2021, Vol. 48
2. 上海市精神卫生中心 上海 200030;
3. 上海市徐汇区精神卫生中心 上海 200232;
4. 上海市青浦区精神卫生中心 上海 201721
2. Shanghai Mental Health Center, Shanghai 200030, China;
3. Xuhui District Mental Health Center of Shanghai, Shanghai 200232, China;
4. Qingpu District Mental Health Center of Shanghai, Shanghai 201721, China
精神分裂症（schizophrenia，SCZ）是一种重度精神疾病，发病率约为1%，与普通人相比，其伴发躯体疾病的风险更高，预期寿命大大减少[1]。有证据表明，SCZ患者并发2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）的遗传风险增加，即使没有使用抗精神病药物，SCZ患者并发T2DM的患病率也比普通人高2~3倍[2]。缺乏身体锻炼、不良饮食习惯、遗传因素和抗精神病药物治疗等是SCZ并发糖尿病的相关因素[3]。而且，SCZ患者出现糖尿病并发症的风险高于单纯糖尿病患者[4]，是增加SCZ死亡率的重要躯体疾病因素[5]。
五羟色胺2C受体（serotonin 2C receptor，5-HTR2C）属于G蛋白偶联受体家族，主要分布于中枢神经系统[6]。5-HTR2C是SCZ治疗的新靶点，越来越多的研究表明，5-HTR2C与第二代抗精神病药物所致的体重增加有关[7]，动物实验表明敲除5-HT2C基因，小鼠表现出摄食增多和体质量增加[8]；遗传药理学研究提示，5-HTR2C基因是抗精神病药物导致体重增加的易感基因，且发现其单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）位点-759C/T和-697G/C与体重增加有关[9]。因此，5-HTR2C可能是抗精神病药物导致的T2DM的易感基因。目前国内外关于5-HTR2C基因多态性的研究主要针对抗精神病药物所致的糖尿病或代谢综合征的遗传易感性，未见5-HTR2C基因多态性与SCZ和糖尿病的关联分析。本课题组前期曾开展相关研究，初步发现rs498177位点多态性与SCZ患者并发T2DM相关[10-11]，本研究进一步选取5-HTR2C基因有阳性报道的[12]SNP位点rs2192371和rs5988072，通过病例对照研究探讨5-HTR2C基因多态性与SCZ患者并发T2DM的关联性。选择长期住院的服用氯氮平的慢性SCZ患者为研究对象，不同分组患者饮食习惯和康复锻炼基本相仿，服用氯氮平可在一定程度上排除药物的干扰，分析遗传因素对SCZ和T2DM的影响。
资料和方法研究对象
共病组 即SCZ伴发T2DM组，来自2014—2015年上海市精神卫生中心的慢性住院患者。入组标准:（1）年龄为18~65岁的中国汉族人群；（2）符合DSM-Ⅳ（美国精神障碍诊断与统计手册第4版）中精神分裂症的诊断标准；（3）总病程大于5年；氯氮平使用时间大于2年；（4）符合2013版美国糖尿病协会（American Diabetes Association，ADA）T2DM的临床诊断标准。
单纯SCZ组 即SCZ不伴发T2DM组，来自2014—2015年上海市精神卫生中心、虹口区精神卫生中心、徐汇区精神卫生中心、青浦区精神卫生中心的慢性住院患者。入组标准:（1）年龄为18~65岁的中国汉族人群；（2）符合DSM-Ⅳ精神分裂症的诊断标准；（3）总病程大于5年；氯氮平使用时间大于2年；（4）排除符合2013版ADA中T2DM的临床诊断者。
单纯T2DM组 即不伴发精神疾病的T2DM组，来自2014—2015年上海市青浦区中心医院内分泌科的患者。入组标准:（1）年龄为18~65岁的中国汉族人群，男女不限；（2）符合2013版ADA中2型糖尿病的临床诊断标准；（3）患者本人对该研究知情同意且签署知情同意书。排除标准:符合DSM-Ⅳ诊断的有神经系统疾病病史或其他重大躯体疾病病史者，以及精神疾病或精神疾病家族史者。
对照组 来自2014—2015年上海市青浦区中心医院和2017—2018年虹口区中心医院体检的正常人群。入组标准:年龄为18~65岁的中国汉族人群；男女不限。排除标准:（1）符合DSM-Ⅳ精神疾病的临床诊断标准者；（2）符合2013版ADA 2型糖尿病的临床诊断标准者；（3）有神经系统疾病病史及其他重大躯体疾病病史者。
本研究获上海市精神卫生中心伦理审查委员会批准（SHMC-IRB）。入组对象或其监护人均对本研究知情同意，且签署书面知情同意书。
研究方法
一般人口学资料 收集共病组及单纯SCZ组的性别、年龄、总病程、总住院时间及氯氮平服用的时间和剂量等信息。
