鼻腔鼻窦黏膜黑色素瘤(sinonasal mucosal melanoma，SNM)是一种非常少见的神经外胚层来源的肿瘤，在鼻腔鼻窦恶性肿瘤中的占比不到10%^[1]。由于解剖部位隐匿，且以鼻塞和鼻出血等非特异性症状为主，SNM患者确诊时多在晚期，5年生存率为20%~40%^[2]，并且约有半数的病例病情复发^[3-4]。完整的手术切除仍是最佳治疗方式，近几年靶向治疗和免疫治疗取得一定的效果，然而获得性耐药不可避免地发生，一部分患者仍然忍受着肿瘤进展所带来的痛苦和生命威胁，因此寻找新的治疗靶点和预后判断指标仍是非常必要的。

β-连环蛋白(β-catenin)是WNT/β-catenin信号通路的核心成分，已在骨肉瘤、乳腺癌等多种肿瘤中证实该通路的异常激活促进了肿瘤的发生发展^[5]。C-MYC是β-catenin的下游靶基因^[6]，研究表明，皮肤黑色素瘤中c-myc蛋白的过表达可促进血管生成拟态和线性程序性坏死，加速肿瘤细胞转移^[7]，然而在黏膜黑色素瘤中c-myc的表达是否与预后相关仍未可知。p16蛋白由CDKN2A基因编码，作为细胞周期通路的负调控子使细胞周期停滞，抑制细胞增殖，其表达缺失通常被认为具有促进肿瘤形成与发展的作用，但在神经母细胞瘤、卵巢癌、前列腺癌等肿瘤中p16过表达却与不良预后相关^[8]。有研究^[9]发现活化的β-catenin可以抑制p16的表达，但在人类二倍体成纤维细胞中过表达的c-myc可诱导p16的表达^[10]。目前关于β-catenin、c-myc表达临床意义的研究主要集中在皮肤黑色素瘤，在SNM的表达情况及临床意义尚不明确，同时在SNM中β-catenin、c-myc与p16的表达是否具有相关性仍需探讨。本研究旨在探讨β-catenin、c-myc和p16蛋白在SNM中的表达情况、临床意义以及三者间的相关性，以期对SNM可能的病因机制以及预后判断提供参考，并通过回顾相关文献探讨c-myc作为治疗靶向位点的前景。

资料和方法

研究对象  收集复旦大学附属眼耳鼻喉科医院病理科2006年1—12月间确诊的具有完整资料的原发性SNM石蜡组织标本85例。所有患者均未接受放化疗和分子靶向治疗。同时收集患者年龄、性别、原发部位、淋巴结转移情况等临床病理资料。

随访  患者的随访资料通过电话咨询获取，总生存期(overall survival，OS)的计算从患者首诊日至死亡日或随访终止，无病生存期(disease-free survival，DFS)的计算从患者手术日至出现复发、转移、患者死亡或随访终止。随访至2020年10月31日，最短随访时间2个月，最长99个月，中位随访时间30个月。经本院伦理委员会批准，免除患者知情同意。

免疫组化  组织经3.7%中性甲醛液固定，石蜡包埋，以3 μm厚度进行连续切片，常规脱蜡。用BenchMark Ultra罗氏免疫组织化学仪进行染色，采用Multimer法进行检测。所有抗体包括兔抗人β-catenin单克隆抗体(克隆号E247，上海基因科技公司，稀释度1∶100)、兔抗人c-myc多克隆抗体(克隆号EP121，福州迈新生物技术公司，稀释度1∶100)、鼠抗人p16单克隆抗体(克隆号MX007，福州迈新生物技术公司，稀释度1∶100)。所有指标同时设置阳性、阴性对照组织。β-catenin、c-myc、p16均使用二氨基联苯胺(DAB)对比显色，部分样本由于黑色素过多干扰染色结果的判定而采用Red对比显色。

染色结果判定  由两位资深的病理医师在光学显微镜下分别评估各免疫组织化学指标的染色强度和范围后取中值应用于以下判定方法。β-catenin、c-myc表达情况判定方法^[11]：分别对染色强度和染色范围进行评分，染色强度评分为：0(未染色)；1(弱)；2(中等)；3(强)；阳性细胞范围评分为：1(< 10%)；2(11%~50%)；3(51%~75%)和4(> 75%)。按染色强度×阳性细胞范围评分，分数≥4计为阳性。参考相关文献^[12-13]，p16染色结果判读：将染色范围 < 20%计为阴性，20%≤染色范围≤70%计为弱阳性，染色范围 > 70%计为强阳性。

统计学分析  计量资料采用x±s表示，所有数据采用SPSS 26.0统计学软件进行分析，显著水平设定为P < 0.05。分类变量间的相关性分析采用χ²检验、Pearson检验，二分类观察结果的分析采用Logistic回归模型，生存分析采用多因素Cox回归分析和Kaplan-Meier生存曲线法。

