人工关节置换术是治疗终末期关节病的有效方法，人工关节感染（periprosthetic joint infection，PJI）是人工关节置换术后严重的并发症^[1-2]，会增加致残风险和经济负担。PJI的治疗难点在于早期及时诊断病原体^[3]。常规病原培养是目前最常用的PJI病原体的检测手段，因为取样前使用抗生素、取样及培养过程污染、培养条件不当、存在生物膜等情况，现有培养阴性率高达20%~40%，无法确诊致病菌可能导致PJI治疗失败^[4]。

宏基因组二代测序技术（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）是应用最为广泛的二代测序技术。mNGS是运用生物信息分析技术检测出样本中所有微生物的种类及序列数量的方法，因其可以无偏倚检测所有核酸，从而在不依赖病原学培养技术的前提下，能够同时检测细菌、真菌、病毒和寄生虫。理论上mNGS可无偏倚、快速诊断PJI，尤其可解决培养阴性PJI的诊断难题。

目前国内应用mNGS诊断PJI尚处于起步阶段，本研究通过传统微生物培养方法和mNGS技术检测PJI标本，比较两者诊断效能，评估mNGS对PJI病原学诊断的临床价值。

资料和方法

研究对象  收集2017年1月—2019年12月在复旦大学附属中山医院行人工关节置换术后出现疑似PJI症状而住院的患者。根据2011版美国骨骼肌肉感染协会（Musculoskeletal Infection Society，MSIS）诊断标准^[5]进行诊断（图 1）。纳入标准：（1）临床资料完善，可行MSIS诊断；（2）配合随访；（3）知情同意；（4）关节液与假体周围组织均行病原培养与mNGS测序。排除标准：（1）因各种原因不能配合者；（2）取材过程中存在明确污染；（3）临床取样量不足；（4）资料不全无法进行MSIS诊断。

取样操作  所有患者手术过程中均进行关节液和假体周围组织取样。

关节液取样：术中切开关节囊前，用无菌针筒进行关节腔穿刺，抽取关节液，避免混入血液。取样分为两部分，一部分直接注射进需氧、厌氧、真菌和血培养瓶中，30 min内运送至我院检验科微生物室，另一部分装入无脱氧核糖核酸酶的无菌冻存容器中，30 min内置于-80 ℃冰箱保存。

假体周围组织取样：翻修术中使用无菌手术刀在3处不同部位（存在炎症的部位）切取假体周围组织，避免混入液体。装入无菌容器中，30 min内行传统微生物培养；在微生物室无菌条件下，与3 mL脑心浸液肉汤混合研磨1 min，形成组织匀浆后进行培养，剩余组织匀浆装入无脱氧核糖核酸酶的无菌冻存容器中，于-80 ℃冰箱保存。

病原体培养  于我院检验科行病原体培养，分别于血琼脂平板、巧克力平板、念珠菌显色平板、沙氏葡萄糖琼脂培养基平板、分枝杆菌培养系统行细菌、真菌和分枝杆菌培养。应用鉴定药敏系统和飞行时间质谱鉴定以确认病原体。

mNGS检测与数据分析  按照华大基因BGISEQ-100平台标准测序流程进行测序。

提取核酸：室温下解冻标本，取0.6 mL关节液/组织匀浆，混合1 g玻璃珠（半径0.5 mm），在破壁管中以16 000×g高速离心10 min，取0.3 mL破壁产物，根据天根试剂盒步骤操作，提取核酸。取500 ng核酸，根据标准化操作指南行超声，破碎至200~300 bp的片段。

高通量测序：架构文库后进行测序，核酸浓度与插入片段的长度符合生物分析仪（Agilent 2100）质量控制库的要求，环化处理后变成环形单链构造的文库。对文库进行滚环复制操作，产生DNA纳米球。使用BGISEQ-100测序平台对加载DNA纳米球的测序芯片进行高通量测序。