SNP位点的选择 根据HapMap数据库（release #20c.1，www.hapmap.org）中的CHB（中国北京汉族人群，Chinese Han origin in Beijing）数据进行选择，针对5-HTR2C基因及其上游的10 kb序列，通过连锁不平衡系数 > 0.8，微小等位基因频率 > 20%，并结合现有文献的阳性结果进行挑选，最后挑选出2个SNP位点，即rs2192371和rs5988072。
DNA提取 采集4组研究对象静脉血各2 mL，2%乙二胺四乙酸（2%EDTA）抗凝，分离白细胞，用血液基因组DNA提取试剂盒提取DNA保存于-80 ℃的冰箱备用。
基因分型检测 采用Taqman探针SNP基因分型技术对rs2192371和rs5988072位点进行分型。实验所需SNP Genotyping Product试剂盒（包括探针和引物）和TaqMan SNP Genotyping MasterMix试剂盒（含有AmpliTaq Gold DNA聚合酶、dNTP和PCR缓冲液）均购自美国ABI公司。PCR反应体系为5 μL，包括模板DNA 20 ng，40×SNP Assay（包括引物和FAM/VIC探针）0.05 μL，TaqMan PCR Master mix 2.0 μL。PCR反应条件为:95 ℃ 10 min预变性；92 ℃ 15 s，60 ℃ 1.5 min，40个循环，25 ℃保存。PCR反应及荧光信号读取均在7900实时定量荧光PCR仪（美国ABI公司）上进行。使用序列检测系统（SDS 2.2）图像分析软件Allelic Discrimination程序进行基因型分析。通过检测不同等位基因所带的报告荧光VIC和淬灭荧光FAM荧光强度，判断各待测样本为纯合子或杂合子。如果只有VIC或FAM荧光增强的样本，其SNP分型为纯合子；如果VIC和FAM同时增强，则为杂合子。
统计学处理 采取SPSS 12.0统计学软件进行统计学处理，验证数据符合正态分布及方差齐性后，计数资料应用χ2检验；年龄等计量资料采用t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。本研究运用SHEsis（http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php）统计软件对SNP位点（rs2192371、rs5988072）的等位基因和基因型及单体型数据进行统计分析，通过计算比值比（odds ratio，OR）与95%置信区间（95%CI）以了解等位基因和疾病的关联强度（OR值> 1表示该因素是一个危险因素；OR值< 1表示该因素是一个保护因素），并对各组间基因型频率分布进行Hardy-Weinberg平衡吻合度检验。
使用Quanto软件进行样本量统计效能检验，两个SNPs当中rs2192371的最小等位基因频率（MAF=0.358）最小，假设OR=1.5、加性模式、疾病一般人群患病率为1%，计算得出统计效能为0.99。
结果一般人口学资料及临床特征的比较 共病组257例，其中男性130例，女性127例；平均年龄（55.01±7.41）岁；平均病程（23.01±4.31）年。单纯SCZ组288例，其中男性143例，女性145例；平均年龄（54.22±8.39）岁；平均病程（22.71±5.12）年。单纯T2DM组264例，其中男性133例，女性131例；平均年龄（52.53±11.59）岁。正常对照组625例，其中男性318人，女性307人；平均年龄（39.82±12.18）岁。共病组（t=-24.80，P < 0.001）、单纯SCZ组（t= -21.33，P < 0.001）、单纯T2DM组（t=-14.42，P < 0.001）与对照组比较，年龄差异均有统计学意义；共病组与单纯SCZ组比较，年龄差异有统计学意义（t=4.18，P < 0.001）。4组研究对象之间性别差异无统计学意义。共病组和单纯SCZ组中患者的总病程、总住院时间、氯氮平使用时间以及服用氯氮平剂量之间的差异均无统计学意义（表 1）。
| (n or x±s) | |||||||||||||||||||||||||||||
| Item | Comorbidity group （n=257） |
SCZ group（n=288） | T2DM group （n=264） |
Healthy control group（n=625） | |||||||||||||||||||||||||
| Sex（M/F） | 130/127 | 143/145 | 133/131 | 318/307 | |||||||||||||||||||||||||
| Age（y） | 55.01±7.41(1)(2) | 54.22±8.39(1) | 52.53±11.59(1) | 39.82±12.18 | |||||||||||||||||||||||||
| Course of SCZ (y) | 23.01±4.31 | 22.71±5.12 | |||||||||||||||||||||||||||
| Time in hospital (y） | 15.24±3.25 | 14.96±4.13 | |||||||||||||||||||||||||||
