儿童是对二手烟(secondhand smoke，SHS)暴露最为敏感的群体^[1]，全球多达40%的儿童(< 14岁)仍暴露于烟草烟雾^[2]，中国有近1.82亿儿童每天暴露于二手烟危害^[3]。研究调查显示，农村家长吸烟率高于城市家长^[4]，68%的中国农村0~12岁儿童接触到二手烟的危害^[5]。家庭是儿童二手烟暴露的主要场所，儿童极易受到非自愿接触二手烟的伤害^[6]，家长在家中吸烟会导致儿童大量接触二手烟并影响儿童健康^[7]。因此，公共卫生政策需要关注和侧重于家庭禁烟。儿童二手烟暴露的测量是开展无烟家庭健康教育和干预的基础。以往关于儿童二手烟暴露的测量主要依赖于儿童父母或照护者的自报测量^[8]，但这类测量具有间接性和主观性的局限，不能准确反应儿童二手烟暴露的客观情况。烟草中尼古丁是维持吸烟的主要成瘾性物质，和大多数烟草相关疾病及过早死亡相关^[9]。尼古丁的主要近端代谢物可替宁被认为是过去72小时烟草烟雾暴露接触的可靠且敏感的标志，被广泛用于评估二手烟的暴露程度^[10-12]。因此，结合吸烟家庭家长自报吸烟行为及儿童尿液生物标记物检测可以更准确地评价儿童二手烟暴露情况。国内有关家庭吸烟者自报吸烟行为与儿童二手烟暴露生物标记物关联的研究十分有限。一项研究^[13]表明，儿童接触二手烟的暴露程度与照顾者的吸烟行为有关，该文主要研究家庭吸烟者数量以及每日香烟消费量与可替宁浓度的关系。此外，在农村地区的相关研究报道甚少，仅有一篇文章报道了哮喘儿童的尿液可替宁浓度与父母吸烟支数相关^[14]。本研究通过以农村地区学龄前儿童为基础的横断面研究，进一步细化吸烟行为，研究包括吸烟者吸烟频率、平均每天在家吸烟量、平均每天在孩子面前吸烟量以及吸烟时是否通风等吸烟行为与儿童二手烟暴露所致尿液可替宁水平之间的关联，探索能预测二手烟暴露相关生物标记物的自报吸烟行为。

研究对象及纳入和排除标准    本研究于2018年3月，采用整群抽样方法在浙江省台州市河头区、螺洋区、永丰区、桐屿区开展调查。由当地社区卫生工作者或乡村医生根据社区卫生中心健康档案对家庭进行筛查，并邀请符合条件的吸烟家庭参与研究。研究对象的纳入标准：(1)家庭中必须有至少一名成年吸烟者(招募时仍在吸烟)，且家中有2~5岁的儿童；(2)吸烟者与儿童共同居住，且在研究项目进行期内也会一同居住；(3)为本镇村民，并能够进行正常沟通；(4)吸烟者及儿童照护者了解研究项目并签署书面知情同意书。排除标准：(1)儿童患有严重疾病与出生缺陷；(2)吸烟者患有严重疾病；(3)吸烟者自报从不在家吸烟；(4)吸烟者长时间不与儿童共同居住(长期外出打工等)。本研究共招募461户有2~5岁儿童的吸烟家庭，在得到监护人的书面知情同意书之后，收集儿童尿液样本。其中，33名儿童尿液样本丢失，49名儿童尿液可替宁检测值低于最低检测浓度0.50 ng/mL^[15]。因此，本研究最终纳入379户吸烟家庭。本研究经昆山杜克大学伦理委员会(IRB No：2016ABDU003)审核通过。