结果

一般情况  男性41例，女性44例，年龄26~86岁，中位年龄62岁，平均年龄61.8岁。临床主要症状为鼻塞、鼻出血。原发部位为鼻腔的39例(45.9%)、鼻窦的9例(10.6%)，同时累及鼻腔和鼻窦的37例(43.5%)。依据AJCC的TNM分期^[14]，Ⅲ、ⅣA、ⅣB、ⅣC期患者分别占35.3%(30/85)、47.0%(40/85)、15.3%(13/85)和2.4%(2/85)。85例患者中发生淋巴结转移的有54例，占63.5%。85例SNM患者中单纯接受手术治疗的有35例(41.2%)，术后联合放疗的有21例(24.7%)，术后联合化疗的有6例(7.0%)，术后联合放化疗的有23例(27.1%)。

SNM中β-catenin、c-myc和p16的表达情况  β-catenin染色主要定位于肿瘤细胞胞膜和/或胞浆(图 1A)，个别病例可见细胞核染色(图 1B)。β-catenin的阳性率为77.6%(66/85)，其中3例(4.5%，3/66)出现胞核定位。c-myc染色定位于肿瘤细胞胞核(图 1C)，c-myc的阳性率为68.2%(58/85)。p16染色定位于肿瘤细胞胞核和/或细胞质(图 1D)，p16的阳性率为64.7%(55/85)，强阳性占49.4%(42/85)，弱阳性占15.3%(13/85)，阴性率为(视为表达缺失)35.3%(30/85)。对比p16在黏膜内痣的表达为不规则或局灶染色，我们研究中的强阳性病例均表现为弥漫性强细胞核和细胞质染色。

SNM中β-catenin、c-myc和p16的表达与临床病理学特征的关系  统计分析显示β-catenin和p16阳性与肿瘤淋巴结转移相关(P=0.028，P=0.001)，与患者年龄、性别、肿瘤部位、临床分期等其他临床病理学指标无相关性。c-myc阳性组的女性患者多于男性患者(P=0.014)，淋巴结转移率高于低表达组(P=0.003)，c-myc的表达与年龄、肿瘤原发灶累及部位、TNM分期无明显相关性。详见表 1。

SNM中β-catenin、c-myc和p16的表达与生存预后的关系  β-catenin阳性组的中位OS和中位DFS分别为28个月和16个月，3年、5年生存率为37.9%和19.7%，生存分析显示β-catenin表达与生存率未见明显相关性(P=0.367，图 2A)，但在β-catenin阳性组中β-catenin胞核表达患者的5年生存率要显著低于β-catenin胞浆胞膜表达的患者(P=0.007，图 2B)。c-myc阳性组的中位OS和中位DFS分别为27个月和12个月，均低于c-myc阴性组，差异有统计学意义(P均 < 0.05)。c-myc阳性组的3年和5年生存率分别为26.9%和15.4%，低于c-myc阴性组的54.5%和33.3%(P=0.047，P=0.015；图 2C)。p16强阳性组的中位OS和中位DFS分别为24.5个月和11个月，3年、5年生存率为23.8%和9.5%，显著高于阴性组和弱阳性组(P=0.024、0.006，图 2D)。p16阴性组与弱阳性组的生存率有差异，但无统计学意义。

β-catenin、c-myc、p16三者表达的相关关系  β-catenin的表达与c-myc的表达呈正相关(r=0.234，P=0.027，表 2)。p16的表达与β-catenin、c-myc的表达差异均无统计学意义(P=0.211、0.091)。

讨论

SNM占所有黏膜黑色素瘤(mucosal melanoma，MM)的31%~55%^[15-16]。已知皮肤恶性黑色素瘤(以下简称“皮肤恶黑”)和紫外线暴露的强度相关，而黏膜恶黑相关的环境危险因素尚不明确^[17-18]。国内关于β-catenin、c-myc、p16的临床病理相关性报道主要聚焦于皮肤恶黑，在SNM中有待进一步研究。我们通过对β-catenin、c-myc、p16在85例SNM表达情况分析，探讨其与临床病理的相关性以及可能的预后意义，并通过回顾相关文献简要讨论c-myc作为SNM的靶向治疗位点的可能。

在我们的研究中，β-catenin在66例(77.6%)SNM患者中表达，这与Xu等^[11]在肢端黑色素瘤中检出率(72%)相近^[11]。我们还观察到β-catenin的阳性表达与患者的生存率无统计学相关(P=0.367，图 2A)，但与肿瘤淋巴结转移呈正相关(P=0.028)。在肢端黑色素瘤观察到β-catenin的阳性表达与生存率降低和预后不良相关^[11]。由于β-catenin的胞核表达通常被认为与WNT通路的激活有关^[9]，因此我们在阳性组分别统计了β-catenin不同定位下的表达情况，并利用Kaplan-Meier生存曲线法进一步对β-catenin胞核表达和β-catenin胞膜及胞浆表达的生存率进行比较，发现β-catenin胞核表达的生存率要显著低于胞膜和胞浆表达组(P=0.007，图 2B)，然而在皮肤恶黑中，Chien等^[19]发现β-catenin胞核表达水平的增高与生存率提高有关。这种差异是发病部位使然还是因样本量小所致，尚需要收集样本进一步探讨。

