2021, Vol. 48
2. 上海市器官移植重点实验室 上海 200032
2. Shanghai Key Laboratory of Organ Transpiantation, Shanghai 200032, China
肾移植术后BK病毒（BK virus，BKV）感染导致的BKV相关肾病（BKV nephropathy，BKVAN）已成为移植肾功能丢失的重要原因之一[1]。BKV在人群中普遍易感，可潜伏在泌尿系统（尤其是肾小管）上皮细胞中。在免疫抑制状态，肾移植患者体内潜伏的BKV被激活并进入肾小管上皮细胞的细胞核内进行复制，大量病毒释放到尿液中，引起BK病毒尿症[2]。BKV在血液中持续高载量表达可进一步损伤移植肾组织，导致肾小管萎缩和间质纤维化，最终形成BKVAN，而目前临床上对于BKVAN尚无确切有效的治疗手段。
从BK病毒尿症到BKVAN是一个BKV感染逐步进展的病程，目前临床上对BKV感染进行免疫抑制剂减量干预的时机是BKV血症或尿液中BKV-DNA载量持续升高[3]。研究显示，BK病毒尿症对BKVAN的阳性预测值为27.3%，而BKV血症则为54.5%[4]。虽然BK病毒尿症对BKVN的阳性预测值较BKV血症低，然而却是BKV在肾移植患者体内开始复制的初始阶段，如果能够在BK病毒尿症的阶段即予以密切监测甚至及早干预治疗，将有助于控制BKV感染进展到BKVAN。
目前临床上诊断BK病毒尿症主要通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）来检测尿液中BKV-DNA的载量，当尿液中BKV-DNA载量＞107 copies/mL时诊断为BK病毒尿症[5]。然而，目前国内绝大多数医院（包括作者所在的医院）在临床上并未常规开展BKV-DNA PCR检测的项目，通常是器官移植科室的实验室或委托院外的检测公司开展此项检测业务，因而限制了这项检测的便利性。因此，如果能够利用临床上已经普遍开展的检测方法及指标来预测BK病毒尿症，将有助于BK病毒尿症的早期诊断及病程监测。
肾小管上皮细胞在BKV感染时的坏死和凋亡会引起炎症反应，损伤周围的正常肾小管上皮细胞并导致其脱落，形成临床尿常规检测报告中的尿小圆上皮细胞（small round epithelial cells，SREC）。SREC细胞核小呈圆形，核膜厚，胞质内常见颗粒，与Decoy细胞在形态上有明显差异[6]。尿液中SREC的检测方便易行，可以通过全自动尿沉渣分析仪检测，目前国内大多数医院已经在临床普遍开展，尿常规的项目中已包含SREC的指标项。临床使用的尿沉渣分析仪有高度准确性、便利性，可大量筛查疑似患者的尿液标本。正常人的尿液罕见SREC，大量的SREC常见于急性肾小管坏死和肾小管间质炎症的患者[7]。此外，肾病综合征、大量蛋白尿、肾移植术后1周内或移植肾发生排斥反应，均可在患者的尿液标本中检测到SREC。肾移植术后1周内，尿中可出现较多的SREC，随后可逐渐减少而消失。SREC还常见于女性月经或是女性正常脱落细胞、尿路感染和肾炎肾损伤情况，主要以排除尿路感染的常见因素为主[8]。
本研究拟通过诊断评价方法探索采用尿常规中的SREC（即脱落的肾小管上皮细胞）指标来预测和辅助诊断肾移植术后BK病毒尿症的可行性和准确性，为探索采用临床上已存在的、简便易行的方法来诊断、监测肾移植术后BK病毒尿症提供新的思路。
资料和方法临床资料 回顾性分析2017年1月—2019年10月在复旦大学附属中山医院接受肾移植及随访的152例患者，随访截至2020年10月，患者随访时间最长为40个月，最短为12个月，平均随访时间为（18±6）个月。纳入标准：（1）行1次及以上的尿液样本BKV-DNA载量PCR检测；（2）术后稳定长期门诊随访、行尿常规检测。排除标准：（1）年龄超过75岁或小于18岁；（2）移植肾功能丧失或伴有严重并发症。本回顾性临床研究方案经复旦大学附属中山医院伦理委员会批准（编号：B2019-320），所有受检者均签署了知情同意书。临床数据统计中包含肾移植患者的年龄、受者性别、免疫抑制方案、随访时间、HLA匹配、血清肌酐、尿白细胞（urine white blood cells，UWBC）、尿红细胞（urine red blood cells，URBC）、SREC阳性指标、SREC持续阳性时间段。本研究中所有肾移植患者术后均接受钙调磷酸酶抑制剂+麦考酚钠/吗替麦考酚酯+糖皮质激素的三联免疫抑制方案。
