脓毒症（sepsis）是机体对感染的反应失调而导致威胁生命的器官功能障碍^[1]。急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）被认为是与死亡率独立相关的危重病并发症^[2-3]。脓毒症儿童合并AKI发病迅速，死亡率高。目前，AKI诊断标准由2012年KDIGO（Kidney Disease Improving Global Outcomes）发布，通过尿量减少或血肌酐较其基础值升高进行诊断，但掌握肌酐基础值后诊断AKI需要一定时间的观察^[4]。应用KDIGO标准诊断AKI仍存在一定数量的漏诊率^[5]，特别对危重症患者仍存在局限性。除了肌酐和尿量，胱抑素C（cystatin C，CysC）、视黄醇结合蛋白（retinol-binding protein，RBP）也是临床上评价肾功能的常用指标。中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL）和肾损伤因子1（kidney injury molecule 1，KIM-1）是近年诊断AKI的新的生物标志物。NGAL最早被报道于先天性心脏病患儿体外循环术后合并AKI时具有早期提示的作用，近年来的研究逐渐关注当其他疾病合并AKI时它是否同样具有良好的诊断价值；KIM-1被认为是一种潜在的AKI标志物，但总体报道少，并多集中在尿液中KIM-1的诊断价值上。两个标志物在危重症儿童AKI中应用的报道均不多。基于AKI是一种与原发疾病息息相关的综合征，同时危重症儿童往往病情复杂，发展迅速，本研究拟通过收集不同时点的样本，对血NGAL和KIM-1指标在脓毒症患儿AKI早期诊断以及特殊治疗过程中的临床应用价值进行探讨。

临床资料  连续纳入2019年1—12月诊断脓毒症、入住复旦大学附属儿科医院重症监护室的患儿82例。脓毒症诊断标准按《儿童脓毒性休克（感染性休克）诊治专家共识（2015版）》^[6]。按照排（剔）除标准除去13例。排除标准为各类结缔组织病（如类风湿、皮肌炎）、慢性肾脏病（如慢性肾损伤）及肿瘤、免疫缺陷等基础疾病的患儿。剔除标准为住院24 h内死亡或自动出院者。最终纳入脓毒症的患儿69例。根据脓毒症同期是否合并AKI分为脓毒症AKI组和脓毒症非AKI组。AKI的诊断标准按2012年KDIGO发布的48 h内血肌酐升高 > 26.5 μmol/L或大于基础值的1.5倍（确认或推测7天发生）或持续6 h以上尿量少于0.5 mL·kg^-1·h^-1。根据诊断脓毒症24 h内是否行连续性肾脏替代治疗（continuous renal replacement therapy，CRRT），将脓毒症AKI组进一步分为脓毒症AKI-CRRT组和脓毒症AKI-非CRRT组。CRRT治疗组均采用连续静脉-静脉血液滤过透析模式（continuous venovenous hemodiafiltration，CVVHDF）。超滤量根据临床治疗要求设定在0.5~5 mL·kg^-1·h^-1，透析量及滤过液量均设定为25 mL·kg^-1·h^{-1 [7-8]}，将尿量及超滤量相加作为共同的观察指标。本研究获复旦大学附属儿科医院伦理委员会批准（伦理批件号：复儿伦申〔2019〕315）。

研究方法  留取脓毒症AKI和非AKI患儿3个时点（入院后0 h、24 h、72 h）和正常对照组体检时（所用标本为生化检测剩余血清，≤0.5 mL）的静脉血，3 350×g离心5 min，吸取血清放置-70 ℃冰箱保存备用，并检测NGAL、KIM-1、肌酐、CysC、RBP。NGAL和KIM-1检测：采用ELISA方法，试剂为美国R & D公司的Human Lipocalin-2/NGAL Immunoassay和Human Serum TIM-1/KIM-1/HAVCR Immunoassay检测试剂盒。肌酐、CysC、RBP检测：使用美国贝克曼库尔特有限公司AU5800全自动生化仪检测。肌酐检测原理为酶法，CysC和RBP检测原理为免疫浊度法。检测试剂、定标品、质控品均与仪器配套。尿量计量：记录24 h时及之后每个研究观察时点为起点的24 h尿量（mL），以患儿每公斤（kg）每小时（h）的尿量报告（mL·kg^-1·h^-1）；记录脓毒症AKI-CRRT治疗组患儿超滤量（mL），以患儿每公斤（kg）每小时（h）的形式报告（mL·kg^-1·h^-1），并将两者相加。小样本量方法验证NGAL、KIM-1试剂盒提供的参考区间，纳入正常儿童均为“建立中国儿童临床常规检验指标参考区间”课题招募的正常体检儿童，符合伦理要求^[9]。检测纳入研究的22例正常儿童的血NGAL、KIM-1水平，如检测数据有离群值，剔除后补齐验证样本量。检测数据≤2个结果超出待验证区间，验证通过；检测数据 > 3个结果超出待验证区间，则需要检查分析程序，根据参考人群差异自建参考区间^[10]。

