2021, Vol. 48
2. 国家卫生健康委员会新生儿疾病重点实验室(复旦大学) 上海 201102
2. National Health Commisson Key Laboratory of Neonatal Diseases(Fudan University), Shanghai 201102, China
早产是一个全球性的公共卫生问题，全球每年每10个新生儿中就有一个早产(胎龄 < 37周)[1-2]。随着围产新生儿救治水平的提高，早产儿的存活率越来越高[3]，但伴随着较高的脑损伤风险。据统计，约有25%~50%的早产儿在运动、视觉、认知等方面存在发育障碍[4]。而早产儿脑损伤的主要形式是早产儿脑白质损伤(preterm white matter injury，PWMI)[5]，约42.5%的脑瘫患儿患有PWMI[6]。
PWMI主要的上游启动损伤是缺氧缺血(hypoxia-ischemia，HI)或/和炎症反应，受累的主要靶细胞是少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cell，OPC)[7]。OPC富含铁、脂质，氧化代谢率高，极易受到HI、炎症等损伤的侵害[8]。损伤后，再生的OPC分化为成熟少突胶质细胞(oligodendrocyte，OL)，但难以形成髓鞘，最终导致髓鞘形成减少，影响沿轴突的快速传导[9]。
关于损伤后OL成髓鞘障碍的原因尚不清楚。OL的成熟、成髓鞘受到多种转录因子的调控。而Src家族激酶具有细胞增殖、促进神经元分化和轴突生长等作用[10-11]。作为非受体酪氨酸激酶，Src家族激酶包含Src、Fyn、Yes、Lck、Lyn和c-Src等，其中Src、Fyn、Yes、Lck和Lyn已在哺乳动物的大脑中检测到[12]，而发育期大脑已检测到Src、Fyn和Yes[13]。研究表明Src家族激酶对OL的分化成髓鞘有至关重要的作用[14]。研究显示，敲除Fyn激酶将会导致小鼠髓鞘生成明显减少[15-16]。一项体外研究显示，磷酸化c-Src的瞬时升高对于人神经干细胞诱导分化成OPC至关重要[17]。虽然下游的机制各不相同，但Src家族激酶具有相同的结构域，主要通过构建开放构象，使tyr 416位点磷酸化，从而产生活性[18]。但在PWMI中，对磷酸化Src激酶的改变知之甚少。
在本研究中，我们在正常发育的大鼠中测定磷酸化Src激酶的表达，并明确其共定位细胞；对出生3天的SD大鼠进行HI处理，构建大鼠缺氧缺血性脑白质损伤模型，在模型鼠中测定磷酸化Src激酶的改变，以期为PWMI的治疗提供理论基础。
材料和方法动物模型 SD大鼠购自上海西普尔-必凯公司，饲养于复旦大学上海医学院实验动物部。动物实验通过复旦大学附属儿科医院伦理委员会批准[批准号: 复儿伦审(2020)515号]。每窝大鼠根据体质量配平，随机分为2组，分别为对照组和HI组，每组3~7只，共计46只。HI组SD大鼠出生3天后结扎右侧颈总动脉，并使用6%氧气缺氧2.5 h，建立大鼠缺氧缺血性脑白质损伤模型。同窝对照组大鼠仅进行分离动脉的假手术，并未结扎和缺氧。
蛋白免疫印迹(Western blot，WB) 在出生后6、10、17天(P6、P10、P17)处死大鼠，快速取出脑组织置于冰上，冠状位切片，每片厚度2 mm，根据脑图谱定位切取并收集胼胝体组织，或直接收取右侧半脑。将取得的脑组织加入RIPA裂解液和蛋白酶磷酸酶抑制剂(美国Thermo公司)，研磨彻底，12 000×g离心提取蛋白裂解液上清。使用BCA蛋白检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)测定蛋白质浓度。将等量蛋白质加到SDS-PAGE胶上分离，再转至硝化纤维素滤膜上。使用5%牛血清室温下封闭1 h，在4 ℃下与以下一抗杂交过夜: 髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)(1:1 000，美国Biolegend公司)，β-actin (1:5 000，爱必信(上海)生物科技有限公司)，Src [pY416](1:1 000)和Src(1:1 000)(美国CST公司)。第二天与HRP酶标二抗[1:5 000，爱必信(上海)生物科技有限公司]在室温下孵育1 h后显影。