数据收集

问卷调查   问卷内容主要包括家庭吸烟者基本人口学信息(吸烟者年龄、性别、文化程度、家庭总年收入等)以及吸烟者在家庭内的吸烟行为(吸烟频率即一周平均吸烟天数、平均每天在家吸烟量、平均每天在孩子面前吸烟量以及在屋内吸烟时是否打开门窗通风等)。由经过统一培训后的问卷调查员对纳入的家庭吸烟者进行面对面访谈后录入问卷信息。家庭吸烟者的定义为：到目前为止吸烟超过100支，并在电话招募阶段仍在吸烟。如果家中符合研究条件的2~5岁儿童超过一人，随机选择一位；如果家中有不止一位符合吸烟标准的吸烟家庭成员，则将与儿童日常接触更为密切者作为本研究的调查对象。

尿液样本采集与检测   儿童尿液样本采集由照护者在家或在社区卫生中心采集，采集时间为白天随机时间段。使用洁净的一次性尿液采集器采集20 mL尿液。儿童尿样收集后，样品在低温(4 ℃)条件下尽快送至台州市疾病防治中心储存于-20 ℃冰箱中。

实验室检测   采用液相色谱-串联质谱法测定可替宁水平。可替宁水平采用ng/mL为单位。本研究采用尿液可替宁原始浓度作为内暴露水平进行分析，原因如下：以往研究表明，被动暴露于二手烟儿童尿液可替宁原始浓度相较于尿液肌酐校正后的可替宁浓度与父母吸烟史的相关性更好^[16]；肌酐清除率在不同人群之间的差异很小^[17]；此外，我们采用比色法对随机抽取的58个尿液样本进行尿液肌酐浓度检测，对尿液可替宁浓度以每毫克肌酐标准化，结果显示学龄前儿童尿液可替宁原始浓度与矫正浓度的分布基本一致(结果作为补充材料递交)。可替宁具体检测方法为：取0.200 mL尿样，加入0.100 mL的100 μg/L同位素内标应用液，用初始流动相稀释至2.0 mL，涡旋混匀后，过0.22 μm聚醚砜微孔滤膜后用UPLC-MS/MS测定。本研究选择含0.01%甲酸的5 mmol/L乙酸铵-乙腈的流动相体系，因为在这个系中，可替宁有较好的保留，而且灵敏度和特异度较高^[18]。

质量控制   本研究招募当地大学生为调查员，由研究团队对调查员进行统一培训，规范调查过程，并且进行模拟练习。采用一对一询问式填写调查问卷，并对问卷进行查漏补缺，检查逻辑错误；质控人员最后检查编号并收回问卷；数据的录入、整理和维护实行专人负责，经复核无误后双轨录入。

统计学分析    录入数据采用Epidata 3.1软件，统计分析采用SPSS 23.0版。由于可替宁浓度的分布呈正偏态，因此采用几何平均浓度及其95%置信区间进行描述，3组及以上组间比较采用Kruskal Wallis检验，两组组间比较采用Mann-Whitney U检验。对可替宁浓度采用对数转换(Log10)形式进行统计分析。采用多元线性回归分析儿童二手烟暴露所致尿液可替宁水平与吸烟行为的关联。吸烟者各吸烟行为之间的关联分析采用Pearson积矩相关分析。所有检验的双尾P < 0.05为差异有统计学意义。

吸烟家长基本信息及吸烟行为与儿童尿液可替宁水平的关系    如表 1所示，31~40岁以及50岁以上的吸烟家长人数最多，各占全部调查对象的37%。男性吸烟家长占总调查人数的99%。受教育程度≤9年的吸烟家长占66%。调查对象中，家庭总年收入≤5万元的人数最多，占总调查人数的45%。儿童尿液的可替宁水平在吸烟家长不同年龄、性别、受教育程度、总年收入中的差异均无统计学意义。

吸烟家长吸烟行为的数据显示，家中吸烟频率每周4~7天的人数占比最多(93%)。吸烟家长自报平均每天在家吸烟量≤10支、11~20支及 > 20支的占比分别为44%、39%和17%。吸烟家长自报平均每天在孩子面前吸烟量≤2支、3~5支及 > 5支的占比分别为70%、22%和8%。屋内吸烟时打开门窗通风的调查对象占59%。较高的儿童尿液可替宁水平存在于吸烟家长每周吸烟4~7天的家庭(几何平均浓度为2.135 ng/mL，95%CI：1.952~2.347)，吸烟家长平均每天在家吸烟量超过20支的家庭(几何平均浓度为2.396 ng/mL，95%CI：1.763~3.035)，或吸烟家长平均每天在孩子面前吸烟量超过5支的家庭(几何平均浓度为3.334 ng/mL，95%CI：2.483~4.488)。