早在2001年就有研究发现在晚期和转移性皮肤恶黑中出现c-myc扩增^[20]，Lin等^[21]发现c-myc过表达导致黑色素瘤细胞的侵袭转移能力显著增强并与不良预后相关。在我们的研究中c-myc均表达于细胞核，呈阳性或强阳性染色。c-myc阳性组的患者生存率低于c-myc阴性组(P值均 < 0.05)，且阳性组的无病生存期较阴性组显著缩短，肿瘤的淋巴转移率显著增加，与既往研究结果相符^{[7, 21]}，提示c-myc表达可以作为预测SNM预后和转移的生物学指标。鉴于之前提到c-myc是β-catenin的下游分子，我们进一步分析了两者的相关性，发现c-myc的表达与β-catenin的表达的确呈正相关(P=0.027)，这意味着在SNM中c-myc的过表达可能是通过β-catenin调节，当然这仍需进一步的研究证明。

一项对p16免疫组化在黑色素细胞病变应用的Meta分析^[22]显示原发性皮肤浸润性黑色素瘤中p16免疫组化阳性病例为12%~93%，本研究中p16的表达的阳性率为64.7%，表达缺失(阴性)率为35.3%，且p16阳性组患者肿瘤的淋巴结转移率更高(P=0.001)。p16在肿瘤中的表达受肿瘤类型、遗传异常、癌基因激活和相关肿瘤抑制因子变化等诸多因素的影响。在皮肤黑色素瘤中p16表达缺失被视为预后不良的标志物^[22]，然而我们的研究中p16强阳性患者的5年生存率高于弱阳性组和阴性组(P=0.024和0.006，图 2D)，这与皮肤黑色素瘤中的结果截然相反。对此我们认为有两种可能：首先，p16表达缺失通常由p16失活的遗传改变(如启动子甲基化、纯合丢失)造成，但如果是点突变引起的p16基因失活，有可能不会导致p16表达缺失，甚至可能反馈性地增加p16的表达水平^[24]，因此SNM中p16蛋白部分强表达可能是由于p16蛋白功能失活的反馈性调节所致。其次，在宫颈癌和口咽鳞癌中p16过表达往往与人乳头状病毒(human papilloma virus，HPV)感染相关，且往往预示着更好的预后^[25]，而在HPV阴性肿瘤^[26]中p16的过表达可能由环境危险因素通过未知的反馈回路诱导，但其对细胞增殖的抑制作用被其他分子事件(如c-myc、细胞周期蛋白1的过表达)所抵消。在本研究中c-myc的过表达与预后不良强相关，所以我们推测尽管p16在SNM中过表达，但其细胞周期抑制功能被c-myc强大的致癌功能所抵消，虽然本研究中p16与c-myc的表达之间差异无统计学意义(P=0.091)，但鉴于P值比较接近0.05，因而我们认为不能完全否定这种可能。总之，SNM中p16表达失调是由癌基因介导还是遗传异常导致仍需进一步的分子实验探索。

现有的靶向药物如c-Kit抑制剂和免疫药物如PD-1/PD-L1抑制剂对SNM的治疗效果较为有限^[26-27]，实验表明针对c-myc靶点治疗肿瘤具有较好的效果^[29]。最近，溴结构域和额外末端结构域(bromodomain and extrater minal domain，BET)家族蛋白已成为不同肿瘤中c-myc表达的有效调节剂。用药物样分子抑制多发性骨髓瘤中的BET会导致c-myc表达和细胞死亡显著下降^[30]。Struntz等^[31]证明使用小分子KI-MS2-008稳定MAX：MAX同型二聚体会导致myc降解，并在体外和体内导致MYC转录基因程序的减弱。另外在过表达myc的癌细胞中用谷氨酰胺酶抑制剂治疗观察到细胞增殖下降^[32]，这表明c-myc靶向治疗可以使某些恶性肿瘤患者获益。

综上所述，我们的研究结果表明β-catenin、c-myc、p16阳性表达是SNM患者淋巴结转移的重要预测因子，c-myc阳性、p16强阳性表达可以作为判断SNM生存率低的重要参考标志物，c-myc靶向治疗是未来SNM治疗中的一个选择。

作者贡献声明  石林  论文构思和撰写，实验实施，数据采集和统计分析。翟长文，袁存存  数据统计与分析，论文修订。王纾宜  研究指导，论文修订。

利益冲突声明  所有作者均声明不存在利益冲突。