组织学检查及苏木精-伊红(HE)染色 用20%乌拉坦麻醉大鼠，灌注预冷的生理盐水，再灌注预冷的4%多聚甲醛，取下全脑组织放于4%多聚甲醛中，4 ℃下固定过夜。使用20%和30%的蔗糖梯度脱水。采用冰冻切片机(CM1950，德国莱卡公司)冠状切片，厚度约35 μm。采用HE染色，用光学显微镜(SZX7，日本奥林巴斯公司)分析。
免疫荧光染色 切片使用0.1% Triton X-100渗透，5%牛血清白蛋白封闭。使用一抗MBP(1:200，美国Biolegend公司)、PDGFRα(1:200，美国BD Pharmingen™公司)，CC-1(1:100，美国Calbiochem公司)，Src [pY416](1:100，美国CST公司)在4 ℃下孵育过夜，第二天再使用配对荧光偶联二抗(1:500，美国Alexa Fluor公司)室温下孵育。采用DAPI(武汉塞维尔生物科技有限公司)检测细胞核荧光信号。使用共聚焦荧光显微镜(TCS-SP8，德国莱卡公司)观察。
统计分析 使用Image J软件分析WB条带的灰度值和免疫荧光强度。所有数据均采用x±s表示。用Graphpad Prism 6.0软件进行统计分析。多组间比较采用单因素方差分析和Bonferroni法进行两两比较分析。两组间比较采用独立样本t检验分析。P < 0.05为差异有统计学意义。
结果胼胝体区磷酸化Src激酶的多时间表达 已有研究证明在脑中磷酸化的Src激酶对于OL具有调节髓鞘形成的作用[15, 19]。为了确定磷酸化的Src激酶在脑内促进髓鞘形成的作用，我们首先使用WB评估大脑内胼胝体中磷酸化Src激酶的表达。结果显示胼胝体区域磷酸化Src激酶表达在P6、P10时处于高水平，而在P17天时磷酸化Src激酶的表达显著下降(图 1A、1B)，三组表达不全相等(F=7.446，P=0.024)。P6时磷酸化Src激酶的表达显著高于P17天(图 1B)。这与OL成髓鞘的时间段相一致[20]。为了进一步验证这一结论，我们使用磷酸化Src激酶(tyr416)进行荧光染色，可见P6、P10时的磷酸化Src荧光强度较强，而P17天的磷酸化Src荧光明显减少(F=6.960，P=0.027)(图 1C、1D)。这与WB结果相一致。
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| P6, P10, P17:Postnatal day 6, 10, 17.A: Western blot images of phospho-Src (p-Src), total Src and actin.B: Quantification of p-Src/total Src (n=3 for each group).C: Quantification of the density of p-Src at different time points (n=3 for each group).D: Immunofluorescence of p-Src in corpus callosum region.(1) P < 0.05. 图 1 胼胝体区磷酸化Src激酶多时间表达 Fig 1 Expression of phosphorylation of Src kinases in corpus callosum region at different times |
发育期间磷酸化Src激酶的OL来源 OL发育成熟有4个阶段: OPC、晚期OPC、髓鞘化前少突胶质细胞和髓鞘化少突胶质细胞[9]。标记物PDGFRα在OPC和晚期OPC(即未成熟OL)中表达，而CC-1标记物则在髓鞘化前少突胶质细胞和髓鞘化少突胶质细胞(即成熟OL)中表达[21]。因此为了进一步明确Src激酶在不同发育期OL的表达特点，我们使用PDGFRα，CC-1和磷酸化Src(tyr416)进行了三重免疫荧光染色，对P6、P10的时间点进行分析。P6、P10时，可见少量PDGFRα+的OPC，而CC-1+的OL遍布脑片。大部分磷酸化Src+的细胞与CC-1+的成熟OL共定位(图 2A、2B)。表明Src激酶活化主要与CC-1+的成熟OL共定位，对成熟OL以及之后的髓鞘形成有关键影响。
