2022, Vol. 49
2. 上海市浦东医院-复旦大学附属浦东医院血管外科 上海 201399;
3. 上海市血管病变调控与重塑重点实验室 上海 201399;
4. 复旦大学附属华山医院血管外科 上海 200040
2. Department of Vascular Surgery, Shanghai Pudong Hospital-Fudan University Pudong Medical Center, Shanghai 201399, China;
3. Shanghai Key Laboratory of Vascular Lesions Regulation and Remodeling, Shanghai 201399, China;
4. Department of Vascular Surgery, Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China
结肠癌是严重威胁人类生命健康的疾病。根据2020年数据显示，全球范围内约有110万人被诊断为结肠癌，是第四大常见肿瘤，全年约57万人因其死亡[1]。中晚期结肠癌的治疗方式包括手术、放疗、化疗、靶向治疗在内的综合治疗。但是，因早期结肠肿瘤状不明显，发现困难，我国大部分结肠癌患者初诊时已经处于中晚期。外科手术和放化疗等治疗方式尽管能在一定程度上消灭肿瘤、遏制进展，但是肿瘤的复发和转移率仍然很高，是结肠癌治疗的难点[2]。因此，阐明结肠癌发生、发展的分子机制，筛选出与结肠癌侵袭转移相关的指标用于指导临床治疗和预测疾病预后，对结肠癌诊治意义重大。
CST6基因位于染色体11q13[3]，其所编码的蛋白是半胱氨酸蛋白酶抑制因子Cystatin 6（CST6）（又名cystatin M/E）[4]，属于半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族（Cystatins）成员。研究表明表明CST6编码的蛋白cystatin M/E在多种肿瘤进展中具有不同的功能效应[5]。在黑色素瘤、宫颈癌、脑癌、前列腺癌、胃癌和肾癌中产生抑癌作用，因此被认为是具有预后意义的生物标志物。同时，在口腔癌[6]、胰腺癌[7]、甲状腺癌[8]和肝癌[9]中，发现CST6具有肿瘤促进作用。但是CST6在结肠癌中的表达及其与结肠癌患者的预后关系尚不清楚。
本研究利用肿瘤基因组图谱数据库（The Cancer Genome Altas，TCGA），分析CST6在正常结肠上皮和结肠癌中的表达差异，并探讨其表达高低与结肠预后的关系。同时，采用基因富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA），探究CST6在肠癌中可能影响的信号通路及相关分子，并进一步在临床结肠癌样本中通过免疫组化方法进行验证。旨在探索CST6在结肠癌中的作用及作为结肠癌预后的新型标记物的可能性。
资料和方法公共数据获取与差异分析 可开放获取的结肠癌患者数据从TCGA中下载，包括41个正常样本473个肿瘤样本的转录谱及临床数据。TCGA数据库是由美国国家肿瘤研究所（National Cancer Institute，NCI）和国家人类基因组研究所（National Human Genome Research Institute，NHGRI）合作建立的肿瘤研究项目，通过收集整理肿瘤相关的各种组学数据，提供了一个大型的免费的肿瘤研究参考数据库。在TCGA数据库中下载FPKM格式转录谱数据并使用perl语言整理成表达矩阵。使用参考基因组文件GRCh38.gtf进行探针注释。使用limma进行数据标准化。患者临床数据通过TCGA-GDC下载xml格式数据后使用perl语言整理，包括患者的预后信息、年龄、临床分期等。KM曲线生存分析使用R语言的Survival包进行。
基因集富集分析 GSEA是由Broad Institute研究所提出的一种富集方法。其不需要指定明确的差异基因阈值，根据实际数据的整体趋势，在表达谱的整体层次上对不同分组的生物学通路进行富集。基于Hallmark癌通路基因集合，对高CST6和低CST6样本的表达谱进行了GSEA通路富集。
组织样本 回顾性收集复旦大学附属浦东医院2021年1—12月的结肠癌组织手术标本45例，患者术前均未接受过化疗或放疗。组织标本均为我院病理科提供的石蜡标本，且均由病理科医师做出诊断。研究获得复旦大学附属浦东医院伦理委员会批准（伦理批号：2020WZ-018）。所有患者均在术前签署知情同意书，同意将个人的临床、病理资料和手术标本用于科学研究。