统计学分析  正态分布的计量资料用x±s表示，非正态分布的计量资料用中位数和四分位间距M（P₂₅，P₇₅）表示。分类资料统计使用χ²检验，组间比较用非参数检验k个独立样本Kruskal-Wallis H比较，脓毒症AKI-CRRT组各时点间的比较用Friedman非参数检验。使用受试者工作特征（ROC）曲线评价肌酐、尿量、NGAL、KIM-1、CysC和RBP对AKI患儿的诊断价值，取约登指数最大时的灵敏度和特异性。以双侧检验P < 0.05为差异有统计学意义。所有数据均使用SPSS 22.0软件分析，Graphad Prism8软件绘制箱式图。

临床资料  脓毒症AKI组28例，住院天数9~175天（M=23天）。脓毒症非AKI组41例，住院天数7~66天（M=25.5天）。脓毒症AKI组中进行CRRT治疗者18例，脓毒症AKI与非AKI患儿的临床信息见表 1。正常对照组：选取同期体检的健康儿童共22例（男性12例，女性10例），其中 < 1岁9例，1~4岁4例，5~9岁3例，≥10岁6例。正常对照组年龄和性别与病例组差异无统计学意义。

血NGAL、KIM-1参考区间验证  NGAL试剂盒参考区间42~177 ng/mL，检测数据41.18~57.98 ng/mL，均值（49.5±4.44）ng/mL，1例超出待验证区间，验证通过。KIM-1试剂盒参考区间0~56.9 pg/mL，检测数据14.04~52.39 pg/mL，均值（31.43±9.86）pg/mL，均未超出待验证区间，验证通过。采用验证通过的区间作为本研究的正常参考区间。

脓毒症AKI患儿各指标的检测结果  NGAL在脓毒症AKI组和脓毒症非AKI组各时点的检测水平均高于正常对照组，脓毒症AKI组显著高于脓毒症非AKI组（P均 < 0.05）。24 h、72 h时脓毒症AKI和非AKI患儿的KIM-1均高于正常对照组，这2个时点脓毒症AKI患儿的KIM-1显著高于脓毒症非AKI患儿（P均 < 0.05）。肌酐在3个时点、CysC和RBP在后2个时点时，脓毒症AKI组均明显高于非AKI组（P均 < 0.05，表 2）。

脓毒症AKI-CRRT组、脓毒症AKI-非CRRT组和脓毒症非AKI组各指标检测结果比较   0 h及之后各观察时点，NGAL、肌酐在脓毒症AKI-CRRT组和脓毒症AKI非CRRT组的检测水平均高于脓毒症非AKI组（P均 < 0.05）。KIM-1、CysC、RBP在24 h和72 h时，脓毒症AKI-CRRT组及非CRRT组患儿均高于脓毒症非AKI组（P均 < 0.05）。脓毒症AKI患者无论是否进行CRRT治疗，尿量均低于脓毒症非AKI组，CRRT治疗组24 h时点的尿量+超滤量高于非CRRT组（P均 < 0.05）。进行CRRT治疗的脓毒症AKI患儿，与0 h时点相比，肌酐在24 h显著升高，72 h较24 h明显下降（P均 < 0.05），NGAL、KIM-1、CysC在24 h显著升高后保持平稳（P均 < 0.05），尿量、RBP在各时点均无显著变化（图 1A~G）。