仪器与试剂 UF-1000i全自动尿沉渣分析仪及其配套的试剂和质控品均购自日本希森美康株式会社；7500型定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司）；BKV核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法，北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司）；OLYMPUS CKX31倒置显微镜、OLYMPUS FLUOVIEW FV3000激光共聚焦显微镜（日本奥林巴斯株式会社）；anti-BKV VP1（MAB3204-M02，一抗，亚诺法生技股份有限公司）；重组人细胞角蛋白18（Cytokeratin 18 antibody，CK18，ab668，一抗），DyLight 488 Goat Anti-Mouse IgG（H+L）（二抗），山羊抗小鼠IgG H & L（Cy3）（二抗，艾博抗上海贸易有限公司）；DAPI染色液（上海睿宝和生物科技有限公司）；尿沉渣染色液（S-M方法，珠海贝索生物技术有限公司）。
尿液标本收集和实验室检查 尿液标本留取收集依患者随诊时进行。患者移植术后1周、2周，1、2、3、6、12、18、24个月常规进行尿常规检测，以首次BKV-DNA定量检测为观察期间的开始时间，观察两组患者在肾移植术后常规随访的尿常规化验单中SREC阳性指标，出现SREC指标阳性的起始时间点和结束时间点，并计算出时间段，将持续3周及以上的持续阳性时间视为SREC持续阳性时间段。其中有36名患者在随访期间内BKV-DNA载量＞1.0×107拷贝/mL，即纳入BK病毒尿症组，101名患者在随访期间内BKV-DNA载量＜1.0×107拷贝/mL，则纳入非BK病毒尿症组。
尿沉渣涂片及S-M染色 留取肾移植术后BKV感染患者的晨尿10 mL，100 6.3×g离心5 min，取0.1 mL的尿沉淀成分并均匀涂在防滑玻片，放置到倒置显微镜下加入尿沉淀染色液（S-M染色）后观察。
尿沉渣免疫荧光染色 收集肾移植术后BKV-DNA载量＞1.0×107拷贝/mL患者的晨尿100 mL，1 006.3×g离心10 min，倒出上清液，将底部沉淀物以同样条件再离心10 min，取0.1 mL的尿沉淀成分加入4%多聚甲醛后石蜡包埋切片，使用一抗anti-BKV VP1（1∶300）和一抗CK18（1：300）染色过夜，PBS洗涤3次，与适当的二抗IgG H & L（488）（1∶1 000）和二抗IgG H & L（Cy3）（1∶1 000）在室温下孵育1 h。PBS洗涤3次，将载玻片用抗褪色试剂和DAPI（蓝色）固定。
BKV-DNA实时荧光定量检测 实时荧光定量聚合酶链式反应检测肾移植患者尿液或者血液中BKV-DNA载量是目前主要诊断BKV感染的方法[9]。临床尿液和血浆标本送至荻硕贝肯临床检验实验室（上海）检测并出具检测报告，使用BKV核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法，北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司）检测尿液中的BKV-DNA载量。当尿液BKV-DNA测定值≥1.0×107拷贝/mL时定义为BK病毒尿症，测定值的范围为2.0×103~5.0×108拷贝/mL，测定值＞5.0×108拷贝/mL时，等同为5.0×108拷贝/mL。
尿流式细胞结果检测分析 尿液标本留取收集依患者随诊时进行。患者移植术后1天，1、2、6、9、12、18周进行常规的尿常规检测，同时收集患者中段晨尿10 mL分装2管标本，送至中山医院检验科的UF-1000i全自动尿液有形成分分析仪进行全尿液流式细胞学SREC细胞定量指标的检测。观察两组患者在肾移植术后常规随访的尿常规化验单中SREC阳性指标，出现SREC指标阳性的起始时间点和结束时间点，计算出时间段，将持续3周及以上的持续阳性时间视为SREC持续阳性时间段。
统计学方法 采用SPSS 22.0统计分析软件。计量资料以
患者的一般临床资料 本研究中BK病毒尿症患者与非BK病毒尿症患者在年龄、性别、免疫抑制方案、随访时间、血清肌酐、尿白细胞和尿红细胞的差异均无统计学意义，尿小圆上皮细胞阳性及其持续阳性时间段差异有统计学意义（表 1）。
| [x±s or n(%)] | |||||||||||||||||||||||||||||
| Item | BK Viruria（n=36） | non-BK Viruria（n=166） | P | ||||||||||||||||||||||||||
| Sex（males/females） | 25/11 | 81/35 | 0.965 | ||||||||||||||||||||||||||
| Age（years） | 43.33±12.40 | 40.78±11.39 | 0.439 | ||||||||||||||||||||||||||