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| A: Immunofluorescence of p-Src, CC-1 and PDGFRα on 3 days post injury in corpus callosum region (A) and on 7 days post injury in cortex region (B).Arrows point to cells co-located with CC-1+ and p-Src+. 图 2 磷酸化Src激酶与少突胶质细胞共染 Fig 2 Phosphorylated Src kinases co-stained with oligodendrocytes |
3日龄大鼠缺氧缺血性脑白质损伤模型的建立 为了研究PWMI中磷酸化Src激酶表达的改变，我们首先建立了3日龄大鼠缺氧缺血性脑白质损伤的模型。造模后14天(即P17)时，可见HI组的损伤侧半脑较对照组右脑稍萎缩(图 3A)。通过HE染色发现，造模后14天，HI组损伤侧胼胝体变薄，神经纤维排列紊乱、稀疏(图 3B)。WB结果显示，造模后14天HI组损伤侧胼胝体的MBP较对照组表达明显减少(t=4.417，P=0.002)(图 3C、3D)。我们在HI损伤后14天对脑片进行MBP免疫荧光染色，发现其结果与WB结果一致，HI组的MBP荧光强度明显降低(t=3.451，P=0.014)(图 3E、3F)。以上结果提示PWMI动物模型成功建立。
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| A: General view of brain on 14 days post injury.B: Hematoxylin and eosin staining on 14 days post injury (upper×100, lower×400).C: Western blot images of MBP on 14 days post injury in corpus callosum region.D: Quantification of MBP on 14 days post injury (n=4-6 for each group), E: Quantification of the density of MBP on 14 days post injury (n=3 for each group).F: Immunofluorescence images of MBP on the right side on 14 days post injury vs. control.(1) P < 0.01; (2)P < 0.05 图 3 3日龄大鼠HI脑白质损伤模型的建立 Fig 3 Establishment of a 3-day-old rat model with HI cerebral white matter injury |
Src激酶活化在3日龄大鼠缺氧缺血性脑白质损伤模型中的改变 为了探索HI损伤后Src激酶活化的改变，WB结果显示造模后3天(P6)时，HI组磷酸化Src的表达较对照组显著减少(图 4A)，差异有统计学意义(t=4.629，P=0.000 7)(图 4D)，而总Src蛋白保持不变。在造模后7天(P10)(图 4B)和造模后14天(P17)(图 4C)时，两组间差异无统计学意义(图 4E、4F)。我们又使用免疫荧光染色对造模后3天的脑片进行分析。图片显示的结果与造模后3天的WB结果一致，HI组磷酸化Src的荧光表达减少(t=7.075，P=0.002)(图 4G、4H)。
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| Western blot images of p-Src and total Src on 3 days post injury (A), 7 days post injury (B) and 14 days post injury (C).Quantification of p-Src/total Src on 3 days post injury (D, n=6-7 for each group), 7 days post injury (E, n=3 for each group) and 14 days post injury (F, n=3 for each group).G: Immunofluorescence of p-Src on 3 days post injury.H: Intensity of p-Src on 3 days post injury (n=3 for each group). vs. control, (1)P < 0.001, (2) P < 0.01. 图 4 Src激酶活化在3日龄大鼠缺氧缺血性脑白质损伤模型中的表达改变 Fig 4 Expressions of activated Src kinases in the 3-day-old rat hypoxia-ischemic white matter injury model |