AKI:Acute kidney injury; CRRT:Continuous renal replacement therapy. 图 1 脓毒症AKI-CRRT组和非CRRT组及脓毒症非AKI组各检测指标的比较 Fig 1 Comparison of various biomarkers among sepsis AKI-CRRT group, sepsis AKI-non-CRRT group and sepsis non-AKI group

图选项

经CRRT治疗的脓毒症-AKI患儿各指标诊断价值比较  NGAL在0 h时的AUC面积最大（0.907），敏感度最高（92%），特异性最强（78.6%）。24 h时NGAL、KIM-1、肌酐和CysC均显示良好的诊断效能，NGAL仍显示了最高的敏感性（96%）和特异性（98.6%）。72 h时NGAL和KIM-1的诊断效能优于其他指标，两指标的AUC面积均 > 0.9，敏感度 > 90%，特异性87.1%，肌酐在72 h的的诊断敏感度降低至88%，特异性降至77.1%（P < 0.05）。RBP各时点的AUC面积均 < 0.8，敏感度≤60%（表 3）。

未经CRRT治疗的脓毒症AKI患儿各指标的诊断价值比较  比较脓毒症AKI-非CRRT治疗组ROC曲线，NGAL在0 h时AUC面积最大（0.951），敏感度最高（100%），特异性87.1%，肌酐在该时点的AUC面积较小（0.751），敏感度最低（42.9%）。24 h时NGAL、KIM-1、肌酐和CysC均显示良好的诊断效能，NGAL仍显示了最高的敏感度（100%）和特异性（98.6%）。72 h时除尿量外，其余各检测指标的AUC均 > 0.9（表 4）。

目前，有文献报道脓毒症合并AKI的机制是中性粒细胞、单核细胞以及血管内皮细胞发生复杂交错的免疫反应，肾小管在炎症细胞的浸润下，细胞发生自噬、凋亡以及坏死，最终造成肾小管受损而引发AKI^[11-13]。在众多新的生物标志物中，研究最多且最有临床应用前景的是NGAL和KIM-1。NGAL主要来源于中性粒细胞，少量表达于肾、脾、肝，与明胶酶B相关，相对分子质量为25 000^[14]。KIM-1是来源于肾脏近曲小管上皮细胞的I型膜糖蛋白，相对分子质量39 000^[15]。研究显示NGAL、KIM-1可对先天性心脏病患儿体外循环（cardiopulmonary bypass，CPB）术后诱发的AKI进行预测和诊断^[16-17]。近年来的研究认为这2个生物大分子标志物对脓毒症、接受冠状动脉造影的急性冠脉综合征或心力衰竭患者、泌尿系统疾病所致AKI有较好的早期诊断价值^[18-21]。

在0 h、24 h、72 h的动态监测中发现：脓毒症AKI组的NGAL、KIM-1水平均明显高于非AKI患儿和正常对照组。当机体发生脓毒症时，在细菌内毒素的刺激下释放出大量内源性的炎症介质，不仅对肾小管造成不同程度的损伤，从而导致AKI的发生，还会促进肾小管上皮细胞产生NGAL，因此脓毒症引发AKI时NGAL明显升高^[22-24]。KIM-1来源于肾小管上皮细胞，在上皮细胞损伤时表达增强，且持续至上皮细胞修复^[25]。研究认为AKI引发了ERK1/2、STAT3磷酸化，STAT3与KIM-1启动子结合，增加其mRNA和蛋白质水平，KIM-1细胞外结构域的脱落导致血液或尿液中KIM-1水平大大增加^[26]。国外有研究显示，检测尿NGAL易受尿液中白细胞的干扰影响，因此本研究采用血液标本替代尿液标本。