免疫组织化学染色 将组织芯片置于二甲苯中脱蜡，并经无水乙醇、85%和75%乙醇梯度水化。组织切片放入柠檬酸抗原修复缓冲液（pH=6.0）中煮沸，进行抗原修复。之后放入3%双氧水溶液阻断内源性过氧化物酶，再以3% BSA行血清封闭。CST6一抗（美国Proteintech公司，17076-1-AP，浓度1∶100）、PDGFR一抗（美国Abcam公司，ab32570，浓度1∶400）及E-Cadhein一抗（美国CST公司，3195，浓度1∶400）4 ℃孵育过夜。再滴加适量辣根过氧化物酶标二抗聚合物，室温孵育50 min。后DAB显色、苏木精复染、脱水封片。利用自动扫描显微镜和图像采集分析系统拍摄免疫组化染色照片。读片由病理科医师独立完成，读片前后均不告知患者的任何信息，读片标准为：（1）目的蛋白染色阳性定义为≥5%肿瘤细胞的胞质内可见棕褐色染色；（2）染色强度评分计0~3分，0分为阴性，1分为弱阳性，2分为中度阳性，3分为强阳性；（3）染色范围评分计0~4分，0分为 < 5%，1分为5%~24%，2分为25%~49%，3分为50%~74%，4分为75%~100%。最后综合表达评分（composite expression score，CES）为染色强度评分×染色范围评分。
统计学分析 所有的统计分析均在R语言、SPSS 19.0和GraphPad Prism 8中完成。符合正态分布的数据使用Student’s t检验比较差异。非正态分布的数据使用Wilcoxon秩和检验。两连续性变量相关性使用Pearson检验计算相关系数。双侧P < 0.05为差异有统计学意义。
结果CST6在结肠癌中的表达 首先在结肠癌患者癌组织和正常结肠上皮组织中探究CST的表达情况。选取TCGA数据库中包括41个正常和473个肿瘤样本的转录谱及临床数据进行研究，我们发现CST6在结肠癌组织中的表达显著高于正常结肠上皮组织（图 1A）。进一步对比CST6在转移性结肠癌和无转移结肠癌的表达情况，选取的数据集包含了61例明确存在转移的结肠癌和330例明确无转移结肠癌患者的表达数据，结果表明CST6在转移性结肠癌组织中的表达显著高于无转移结肠癌组织，提示结肠癌中CST6可能作为一种癌基因影响着结肠癌的发生发展（图 1B）。
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| A: The expression of CST6 in colon cancer tissues and colonic epithelium; B: The expression of CST6 in colon cancer tissues and metastatic colon cancer tissues.(1)P < 0.000 1, (2)P < 0.001. 图 1 CST6在TCGA数据库结肠癌样本中的表达 Fig 1 The expression of CST6 in colon cancer samples of TCGA |
CST6表达与结肠癌预后的关系 为进一步明确CST6在结肠癌中的作用，我们对CST6不同表达的结肠癌患者进行了生存分析，包括总生存（overall survival，OS）、疾病特异性生存（disease specific survival，DSS）以及无进展生存（progress free survival，PFS）。结果表明，相比较于CST6低表达水平的患者，CST6高表达的患者具有更差的DSS（HR=1.63；95%CI：1.02~2.70；P=0.043；最高229例，最低228例）。然而，结肠癌组织中CST6的高表达并未能显著影响OS及PFS（P > 0.05，图 2A~C）。上述结果表明，CST6能够影响结肠癌的转移过程。
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| A: OS were not significantly different between patients with low CST6 expression and high CST6 expression.B-C: Increased expression of CST6 was associated with poor DSS(B) and PFS (C). 图 2 TCGA数据库样本中CST6表达高低与结肠癌患者OS、DSS和PFS的关系 Fig 2 The association of CST6 expression with the survival of patients with colon cancer in TCGA samples |
CST6相关信号通路分析 为探究CST6在结肠癌中的作用机制，我们进而对CST6不同表达的结肠癌患者进行了基于Hallmark基因集的GSEA分析，结果表明，CST6影响的通路主要富集在结肠癌血管生成和上皮间质细胞转化信号通路（图 3）。这两个通路在促进结肠癌转移方面发挥着重要作用。分子相关性结果表明CST6和调控血管生成的关键分子血小板衍生生长因子受体（platelet-derived growth factor receptor，PDGFR）存在显著正相关（图 4A），而与VEFGR无显著相关性（图 4B），提示CST6可能参与调控PDGFR的表达，进而影响血管生成过程促进结肠癌转移。对于上皮-间质细胞转化信号通路，我们发现，结肠癌组织中CST6与上皮标志物E-Cadherin无显著相关性（图 4C），但与间质标志物N-Cadherin及Vimentin表达呈现显著的正相关（图 4D、E），提示CST6可能参与调N-Cadherin及Vimentin的表达，进而影响上皮-间质细胞转化信号促进结肠癌转移。