| Clozapine dose (mg) | 227.76±90.07 | 215.80±85.83 | |||||||||||||||||||||||||||
| Duration of clozapine administration（mo） | 120.45±14.28 | 118.67±17.13 | |||||||||||||||||||||||||||
| SCZ:Schizophrenia; T2DM:Type 2 diabetes mellitus.(1)vs. Healthy control group, P < 0.001;(2)vs. SCZ group, P < 0.001. | |||||||||||||||||||||||||||||
Hardy-Weinberg平衡吻合度检验 共病组、单纯T2DM组、单纯SCZ组及对照组的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P > 0.05）。
Rs2192371位点、rs5988072位点基因型、等位基因分布比较 共病组与对照组比较，rs2192371（χ2=19.799，df=2，P < 0.001；χ2=7.437，df=1，P=0.006）和rs5988072（χ2=28.682，df=2，P < 0.001；χ2=24.127，df=1，P < 0.001）基因型频率和等位基因频率分布差异均有统计学意义；单纯T2DM组与对照组比较，rs2192371基因型频率分布差异有统计学意义（χ2=13.715，df=2，P=0.001），而等位基因频率分布差异无统计学意义（χ2=0.774，df=1，P=0.379），rs5988072等位基因和基因型频率分布差异均有统计学意义（χ2=11.378，df=2，P=0.003；χ2=7.142，df=1，P=0.007）。单纯SCZ组与对照组相比，rs2192371基因型频率及等位基因频率分布差异均无统计学意义（χ2=1.881，df=2，P=0.39；χ2=0.313，df=1，P=0.575），rs5988072组间基因型频率分布差异为边缘性（χ2=6.026，df=2，P=0.049），而等位基因频率分布虽然有差异（χ2=4.964，df=1，P=0.025），但经过Bonforrnie校正后无差异。在SCZ患者中，共病组与单纯SCZ组相比rs2192371（χ2=11.279，df=2，P=0.003；χ2=8.061，df=1，P=0.004）和rs5988072（χ2=7.013，df=2，P=0.030；χ2=5.931，df=1，P=0.014）基因型频率和等位基因频率分布差异均有统计学意义（表 2）。
| [n (%)] | |||||||||||||||||||||||||||||
| Gene locus | Genotypes frequency（%） | χ2 (Pvalue) |
Allele gene frequencies（%） | OR (95%CI) | χ2 (P) |
||||||||||||||||||||||||
| 11 | 12 | 22 | 1 | 2 | |||||||||||||||||||||||||
| rs2192371 (A > G) | |||||||||||||||||||||||||||||
| Comorbidity group (n=257) |
166 (65.1) | 28 (11.0) | 61 (23.9) | 19.799 (0.000)a |
360 (70.6) | 150 (29.4) | 1.363 (1.091-1.704)a |
7.437(0.006)a | |||||||||||||||||||||
| SCZ group (n=288) |
150 (52.0) | 57 (20.0) | 79 (28.0) | 1.881 (0.390)a |
357 (62.4) | 215 (37.6) | 0.943 (0.768-1.158)a |
0.313(0.575)a | |||||||||||||||||||||
| T2DM group (n=264) |
157 (59.7) | 33 (12.5) | 73 (27.8) | 13.715 (0.001)a |
347 (66.0) | 179 (34.0) | 1.101 (0.888-1.364)a |
0.774(0.379)a | |||||||||||||||||||||
| Healthy control group (n=625) |
321 (52.0) | 145 (23.5) | 151 (24.5) | 11.279 (0.003)b |
787 (63.8) | 447 (36.2) | 1.445 (1.120-1.864)b |
8.061(0.004)b | |||||||||||||||||||||
| rs5988072 (C > T) | |||||||||||||||||||||||||||||
| Comorbidity group (n=257) |