本研究中有18例脓毒症AKI组患儿在诊断AKI后进行了CRRT。0 h时脓毒症AKI-CRRT组和脓毒症AKI-非CRRT组的NGAL和肌酐水平都明显高于脓毒症非AKI组；两组脓毒症AKI患儿中，NGAL的AUC面积均最大（分别为0.907和0.951），敏感度最高（分别为92%和100%），特异性强（分别为78.6%和87.1%），对脓毒症AKI的诊断效能优于其他指标。国内研究报道，成人脓毒症患者NGAL预测AKI较肌酐可至少提前6 h^[27-29]，在儿童中NGAL预测AKI的时间可提早24 h^[30-31]。张辉等^[32]对92例儿童AKI标志物的研究显示，虽在达到AKI诊断标准时肌酐的诊断特异性最好，但血肌酐的变化往往滞后于肾功能的改变，当肌酐升高程度达到诊断标准时，患儿病情已较为严重，因此肌酐的变化对AKI的早期诊断缺乏高敏感性。由于0 h时无法计算尿量，借助尿量诊断AKI需要一定的观察时间，所以依靠尿量对AKI的诊断存在滞后。0 h时CysC、RBP水平在脓毒症AKI-CRRT组、脓毒症AKI-非CRRT组和脓毒症非AKI组3组间比较均没有显著差异，提示CysC与RBP无法在早期有效区分脓毒症是否合并AKI。NGAL在疾病早期显著增高，因此临床检测NGAL可以更早地帮助预警AKI的发生，从而达到尽早干预的目的。

在行CRRT治疗的AKI患儿各时点的动态监测中观察到：72 h与24 h肌酐水平相比呈现下降趋势，并且72 h较24 h肌酐的AUC面积减小、敏感度和特异性均降低；而NGAL、KIM-1分别在24 h显著升高后，至72 h仍维持在较高水平，且NGAL在3个时点和KIM-1在后2个时点均维持良好的诊断效能。而脓毒症AKI组中未行CRRT治疗的患儿，各指标在72 h与24 h相比，AUC面积、敏感度和特异性均没有明显的变化。分析认为：目前临床应用的CRRT滤器均采用高通量滤器，其对溶质清除截点（cut off）为20 000~250 000，这5个生物标志物的相对分子质量（M_r）从小到大依次为：肌酐（113） < CysC（13 000） < RBP（21 000） < NGAL（25 000） < KIM-1（39 000）^[33]。可见在CRRT治疗过程中，“金标准”肌酐易被滤过，从而不能反映肾功能真实情况。而NGAL和KIM-1的相对分子质量均 > 20 000，理论上在CRRT治疗进程中不易被清除，从而继续维持相对稳定的高水平表达。CysC和RBP的相对分子质量与清除截点接近，也可能受到一定的影响。尿量在脓毒症AKI-CRRT治疗组和非CRRT治疗组比较结果没有显著差异，但当将尿量加上CRRT治疗过程中滤出体内的超滤量，24 h时脓毒症AKI-CRRT组则高于非CRRT组。可见，CRRT治疗期间由于应用了超滤模式替代肾脏排尿功能，患儿实际产生的尿量与其真实的肾功能不相符，所以无法在行CRRT过程中应用尿量反映肾功能真实情况。如需通过尿量反映AKI病情的进展，则要等待治疗间隙观察后再作评估，显然尿量无法与治疗保持同步的测量。与此同时，脓毒症采用集束化治疗，临床应用药物（如利尿剂）、透析等方式均有可能干扰诊断的效率。从脓毒症AKI-CRRT组ROC曲线比较结果来看，NGAL在3个时点、KIM-1在后2个时点均保持较高敏感性及特异性，验证了大分子标志物NAGL和KIM-1能够更有效地反映CRRT治疗后肾功能的真实情况^[34-36]。

本研究的不足之处是儿童脓毒症病例数较少，仅为小样本量研究，得到的是初步结果，后续拟增大样本量进一步研究NGAL和KIM-1的诊断价值。

综上所述，重症患儿且同时诊断脓毒症和AKI时病情复杂并发展迅速，病程中多个生物标志物的动态监测显示NGAL灵敏度高，对AKI的发生可能起到早期提示作用，而在血液净化的治疗过程中NGAL和KIM-1受干扰因素较少，可对这些患儿肾功能真实水平的评估提供更多的诊断指标。

作者贡献声明  徐佳音 论文构思，执行实验，数据采集，统计分析，撰写和修订论文。朱海燕 文献调研和整理，执行实验，数据采集。徐锦 研究指导，论文修订。

利益冲突声明  所有作者均声明不存在利益冲突。