| Follow-up duration（years） | 2.83±1.20 | 3.03±1.37 | 0.835 | ||||||||||||||||||||||||||
| Scr（μmol/L） | 176.63±12.86 | 170.06±10.62 | 0.375 | ||||||||||||||||||||||||||
| Postoperative immune suppressive regimen | 0.795 | ||||||||||||||||||||||||||||
| CsA+MMF+Pred | 12（33.3） | 36（31.1） | |||||||||||||||||||||||||||
| Tac+MMF+Pred | 24（66.6） | 80（68.9） | |||||||||||||||||||||||||||
| HLA match number | 4（4，4） | 4（4，4） | 0.293 | ||||||||||||||||||||||||||
| URBC（+/-） | 14/22 | 66/50 | 0.470 | ||||||||||||||||||||||||||
| UWBC（+/-） | 7/29 | 21/95 | 0.230 | ||||||||||||||||||||||||||
| SREC（+/-） | 34/2 | 44/72 | ＜0.001 | ||||||||||||||||||||||||||
| DSRECP（+/-） | 34/2 | 17/99 | ＜0.001 | ||||||||||||||||||||||||||
| CsA：Cyclosporine A；Tac：Tacrolimus；MMF：Mycophenolate mofetil；Pred：Prednisolone；HLA：Human leukocyte antigen；SREC：Small round epithelial cell；DSRECP：Duration of SREC positivity. | |||||||||||||||||||||||||||||
SREC持续阳性时间段预测BK病毒尿症 从临床数据分析，SREC阳性指标与BK病毒尿症有明显相关性，阳性预测值为68.97%，阴性预测值为72.68%；而多次检测出的SREC持续阳性时间段与BK病毒尿症也有相关性，阳性预测值为94.44%，阴性预测值为85.34%（表 2）；单次和多次检测的SREC持续阳性时间段与BKV血症无明显特异性，阳性预测值为11.60%，阴性预测值为98.10%。根据SREC持续阳性时间段的出现与BK病毒尿症确诊的时间节点进行比较，SREC持续阳性时间段能提前（1.5±0.5）个月预测BK病毒尿症的发生。
| (%) | |||||||||||||||||||||||||||||
| Item | Sensitivity | Specificity | PPV | NPV | |||||||||||||||||||||||||
| UWBC | 10.60 | 84.10 | 38.80 | 50.00 | |||||||||||||||||||||||||
| URBC | 77.00 | 43.80 | 56.40 | 67.00 | |||||||||||||||||||||||||
| SRECs | 54.55 | 83.13 | 68.97 | 72.68 | |||||||||||||||||||||||||
| DSRECP | 66.67 | 98.02 | 94.44 | 85.34 | |||||||||||||||||||||||||
| PPV：Positive predictive value；NPV：Negative predictive value；UWBC：Urine white blood cell；URBC：Urine red blood cell；SRECs：Small round epithelial cells；DSRECP：Duration of SREC positivity. | |||||||||||||||||||||||||||||
尿SREC中BKV颗粒的鉴定 本实验在BK病毒尿症患者尿沉淀涂片直接观察可见SREC与Decoy细胞同时存在，S-M法染色后细胞形态有明显的差异（图 1、2）。尿沉淀制成的石蜡切片免疫荧光结果显示，VP1仅在SREC的细胞质和Decoy细胞的细胞核上表达，证明SREC有BKV感染，与Decoy细胞同为BK病毒尿症的诊断依据（图 3）。本研究同时将不同BKV-DNA载量、SREC定量值的尿沉淀切片进行免疫荧光染色处理，再用Image J软件分析图片，从该结果可推测SREC的数量是与尿液BKV-DNA载量呈正比，而当尿液BKV-DNA载量越大，SREC内存在BKV颗粒的细胞比例越高（图 4）。