137 (54.4) | 36 (14.3) | 79 (0.313) | 28.682 (0.000)a |
310 (61.5) | 194 (38.5) | 1.693 (1.371-2.091)a |
24.127(0.000)a | |||||||||||||||||||||
| SCZ group (n=288) |
126 (0.438) | 60 (0.208) | 102 (0.354) | 6.026 (0.049)a |
312 (0.542) | 264 (0.458) | 1.252 (1.027-1.526)a |
4.964(0.025)a | |||||||||||||||||||||
| T2DM group (n=264) |
123 (0.466) | 47 (0.178) | 94 (0.356) | 11.378 (0.003)a |
293 (0.555) | 235 (0.445) | 1.321 (1.076-1.621)a |
7.142(0.007)a | |||||||||||||||||||||
| Healthy control group (n=625) |
221(0.356) | 161(0.259) | 239 (0.385) | 7.013 (0.030)b |
603 (0.486) | 639 (0.514) | 1.352 (1.060-1.724)b |
5.931(0.014)b | |||||||||||||||||||||
| 1:A or C；2:G or T.a:Compared the normal control group with the other three groups; b:Compared the comorbidity group with SCZ group. | |||||||||||||||||||||||||||||
连锁不平衡分析及单体型遗传关联分析 为了解5-HTR2C基因2个遗传标记位点间的连锁不平衡情况，我们运用Haploview软件对2个SNP位点（rs2192371、rs5988072）进行连锁不平衡（linkage disequilibrium，LD）分析。用D’值或r2值来度量各位点间连锁不平衡的程度。结果显示:在共病组、单纯SCZ组、单纯T2DM组有2个位点显示强连锁不平衡，考虑形成单体型。单体型分析显示:共病组和单纯SCZ组之间，由rs2192371-rs5988072组成的单体型AC（OR=1.351，χ2=5.841，P=0.015）和GT（OR=0.692，χ2=7.592，P=0.004）差异有统计学意义，单体型AT差异无统计学意义（OR=1.111，χ2=0.237，P=0.626）。共病组和单纯T2DM组比较，两组间单体型AC（OR=1.281，χ2=3.8，P=0.051）、GT（OR=0.808，χ2=2.497，P=0.114）和AT（OR=0.854，χ2=0.568，P=0.451）差异均无统计学意义（表 3）。
| Haplotype | Comorbidity group (n=257) | SCZ group (n=288) | T2DM group (n=264) |
| AC（%） | 305.90 (0.609) | 308.97 (0.540) | 290.97 (0.553) |
| OR (95%CI) | - | 1.351 (1.058-1.725) | 1.281 (0.998-1.644) |
| χ2 (P) | - | 5.841 (0.015)a | 3.800 (0.051)b |
| AT（%） | 46.10 (0.092) | 48.03 (0.084) | 56.03 (0.107) |
| OR (95%CI) | - | 1.111 (0.728-1.696) | 0.854 (0.566-1.288) |
| χ2 (P) | - | 0.237 (0.626) | 0.568 (0.451) |
| GT（%） | 145.90 (0.291) | 213.97 (0.374) | 177.97 (0.338) |
| OR (95%CI) | - | 0.692 (0.535-0.894) | 0.808 (0.620-1.053) |
| χ2 (P) | - | 7.952 (0.004)a | 2.497 (0.114)b |
| a:Compared the comorbidity group with the SCZ group; b:Compared the comorbidity group with T2DM group. | |||