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| GSEA indicated that the genes involved in angiogenesis (A) and epithelial-to-mesenchymal transition (B) were strongly enriched in colon cancer tissues with relatively high expression of CST6. 图 3 GSEA分析CST6低表达和CST6高表达的结肠癌组织间基因富集差异 Fig 3 GSEA between cancers with high CST6 expression and cancers with low CST6 expression |
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| A: CST6 expression was positively correlated with PDGFR level; B: Expression was not significantly different between CST6 and PDGFR; C: Expression was not significantly different between CST6 and E-Cadherin; D: CST6 expression was positively correlated with N-Cadherin level; E: CST6 expression was positively correlated with Vimentin level. 图 4 数据库分析结肠癌中CST6与血管生成分子及上皮-间质标志物表达的相关性 Fig 4 Database analysis of the correlation between CST6 and the expression of angiogenesis-related factors and epithelial-mesenchymal transition markers in colon cancer |
CST6相关信号分子验证 为进一步在人肠癌组织中验证CST6的表达，及其与PDGFR和N-Cadherin表达的相关性，我们取45例本院结肠癌患者临床样本进行免疫组化检测及定量分析。结果表明，CST6在结肠癌组织中表达显著升高，高于配对癌旁组织（P < 0.05，图 5A、B），与图 1中的TCGA数据库结论一致。结肠癌组织中CST6、PDGFR、N-Cadherin均呈现较高表达（图 5A）；采用Spearman相关性分析显示，CST6表达与PDGFR表达呈现显著的正相关性（r=0.604 1，P < 0.001，图 5C），同时CST6表达与N-Cadherin表达也呈正相关（r=0.629 8，P < 0.001，图 5D），进一步证实了上述数据库生信分析的结论。
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| A: The representative immunohistochemical images of CST6, PDGFR, N-Cadherin and negative control (IgG) in 45 cases of human colon cancer tumor tissues and paired non-tumorous tissues.Scale bar=50 μm.B: The scores of IHC staining of CST6 in 45 cases of colon cancer.C: The Spearman correlation analysis of CST6 expression with PDGFR level.D: The Spearman correlation analysis of CST6 expression with N-Cadherin level. 图 5 临床肠癌组织样本中验证CST6的表达及其与和PDGFR和N-Cadherin表达的相关性 Fig 5 The validation of CST6 expression and its correlation with PDGFR and N-Cadherin level in clinical colon cancer tissue samples |