本研究首先确定了正常发育大鼠脑中胼胝体区域磷酸化Src激酶随时间变化的趋势，并且将其与OPC和成熟OL共染，发现磷酸化Src激酶主要与CC-1+的细胞共染，这表明Src激酶在脑内活化水平与出生后早期发育期间的髓鞘形成密切相关。然后，我们在建立的3日龄大鼠缺氧缺血脑白质损伤模型中发现，HI损伤会使P6时磷酸化Src激酶的表达明显下降。
Src激酶作为非受体酪氨酸激酶，在脑内广泛表达，参与调控多种途径的信号传导，包括细胞黏附受体、整联蛋白、受体酪氨酸激酶，以及G蛋白偶联受体[22-24]。Src激酶具有调节细胞的形状，迁移和黏附，存活、生长和分化的作用，使其成为多种疾病的重要治疗靶标[25-27]。早在1994年，研究已经发现Src激酶中Fyn在OL髓鞘化的过程中被激活，促进髓鞘形成[28]。在一篇病例报告中表明，Src同源2域含蛋白酪氨酸磷酸酶2的功能启动子变异，与自发性早产本身、白质中髓鞘形成以及神经发育有关，可能导致早产儿的髓鞘发育迟缓和运动发育不良[29]。而在体外实验中，通过培养原代OPC证实了Fyn在分化OPC时上调[30]，随后在活跃的成髓细胞发生中下调[31]。本研究中Src激酶在大鼠正常发育脑内活化具有相似的时间节律，其在发育早期达到峰值，而在髓鞘几乎完全形成时迅速下调，且主要存在于成熟OL中，表明该节律可能与OL成髓鞘有重要关联。
磷酸化Src激酶在未成熟脑内对OL成髓鞘的作用已得到证实[20, 31]，但在PWMI中磷酸化Src激酶的改变尚不清楚。PWMI是造成早产儿各种神经行为学障碍的重要原因之一，其基本病因涉及大脑发育不成熟，白质区域的选择性脆弱以及炎症、HI损伤等[5, 32]。体外实验表明，缺氧30 min将导致90%的OL在9 h内死亡[33]。HI损伤对于白质的发育可能产生深远的不利影响，HI损伤可以导致脑内信号蛋白和营养素浓度的改变，如减少脑源性神经营养因子，这对于发育中的大脑以及OPC的分化至关重要[34-35]。而在我们建立的3日龄大鼠缺氧缺血性脑白质损伤模型中，发现HI损伤后磷酸化Src激酶表达水平的下降可能影响到OL成髓鞘。以往研究发现，缺乏Src激酶或缺乏Src激酶活性都将导致小鼠体内的髓鞘形成缺陷[15-16]。体外研究发现，在施万细胞和背根神经节共培养物中使用Src激酶抑制剂PP2将导致髓磷脂蛋白的减少，如MBP[36]。提示HI损伤后Src激酶活性的降低可能是导致OL成髓鞘障碍的重要原因之一。
越来越多的研究集中于Src激酶调节OL成髓鞘的机制。一项研究指出磷酸化Src激酶可能通过激活Erk1/2的磷酸化，从而介导脑源性神经营养因子促进OL成髓鞘[20]。另一项研究也显示Src家族激酶参与GABA调节髓鞘形成[37]。在一项体外实验中发现，高浓度的ATP增加了迁移OPC的数量，而BzATP(P2X7受体激动剂)的促进作用强于ATP，其作用可能是通过激活Fyn激酶而产生[38]。这些研究都表明，磷酸化Src激酶对OL成髓鞘的初始阶段起关键作用，并与多种机制有关。而我们的结果显示在HI损伤后磷酸化Src激酶表达水平的下降，可能影响到OL成髓鞘，但其机制尚未可知，有待将来进一步研究，为调控Src激酶增加理论基础。
PWMI后OPC难以形成髓鞘的机制一直尚未明确。本研究探讨了Src激酶活化在OL成髓鞘中扮演的重要角色，发现HI损伤后磷酸化Src激酶表达水平下降，可能是导致OL难以形成髓鞘的重要原因之一。未来我们将聚焦于外源干预Src激酶的活化，为HI损伤导致的PWMI提供治疗策略。
作者贡献声明 邱寒论文构思、撰写和修改，实验操作，数据分析。钱天阳，吴彤 实验操作，数据分析。王来栓 论文构思，综合指导。
利益冲突声明 所有作者均声明不存在利益冲突。
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