吸烟家长各吸烟行为的内部关联分析   对吸烟行为相关的4个变量(家中吸烟频率、平均每天在家吸烟量、平均每天在孩子面前吸烟量以及屋内吸烟时打开门窗通风)进行Pearson积矩相关分析(表 2)。结果表明，吸烟频率与平均每天在家吸烟量(r=0.168，P=0.001)以及平均每天在孩子面前吸烟量呈正相关(r=0.114，P=0.027)；平均每天在家吸烟量与平均每天在孩子面前吸烟量呈正相关(r=0.404，P < 0.001)，且二者相关系数的绝对值最高；平均每天在孩子面前吸烟量与屋内吸烟时打开门窗通风行为呈负相关(r=-0.166，P=0.001)，即平均每天在孩子面前吸烟量越大的家长，其吸烟时通风的行为越少。

暴露于二手烟的儿童尿液可替宁浓度的独立预测因素分析   为排除混杂因素的影响，采用多元线性回归分析确定吸烟家长吸烟行为中可作为儿童尿液可替宁浓度的潜在独立预测因素(表 3)。结果显示，吸烟家长在家中的吸烟频率(β=0.114，P=0.027)和平均每天在孩子面前的吸烟量(β=0.177，P=0.002)是暴露于二手烟的儿童尿液可替宁浓度的潜在独立预测因子。考虑到吸烟者吸烟时的通风状况可能会影响其他吸烟行为与儿童尿液可替宁浓度的关联，因此进一步依据吸烟者吸烟时是否通风进行分层分析(表 4)。结果表明，吸烟时不通风，吸烟家长平均每天在孩子面前吸烟量(β=0.217，P=0.003)是暴露于二手烟的儿童尿液可替宁浓度的潜在独立预测因子。

研究二手烟暴露的生物指标与家长自报吸烟之间的关系对准确评价儿童二手烟暴露及有效开展戒烟相关健康教育和干预措施至关重要。国内相关研究十分缺乏。本研究针对我国农村2~5岁学龄前儿童，研究儿童尿液可替宁水平与吸烟家长吸烟行为之间的关系，结果表明儿童尿液可替宁水平与吸烟家长自报家中吸烟频率及平均每天在孩子面前吸烟量相关，与平均每天在家吸烟量及吸烟时是否通风并无关联。本研究结果的意义在于：一方面提示了在无法开展生物学标志物检测的地区，可通过调查吸烟者自报在家吸烟频率和每天在孩子面前吸烟量来进行二手烟暴露的预测；另一方面，指出了家内吸烟时是否通风并不能减少儿童二手烟暴露程度，仅影响部分吸烟行为与儿童尿液可替宁水平的关联，为戒烟相关健康教育提供了新的证据。

以往研究也从不同角度探索了儿童二手烟暴露生物指标与吸烟家长吸烟行为间的关系。Mak等^[19]研究表明，与每天吸烟较多的吸烟者生活在一起的儿童尿液中可替宁水平较高。Tung等^[20]和Desouky等^[21]分别在中国台湾10~15岁儿童和沙特阿拉伯6~12岁儿童中研究发现，在家中接触环境烟草烟雾的儿童尿液中的可替宁和可替宁/肌酐比值(cotinine/creatinine ratio，CCR)高于从未在家中接触过环境烟草烟雾的儿童。Aurrekoetxea等^[22]通过对西班牙4岁儿童接触二手烟的研究发现，如果父母在家中当着儿童的面吸烟，儿童可检出的尿液可替宁水平的概率会增加。一致的研究结果还在欧洲不同地区的儿童(5~11岁)中被报道^[23-25]。这些研究结果与我们的一致，即吸烟家长平均每天在孩子面前吸烟量与儿童可检出的尿液可替宁水平呈正相关(P < 0.001，表 3)。此外，Ino等^[26]研究报道，父母在客厅吸烟的儿童尿液中检测到高水平可替宁的概率大，父母在阳台或门外吸烟的儿童尿液中检测到低水平可替宁的概率大，且这二者的可替宁水平相比于父母不吸烟的孩子要高出2~5倍。本研究亦针对屋内吸烟时通风性对可替宁的影响进行了调查，结果表明，屋内吸烟时通风并不能减少儿童二手烟暴露程度，这一结果进一步对家庭吸烟者提出了警示。

