具有量子产率高、发射峰窄、光稳定性强、荧光寿命长、毒性低、耐光漂白性能好等优势[30]。RE-UCNPs可以通过双光子或多光子机制将长波长的低能光转化为短波长的高能光，从而使发光效率大大增强。Wang等[31]使用适配体修饰的UCNPs作为供体，层状二硫化钨（layered tungsten disulfide，WS2）纳米片作为受体构建检测大肠埃希菌的荧光适配体传感器。由于适配体碱基和WS2之间的范德华力作用，UCNPs接近WS2的表面，UCNPs荧光发射和WS2吸收光谱重叠导致UCNPs的荧光淬灭。大肠埃希菌存在时，特异性适配体优先结合大肠埃希菌，从而引起适配体构象变化并从WS2纳米片表面解离，因此UCNPs的淬灭荧光部分恢复，荧光强度随着大肠埃希菌浓度的增加而增加。该荧光适配体传感器的线性范围是85~85×107 CFU/mL，LOD为17 CFU/mL。
电化学适配体传感器 电化学适配体传感器中，适配体可以通过π-π相互作用、水凝胶移植、生物素-亲和素相互作用、硫醇-金自组装和羧基-胺共价反应固定在电极表面。电化学传感器依赖于传感器表面发生的相互作用，主要是适配体与靶标物质之间发生反应导致电流或电位发生变化，另一种相互作用是基于阻抗技术增加电荷转移电阻[32]。适配体与靶标物质之间的亲和力可通过差分脉冲伏安法（differential pulse voltammetry，DPV）、电化学阻抗法（electrochemical impedance spectroscopy，EIS）、方波伏安法（square wave voltammetry，SWV）和循环伏安法（cyclic voltammetry，CV）等转化为可测量的电化学信号。
电化学传感器的合成可以选用各种纳米材料，如碳基纳米材料、金属有机框架（metal-organic frameworks，MOFs）、AuNPs和用于信号放大的聚合物等[33]。MOFs作为一种新型的杂化多孔材料，由有机接头和金属离子组成，通过配位键连接形成网状晶体结构，具有比表面积大、金属位点明确等优势[34]。辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶和碱性磷酸酶，以及电活性化合物如量子点、二茂铁、亚铁氰化物、亚甲蓝和镉纳米粒子等都被成功地结合到电化学适配体传感器中，用作信号增强剂[35-38]。
Li等[35]构建了一种用伏安法测定人血清中结核分枝杆菌抗原MPT64的超灵敏适配体传感器（图 3），MOFs材料作为核酸适配体和AuNPs的载体，加上辣根过氧化物酶制成信号纳米探针。对结合靶标物质MPT64具有协同作用的两种适配体修饰在金电极表面，DPV显示当两种适配体的比例是1:1时，峰值电流最高，线性范围是20~1×106 fg/mL，LOD为10 fg/mL。同样是检测结核分枝杆菌抗原MPT64，Gou等[39]选择GO@Fe3O4@Pt混合纳米材料，这种材料具有优异的类过氧化物酶活性和可回收性。由于GO可以通过π-π堆积相互作用强烈吸附ssDNA，因此滚环扩增（rolling circle amplification，RCA）技术的产物ssDNA可以被GO@Fe3O4@Pt混合纳米材料强力吸附，从而有效放大检测信号，其线性范围是5~1×106 fg/mL，LOD为0.34 fg/mL。
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| 图 3 基于双适配体的循环伏安传感器检测结核分枝杆菌抗原MPT64的示意图 Fig 3 Schematic illustration of proposed dual-aptamer-based voltammetric biosensor for the detection of M. tuberculosis antigen MPT64 |
近年来基于导电纳米碳的纸基电化学传感导电纸是研究热点，主要集中在石墨烯和还原氧化石墨烯作为导电骨架[40-41]。许多研究表明，包含纳米碳和纳米金属的混合纳米结构是电化学适配体传感器的最有效平台之一。研究者们致力于将纳米金属沉积到导电碳上合成纳米金属分形结构，以制备高性能的传感器。在用于制造分形结构的各种纳米金属中，纳米铂（platinum nanoparticles，nPt）拥有良好的生物相容性、易于修饰、耐腐蚀、稳定性好，因此广泛用于生物传感器的制备。Burrs等[36]构建了一种分形铂纳米-功能化石墨烯-纳米纤维素纸的传感器来检测葡萄糖和大肠埃希菌O157：H7。石墨烯-纳米纤维素纸先通过两种热处理被部分还原，然后通过抗坏血酸处理被进一步还原，生成抗坏血酸还原石墨烯纸（ascorbic acid reduced graphene paper，AARG）。接着使用脉冲声电沉积方法将金属铂沉积于石墨烯-纳米纤维素纸上，形成具有花椰菜状形态的分形纳米片，这是一种具有极高电活性表面积的导电纸。铂表面用葡萄糖氧化酶（通过壳聚糖水凝胶包裹）或核酸适配体（通过共价连接）进行功能化，这种定点生物传感器的葡萄糖LOD为（0.08±0.02）μmol/L，响应时间是6 s，大肠埃希菌LOD为4 CFU/mL，响应时间是12 min，相较于之前报道的传感器灵敏度更高。纳米纤维素-石墨烯-纳米铂材料是一种优秀的纸基平台，可用于开发针对小分子或全细胞的电化学适配体传感器。
结语 每种适配体传感器都有优点和不足：核酸适配体和纳米材料的优势相结合，为病原菌的生物识别和信号转导提供了极具潜力的平台；与比色法相比，荧光适配体传感器可以实现对多种靶标物质的同时检测，但要求实验室和临床中心具备实现POCT诊断的基础设施，并且荧光强度随时间衰减；与荧光适配体传感器相比，电化学适配体传感器快速、简单、灵敏度高，是生物标志物实现快速检测的最佳选择。
基于适配体功能化的生物标志物检测仍需克服许多困难，以便用于金属离子、DNA、蛋白质、病原菌的检测。同时，需要开发更具特异性的适配体，以便整合到传感器平台中。未来传感器的构建需要关注：（1）多靶标物质的同时检测；（2）生物传感器的长期稳定性；（3）真实样品基质的直接测定；（4）适配体和纳米材料对靶标物质的竞争性结合，这可能影响传感器的可靠性；（5）体内适配体传感技术的未来发展、可能出现的问题及解决方案；（6）研究适配体传感器应用于生物标志物的现场检测。
适配体传感器不但可用于病原微生物、肿瘤标志物、生物小分子、细胞因子等生物分子的检出，而且已被广泛应用于体外生物分析、疾病诊断、靶向治疗、药物筛选等医学领域。
作者贡献声明 王张敏 论文构思和撰写，文献整理，数据分析，制图。张泽，张颖聪 论文修订。于洪伟，高宏民 数据整理。常东 综述构思、指导和修订。
利益冲突声明 所有作者均声明不存在利益冲突。
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