数据处理：对测序平台输出的数据进行处理，排除35 bp以下和质量过低的数据，获得高质量的测序数据。然后选择Burrows-Wheeler Alignment（http://bio-bwa.sourceforge.net/）进行比对，与人源参考基因组一致的序列数据将被排除。最终合格的数据在删除低复杂度数据后，使用美国国家生物信息中心数据库（包括3 446种细菌、4 152种病毒、206种真菌和140种寄生虫的微生物数据库）与处理所得数据进行比对，从而获得匹配病原体的序列数，根据序列数高低、覆盖度、相对丰度等指标最终出具检测报告。

mNGS阳性标准：细菌种水平覆盖度10倍及以上；真菌、病毒种水平覆盖度5倍及以上。

统计学方法  通过SPSS 22.0软件进行数据处理。连续性变量符合正态分布的用均值表示，不符合正态分布的用中位数表示；分类变量用n（%）表示。

结果

一般资料  共13例（髋关节4例，膝关节8例，肘关节1例）纳入研究。根据MSIS诊断标准，13例均诊断为PJI。男8例，女5例，年龄18~81岁，初次置换后出现症状的中位时间为104（2~886）周，初次置换病因包括骨关节炎、外伤、骨肿瘤、类风湿性关节炎、股骨头坏死。翻修术前血沉平均水平为（67.77±32.74）mm/h，C反应蛋白中位水平为77.60 mg/dL。

培养与mNGS检测结果比较  13例PJI患者中，mNGS阳性11例（84.62%），2例检出多重感染（检出病原数 > 2）；培养阳性10例（76.92%）。两者检测结果相符6例（46.15%），mNGS阳性率较优于病原培养（表 1）。膝关节中，mNGS阳性率75.00%，培养阳性率87.50%；髋关节中，mNGS阳性率100.00%，培养阳性率50.00%。9例患者在取样前未停用抗生素2周，mNGS阳性率100%，培养阳性率66.67%。mNGS平均检测时间48 h，平均培养时间7天。

mNGS检测结果  关节液和假体周围组织样本中，mNGS检出有效序列的中位数分别为78（5~1 520）和13（3~345）（表 2）。

培养阴性病例  在3例培养阴性的病例中，mNGS均检出有临床意义的阳性病原体，包括1例人型支原体、1例金黄色葡萄球菌和1例屎肠球菌。术前均长期使用抗生素治疗。

讨论

本研究发现mNGS可以从PJI病例的关节液和假体周围组织中成功检出致病病原体，mNGS病原检出率84.62%，优于培养检出率76.92 %，且与培养结果有良好的一致性，说明mNGS在高敏感性的同时有较高准确性，能检出罕见菌，在培养阴性病例中检出致病病原体，识别多重感染；因此，mNGS技术有助于PJI病原学诊断。

mNGS与培养检测能力相当  本研究中mNGS检出病原体情况与文献报道金黄色葡萄球菌是PJI最常见的致病病原体相符^[6]。PJI致病病原体包括金黄色葡萄球菌、各类革兰氏阴性杆菌、凝固酶阴性葡萄球菌等，真菌和支原体导致的感染较为罕见。本研究利用mNGS和培养均检出罕见病原体。通过mNGS检测出1例人型支原体感染导致的PJI、1例白假丝酵母菌感染导致的PJI，以及2例少见病原体与常见病原体共同导致的混合多重感染，与文献结果相符^[7]。Huang等^[8]报道使用mNGS技术成功诊断微小单胞菌（Parvimonas micra）导致的少见PJI。表明mNGS技术与病原培养检测能力相当，且能够在培养阴性PJI中检测出罕见病原体。

mNGS的优势

检测速度快  mNGS平均48 h取得结果，病原培养检测平均耗时7天，考虑到有效治疗PJI依赖于早期明确的病原学诊断以及相应针对性治疗，mNGS高效的检测速度在早期诊断方面具有显著优势，Zhang等^[9]研究表明在苛养菌检测方面，mNGS的检出阳性率和检测速度均占优势。