本研究显示，暴露于二手烟的学龄前儿童，其尿液中可替宁浓度的几何平均数为2.064 ng/mL，略低于另一项来自湖南省长沙市有关5~6岁儿童二手烟暴露的研究(3.94 ng/mL)，这可能由于农村地区和城市地区经济发展差异造成的烟草购买力及使用率不同以及居住环境不同所导致。然而，中国学龄前儿童二手烟暴露检测的可替宁浓度远低于西班牙一项针对学龄前儿童研究所报道的相关检测值，该研究中5岁儿童的可替宁平均浓度为19.5 ng/mL，6岁儿童为32.2 ng/mL^[27]。差异的可能原因包括不同的检测方法、不同地域的吸烟方式、烟草种类、纳入的儿童年龄范围以及不同种族人群的遗传背景差异等。

在吸烟者各吸烟行为的两两关联分析中，发现平均每天在孩子面前吸烟量越大的家长，其吸烟时通风的行为越少，说明吸烟量大的家长对儿童二手烟暴露的意识越差，相应的不良行为更多，会导致儿童二手烟暴露程度累积加剧，这一现象值得关注。

本研究存在一定的局限性：(1)仅单项测量尿液可替宁水平，尽管单次测量的可替宁水平与吸烟家长自报吸烟行为呈现很好的相关性，但缺乏多次测量建立准确二手烟暴露概况的优势，因此无法得出可替宁对暴露于二手烟的儿童的长期影响。(2)缺乏尿液样本采集时与儿童家中二手烟暴露的间隔时间，因此无法评估尼古丁代谢随时间的变化对可替宁检测值的影响。(3)由于本研究中的儿童年龄偏低，出于监护人对儿童信息的保护，我们未收集详细的儿童信息，可能存在研究对象的选择偏倚。(4)仅使用了尿液可替宁水平作为二手烟暴露的客观标记物，后续研究可结合多种环境烟草烟雾(environmental tabacco smoke，ETS)暴露的客观生物标志物以确定暴露水平，例如唾液中的可替宁水平^[10]。(5)本研究中儿童尿液采集时间为白天随机时间段，未能获得吸烟行为暴露后多久采集儿童尿液的信息，尽管可替宁具有生物稳定性，半衰期为30 h^[28-29]，但该局限仍可能影响吸烟行为与儿童尿液可替宁浓度的关联，后续的研究需要考虑这一因素。(6)二手烟暴露还可能来自烟雾在吸烟者衣服、家中物品等残留，可能存在家庭吸烟者未当面吸烟，但吸烟后和儿童近距离接触，从而导致二手烟暴露的情况，后续研究应该在儿童身边增加监测环境烟草浓度的工具，以此增加二手烟暴露测量的准确性。

总之，本研究揭示，中国农村地区暴露于二手烟的儿童尿液可替宁水平与吸烟家长的部分吸烟行为相关。加强对吸烟家长吸烟行为的干预是减少儿童接触二手烟的重要因素，本研究对于中国农村地区开展无烟家庭的健康教育和健康促进提供了有力证据。

作者贡献声明  祝慧维   数据采集，统计分析，论文写作。肖千一  研究设计，论文写作与修改。何静怡  数据采集及分析。郑频频，Abu S.Abdullah论文审核及修改。

利益冲突声明   所有作者均声明不存在利益冲突。