本研究利用TCGA数据库，并结合GSEA分析发现CST6在结肠癌组织中的表达明显高于正常结肠上皮；与CST6低表达的结肠癌患者相比，CST6高表达的结肠癌患者预后较差，更容易发生转移；CST6在结肠癌组织中的高表达与血管生成及EMT信号通路显著相关；CST6和血管生成相关信号分子PDGFR及间质标志物N-Cadherin的表达呈现显著的正相关性，可能通过PDGFR调控肿瘤的血管生成及上皮-间质转化过程，进而影响肠癌侵袭转移。
CST6基因首先是从转移性乳腺癌细胞中分离出来的，人类的完整序列CST6基因最早由Zeuween等[10]鉴定出来。CST6可能参与多种分子机制，对不同类型的肿瘤有不同的作用机制。对乳腺癌的研究发现浸润性导管癌中CST6表达的cystatin M/E蛋白水平表达降低或缺失明显，正常乳腺上皮细胞中主要定位于细胞质的cystatin M/E，在浸润性导管癌组织中几乎无阳性着色；并且cystatin M/E可显著抑制乳腺癌细胞的侵袭及转移能力[11]。CST6在嗜骨乳腺癌细胞和肿瘤样本中下调。功能分析证实CST6在肿瘤侵袭和乳腺骨转移中具有抑制作用[12]。CST6在非小细胞肺癌中表达降低，而高表达CST6可以抑制非小细胞肺癌细胞在体外培养中的生长[13]。在原发性宫颈肿瘤中存在CST6失活导致的cystatin M/E表达缺失，提示CST6是一种宫颈癌抑制因子[14]。可能与NF-κB信号通路调控及其核表达有关[15]。脑恶性胶质瘤中启动子甲基化完全阻碍了胶质瘤起始细胞CST6的表达，而cystatin M/E的异常高表达降低了起始细胞CST6的能动性和侵袭性[16]。前列腺癌中，启动子组蛋白修饰导致CST6下调，参与了前列腺癌浸润和转移期的进展[17]。对胃癌及其相邻非肿瘤组织中CST6甲基化状态的分析显示，由于启动子高甲基化，胃癌中CST6表达缺失。此外，CST6高甲基化患者的生存时间明显短于启动子低甲基化患者[18]。
除了其传统的抑瘤作用外，CST6也可能起到抑瘤作用肿瘤促进效应。在三阴性乳腺癌中，CST6表达升高，且与高淋巴结转移风险和低无病生存率相关，提示其可能是肿瘤促进分子[19]。对来自口咽鳞状细胞癌原发灶和转移灶的细胞株的分析表明，CST6在转移灶中的表达比原发灶高40倍。CST6的上调可能通过阻断固有的组织蛋白酶B的活性，从TNF-α诱导的凋亡中拯救肿瘤细胞而促进转移[20]。在胰腺导管腺癌中，CST6可能通过抑制细胞内促凋亡的组织蛋白酶B参与胰腺癌的增殖和生存，并可能是胰腺肿瘤的启动子[21]。甲状腺乳头状癌中，CST6可能位于BRAF/MEK细胞外信号调节激酶信号通路的下游[22]。此外，CST6也与淋巴结转移相关。生存分析显示，CST6可以作为乙型肝炎病毒相关肝癌患者的预后标志物，CST6的高表达与患者的低生存率相关[23]。
我们的研究证实了CST6在结肠癌组织中呈高表达，高表达CST6的结肠癌患者预后差，提示其可能在结肠癌中发挥促癌基因的作用，并可能成为预测结肠癌患者预后的潜在分子标记物。在上述研究基础上，我们还探索了与CST6表达相关的潜在信号通路。发现CST6高表达的结肠癌患者中，EMT和血管生成通路被显著激活；结肠癌组织中CST6和PDGFR及N-Cadherin表达呈现显著的正相关性。
既往文献已经证实，结肠癌的发生发展与EMT和肿瘤血管生成密切相关。Yi等[24]综合多组学分析发现，RUNX2通过与EMT相关的启动子和/或潜在的增强子结合可以促进结肠癌的EMT效应，从而促进肿瘤转移、干细胞化和治疗抗性。研究发现，在结直肠癌中，WNT2在肿瘤相关成纤维细胞中选择性升高，并通过调控促血管生成功能相关蛋白的升高，促进血管生成信号，从而促进肿瘤的进展[25]。Xu等[26]研究了CST6在多种肿瘤类型中的表达模式，发现CST6表达与上皮细胞浸润参与EMT和增殖呈正相关。这与我们的研究结果相符。但是，探究结肠癌中CST6与血管生成的相关性，却未见报道。
PDGFR是PDGFs/PDGFRs信号转导途径中的重要成员，为一种单链跨膜糖蛋白，属于Ⅲ型酪氨酸蛋白激酶家族，分布于人体组织，如平滑肌细胞SMC、成纤维细胞、内皮细胞、神经胶质细胞核软骨细胞等。研究表明，在结肠癌发展中，PDGFs/PDGFRs能促进肿瘤血管生成，促进肿瘤的进展[27]。我们发现，结肠癌组织中CST6与PDGFR呈现正相关，但是，CST6是否可以通过影响PDGFs/PDGFRs通路调控结肠癌的恶性进展，有待分子生物学实验进一步证实，这是本研究不足之处。此外，对于CST6在结肠癌预后中的作用，本研究目前仅通过TCGA数据库的样本进行研究，未进一步在本院临床样本中进行生存分析的研究及验证，也是今后需要完善的内容。
本研究证实CST6是预测结肠癌预后的一个潜在分子标记物。未来可在细胞水平和动物实验中进一步探索CST6的结肠癌发生发展中的功能和潜在分子机制。
作者贡献声明 吴德俊 数据采集，论文撰写和修订。徐安军 数据统计和分析。余波 论文构思和修订论文。
利益冲突声明 所有作者均声明不存在利益冲突。
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