检出率高  在培养阴性病例中，成功治疗PJI关键是早期明确致病病原体，使用敏感抗生素治疗和及时清创翻修。现有诊断技术依赖培养结果，可能因出现假阴性而无法明确病原体。诊断“金标准”是传统病原学培养，通过对关节液、假体周围组织、超声裂解液等临床标本进行培养，阳性率为50%~70%^[10]。相关研究中培养阴性PJI占10%~20%^[11]。典型病例中，虽然发热、窦道、伤口渗液、炎症指标升高、影像学检查和术中所见均提示存在PJI，但因为致病菌是罕见菌，培养阴性，及时清创手术和经验性抗生素治疗无法有效控制感染，mNGS检测明确病原体后行针对性治疗，成功控制感染，并且可以识别多重感染。文献报道中17%~39%PJI为多重混合感染^[12-13]，本研究中的多重感染检出率为15.38%，联合应用敏感抗生素成功控制感染。Tarabichi等^[7]报告aNGS技术在培养阴性病例中的阳性率为81.8%，并可识别多重感染。相较于病原培养，mNGS识别出的病原体种类更多，阳性率更高，可以有效弥补传统培养敏感性较低且无法识别多重感染的不足，有效提高治疗成功率，且本研究后续随访病例均未出现感染复发。也有研究认为mNGS检测的敏感性与培养没有显著差异^[14]。

检测样本多样  mNGS通过对样本中的核酸进行扩增后进行检测，相比于微生物培养，mNGS对于送检样本量要求低，有研究提示在低容量的关节液中NGS检测依然保持高敏感性和特异性，为临床取样增加灵活性及样本来源^[15]。Cai等^[16]研究发现，mNGS技术在假体周围组织的敏感性和特异性分别为95.45%和90.91%，均明显优于病原培养；Huang等^[17]研究发现，mNGS技术在关节液中的敏感性为95.9%，高于培养（79.6%）的敏感性。

受抗生素影响较小  临床上经验性抗生素治疗会降低培养的阳性率。理论上mNGS技术检测病原体核酸，与病原体存活与否无关，不受抗生素影响，但实际上核酸的半衰期短，使用抗生素仍会使mNGS检出率下降，本研究中采样前使用抗生素的病例mNGS阳性率为100%，优于以往研究。

综上，mNGS基本能够弥补培养技术在临床应用中的不足和缺陷，是一种可替代培养，甚至优于培养的病原学诊断技术手段。

mNGS技术不足与局限性  （1）费用昂贵：样本检测费用远高于培养。（2）软硬件要求高：需要专业实验室和技术人员，暂时无法普及至各级医院。（3）存在污染、假阳性情况：出现假阳性的主要原因为采样转运检测过程中的污染，如未在层流手术室进行采样、采样过程中混杂皮肤表面定植菌^[18-19]（包括表皮葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌等）、转运容器中存在微生物核酸、核酸提取试剂盒污染、检测过程空气中微生物的污染，以及在建库时提取的DNA初始浓度低，导致多次扩增放大污染，从而造成假阳性^[20]。（4）无法进行药敏试验：普通培养能够同时进行药敏试验，指导临床及时根据病原体耐药情况调整抗菌药物，mNGS仅能够提示致病病原体，无法同步获知药敏情况，mNGS暂时无法完全取代传统培养技术。

本研究的局限性  （1）考虑到PJI的发病率，且mNGS是一门新兴技术，本研究作为一项单中心的研究，纳入的病例数较少，可能存在偏倚影响结论可靠性；（2）单个样本的mNGS测序费用昂贵，无法检测初次置换术中样本是否存在病原体，评估mNGS的特异性；（3）无法保证所有样本取样医师以及手术医师均相同；（4）感染治疗后短期随访，平均随访时间15.3个月，无法评估中长期感染复发情况。

本研究提示mNGS技术对PJI病原学诊断具有较大价值，能够提高检出率，检测出培养难以鉴定的病原体，缩短检测时间，是细菌培养的良好补充检测方法。将来需要多中心、大样本、多类型的mNGS诊断效能研究。

作者贡献声明  蒋昊辰  论文构思、撰写和修订，数据采集。宋春凤，朱文润，庞之楹，白杨，曹露，陈及非  病例收集。郭常安  论文构思、指导和修订。

利益冲突声明  所有作者均声明不存在利益冲突。