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| Solid arrows mark cells by their morphotropic, clear cytoplasm, small nucleus, and smaller nuclear-plasmic ratio, which can regarde as SREC; Hollow arrows mark cells by their morphotropic, larger nuclear-plasmic ratio, swelling of the nucleus with a ground glass-like appearance, multiple inclusion bodies in the nucleus, degeneration of cytoplasms, which can regarde as Decoy cells. 图 1 BK病毒尿症患者的尿沉渣细胞涂片（镜下，40×） Fig 1 Urine sediment cell smear of patients with BK viruria disease (light microscope, 40×) |
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| The quantitative detection of SRECs of this sample is 5 μL.After staining, SREC can be seen obviously under the microscope.The solid arrow marked cells are pink SREC, hollow The arrow marks the cells as Decoy cells with swelling and degeneration of nuclei and dark ink. 图 2 BK病毒尿症患者的尿沉渣涂片（S-M法染色，40×） Fig 2 Urine sediment smear of a patient with BK viruria (S-M method staining, 40×) |
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| The SRECs express BKV coat protein and epithelial cell marker in cytoplasm, and Decoy cells express BKV coat protein in the nuclei, the expression of immunofluorescence staining can discriminate that SREC and Decoy cells are different cell shapes but all related to BK viruria. A: CK18 labeled in renal tubular epithelial cells(red fluorescence); B: Anti-BKV VP1 labeled in BKV coat protein(green fluorescence); C: The nuclei(blue fluorescence); D: Figures detected by double immunofluorescence. Under fluorescence microscope. 图 3 BK病毒尿症患者免疫荧光染色的尿沉渣切片（40×） Fig 3 Immunofluorescence staining for the BK viruria patient's urine sediments sections(40×) |
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| This was an increasing virus replication in urine sediments in BK viruria patient, the number of total cell, SREC, infected SREC and the ratio of infected SREC directly proportional to urine BKV-DNA load, which means the increasing number of SREC may relate to the exacerbation of BK Viruria.A: The indicator of SREC shows negative for quantitative value of 3 U/μL, the urine BKV-DNA load was 4.1 ×copies/mL.A total cell number for 2157(blue), SREC number for 353(red), infected SREC number for 229(red-green), almost 64.8% SREC are infected. B: The indicator of SREC shows possitive for quantitative value of 7 U/μL, the urine BKV-DNA load was 3.8×copies/mL.A total cell number for 6 472 (blue), SREC number for 531 (red), infected SREC number for 482 (red-green), almost 90.7% SREC are infected. 图 4 不同时间节点BKV-DNA载量的BK病毒尿症患者免疫荧光染色的尿沉渣切片（5×） Fig 4 Different BKV-DNA loads of the BK viruria patient's urine sediments tissue sections at various time points (5×) |
尿SREC持续阳性时间段预测BK病毒尿症的Logistic回归模型分析 考虑到SREC与尿液中存在的影响因素的相关性，使用URBC、UWBC、SREC阳性指标和SREC持续阳性时间段与BK病毒尿症作Logistic回归分析。结果显示，BK病毒尿症与SREC阳性指标和SREC持续阳性时间段有明显相关性，而与URBC和UWBC无明显相关性，这两项指标对于SREC和SREC持续阳性时间段的预测效能没有影响（表 3）。此结果证明SREC持续阳性时间段与BK病毒尿症的相关性最佳。SREC阳性指标同样与BK病毒尿症显著相关。
| Items | Odds Ratio | 95%CI | P |
| URBC | 0.757 | 0.22-2.50 | 0.435 |
| UWBC | 0.574 | 0.14-2.26 | 0.434 |
| SREC | 67.161 | 11.98-376.49 | ＜0.001 |
| DSRECP | 92.556 | 20.40-419.83 | ＜0.001 |
| UWBC：Urine white blood cell；URBC：Urine red blood cell；SREC：Small round epithelial cell；DSRECP：Duration of SREC positivity. | |||
尿SREC定量指标与尿液BKV-DNA定量指标成正比线性关系 将BK病毒尿症患者术后1天，6周、9周、12周定期检测的SREC定量指标和BKV-DNA PCR定量指标进行长期多次对比观察，发现在不同患者的相同随访周期内，SREC与BKV载量存在相似的变化趋势且成正比关系，SREC每增加1个/μL，BKV-DNA PCR定量指标约增加1.1×
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| 图 5 小圆上皮细胞定量值与BK病毒尿症患者BKV-DNA载量的Logistic线性回归分析 Fig 5 Logistic linear regression analysis of SRECs and BKV-DNA load in patients with BK viruria |
尿SREC持续阳性时间段与BK病毒尿症的ROC曲线 本研究的肾移植患者术后发现BK病毒尿症的中位数时间在2.5个月，而BK病毒尿症患者在术后（1.0±0.5）个月检测到SREC阳性指标，根据SREC持续阳性时间段的出现与BK病毒尿症确诊的时间节点进行比较，SREC持续阳性时间段可能提前（1.0±0.5）个月预测BK病毒尿症的发生。
根据Logistic回归分析的结果，以SREC持续阳性时间段来预测BK病毒尿症，AUC为0.872，95%CI：0.77~0.974，cut-off值为85.5天，对BK病毒尿症有临床预测价值（图 6）。此结果证明尿SREC持续阳性时间段预测BK病毒尿症发生的效能较佳，可很好降低术后BK相关肾病的发生。
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| 图 6 尿小圆上皮细胞持续阳性时间段预测BK病毒尿症的ROC曲线 Fig 6 ROC curve analysis of urine DSRECP for predicting BK viruria infection |
BKV的感染在健康人群中普遍存在，成年人中BKV血清抗体阳性可达到90%[5]，平时在泌尿系统的肾小管上皮细胞和尿路上皮细胞里休眠潜伏。由于正常人群免疫功能正常，绝大多数被感染者终生不会出现BKV感染的临床症状。肾移植患者处于免疫抑制状态，休眠状态的BKV可发生复制、增殖，导致BKV感染。国内文献报道肾移植术后BK病毒尿症、BKV血症和BKVAN的发生率分别是45.6%、22.2%和5.6%[10]。如果可以早期预测及诊断BKV感染，则可以密切监测并及时进行干预，从而降低BKVAN的发生率，提高移植肾的长期存活率。
据国外文献报道，肾移植术后BK病毒尿症主要发生在术后1~3月，从BK病毒尿症进展至BKV血症及移植肾损伤有4~12周的窗口期[11]。国内的报道显示，肾移植术后BK病毒尿症多发生在术后2个月左右[4]。本研究也发现，肾移植患者BK病毒尿症主要发生在术后（2.5±0.5）个月，而SREC持续阳性时间段能提前（1.5±0.5）个月预测病毒的发生。根据2019年版美国移植学会的临床建议，尿液细胞学检测只有Decoy细胞阳性才能诊断为肾移植术后多瘤病毒感染，在肾移植术后每2周进行一次尿液细胞学检查Decoy细胞直到术后3个月。而对尿BKV-DNA载量检测是术后每个月1次，直到术后9个月，再每3个月检测一次直到术后2年[3]。
通过尿液细胞学检查寻找Decoy细胞，需要经验丰富的技术人员，而且主观性较强，临床上应用有较大局限性。基于PCR方法的尿液BKV-DNA载量检测是目前临床常用方法，但是检测过程相对比较繁琐，而且大多数医院未常规开展，对患者而言频繁检测也增加了医疗支出。如果能够利用目前临床上尿常规检测项目中的某些指标，来早期预测甚至诊断BK病毒尿症，将有助于密切随访BKV的感染病程，从而有针对性地指导BKV血症和BKVAN的检测及监测。SREC指标在临床上多出现于肾脏的急性肾小管坏死、肾小管间质炎症、尿路细菌感染、肾病综合征和移植肾排斥等，在BKV感染方面未见文献报道。已有研究证实，潜伏在尿路上皮中的BKV增殖性感染可导致肾小管上皮细胞核损伤、细胞破碎溶解，细胞内过氧化氢酶释放过氧化氢氧化各类细胞器碎片[12]，释放大量炎症因子导致周围正常肾小管上皮细胞脱落，进而从尿液中排除。然而，尚未有研究对SREC与BKV感染的相关性进行研究和报道。
本研究以医院检验科的尿常规结果为数据，研究全自动尿沉渣检测仪检测SREC指标用于临床预测BK病毒尿症。由于全自动尿沉渣检测仪可以大量、准确地测出尿液中的细胞指标，而且尿常规项目是肾移植患者术后常规的检查项目，应用此临床指标诊断BK病毒尿症能提供更加便捷、经济实惠的无创临床诊断方案。
我们的研究发现，SREC阳性指标、定量指标、持续阳性时间段均与BK病毒尿症有明显的相关性。双重免疫荧光标记法和S-M尿沉淀染色法同时证明SREC细胞质内存在BKV颗粒，且在该细胞核内未发现BKV颗粒，由此可知SREC与Decoy细胞并非相同细胞类型，而且与BK病毒尿症有直接相关性。由此可得出：（1）SREC持续阳性时间段的指标能提前1个月预测BK病毒尿症的发生；（2）如果SREC阳性指标持续的时间在85天左右，预测BK病毒尿症的效能最佳，阳性预测值为100%；（3）SREC在BK病毒尿症中同样感染BKV，与Decoy细胞来源自相同的脱落肾小管上皮细胞，可能为潜在的早期Decoy细胞的形态；（4）即使混杂了与SREC相关性较高的尿液干扰因素，也不影响SREC持续阳性时间段对BK病毒尿症的诊断效能；（5）SREC的定量指标与BK病毒尿症的BKV载量有正比关系，此研究结果可进一步探究SREC指标诊断BK病毒尿症的优化方案。
综上所述，肾移植患者SREC阳性指标可预测早期BKV感染的发生，SREC阳性时间段在预测BK病毒尿症方面的准确性更高，可能为本研究中最优化的辅助诊断早期BKV感染的临床指标。
本研究结果尚有不足之处，如病例数不足、缺乏前瞻性研究设计、指标的特异性尚未在其他研究中验证过，仍需进一步深入研究。
作者贡献声明 许瀚仁 探索研究方向，数据采集，论文撰写和修订。王继纳 论文构思和指导，实验设计，数据分析。杨橙 实验设计，实证与验证数据分析在临床上的可行性。张潮 数据统计和分析，模型运算，修订论文。戎瑞明 论文审阅和指导。朱同玉 论文框架设计，调整研究计划。许明 论文修订和终审。
利益冲突声明 所有作者均声明不存在利益冲突。
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