本研究纳入的共病组、单纯SCZ组、单纯T2DM组以及对照组均符合Hardy-Weinberg平衡，因此可以进行相关数据的比较。研究显示单纯SCZ组和共病组在年龄、病程、使用氯氮平剂量和时间以及住院时间等方面差异均无统计学意义，表明匹配性良好。基因分型结果单位点分析显示:共病组与对照组比较，rs2192371和rs5988072等位基因和基因型频率分布差异均有统计学意义；单纯T2DM与对照组比较，rs2192371基因型频率分布差异有统计学意义，rs5988072等位基因和基因型频率分布差异均有统计学意义。单纯SCZ与正常对照相比，rs2192371组间差异无统计学意义，rs5988072组间基因型频率分布差异有边缘性统计学意义。而在SCZ患者中，共病组与单纯SCZ组相比，rs2192371和rs5988072差异均有统计学意义。单体型分析显示:共病组与单纯SCZ组比较，AC单体型能增加SCZ共病糖尿病的风险（OR=1.351）。而GT单体型能降低SCZ共病糖尿病的风险（OR=0.692）。结果表明:5-HTR2C基因rs2192371和rs5988072可能既是糖尿病的易感基因，又是糖尿病伴发SCZ的易感基因。rs2192371和rs5988072位点位于5-HTR2C基因的内含子区域（来自http://www.ncbi.nlm.nih.gov/site/），研究表明内含子是正常发育过程中基因表达程序的核心组成部分，也是对压力和疾病的反应[13]。作为内含子的rs2192371和rs5988072可能通过调控mRNA的转录和蛋白质的表达间接地影响基因的表达，从而对SCZ或T2DM产生影响；这2个SNP位点存在强连锁不平衡，通过对其形成的单倍体分析显示:AC单体型能增加共病风险，GT单体型降低共病风险，进一步验证了rs2192371和rs5988072可能是SCZ和糖尿病的易感基因，从而间接影响基因表达。我们前期的研究[10]也证明，5-HTR2C基因的内含子rs498177位点可能也是SCZ和糖尿病的易感基因。由此可见，5-HTR2C基因的内含子可能间接调控基因表达，从而对糖代谢产生影响。
最近一项国内的Meta分析[14]发现，5-HTR2C启动子区的功能多态性-759C/T（rs3813929）与抗精神病药物所致体重增加存在显著的遗传相关性，T等位基因的患者发生抗精神病药物所致体重增加的可能性较小。类似的研究[15]也发现，5-HTR2C基因-759位点T等位基因对第二代抗精神病药物所致的女性精神分裂症患者体重增加具有保护作用。Bai等[16]的研究也发现-759C/T多态性与精神分裂症患者抗精神病药物所致肥胖无关。精神分裂症本身被认为是糖尿病的致病因素，因为在首发精神分裂症且未服用抗精神病药物的患者中，糖尿病患病率较高[17]。这些证据都从侧面印证了SCZ患者存在糖尿病的易感基因。Hackinger等[18]对希腊人群中单纯SCZ患者924例、单纯T2DM患者822例、共病组患者505例以及正常对照人群1 125名进行全基因组关联研究（GWAS），结果表明SCZ和T2DM共病部分存在着共同的遗传机制，与我们的研究结果基本一致。
本研究局限性在于:（1）样本量有限。SCZ是多基因疾病，由于微效效应（minor effect）的原因，其单一基因的分析需要进行大样本分析。（2）本研究是单一基因的分析，未检测其他功能相关基因。最好同时检测其他可能的功能相关基因，否则可能会由于所研究的单一基因的作用效应微小而被忽略。（3）未设SCZ患者合并T2DM但未用药组。今后有待进一步完善研究。
作者贡献声明 郭向晴 论文构思，数据采集，基因分型，论文撰写和修订。赵静，易正辉，吕钦瑜 基因分型实验，论文构思和修订。赵静，黄欣欣 数据统计和分析，论文修订。介勇，朱光，徐阿红，杨隽渊，李君，汪晓辉 病例收集及论文修订。
利益冲突声明 所有作者均声明不存在利益冲突。
| [1] |
IACOVIDES A, SIAMOULI M. Comorbid mental and somatic disorders:an epidemiological perspective[J]. Curr Opin Psychiatry, 2008, 21(4): 417-421.
[DOI]
|
| [2] |
DIXON L, WEIDEN P, DELAHANTY J, et al. Prevalence and correlates of diabetes in national schizophrenia samples[J]. Schizophr Bull, 2000, 26(4): 903-912.
[DOI]
|
| [3] |
HOLT RIG, BUSHE C, CITROME L. Diabetes and schizophrenia 2005:are we any closer to understanding the link?[J]. J Psychopharmacol, 2005, 19(6 suppl): 56-65.
|
| [4] |
WU CS, LAI MS, GAU SF. Complications and mortality in patients with schizophrenia and diabetes:Population-based cohort study[J]. Br J Psychiatry, 2015, 207(5): 450-457.
[DOI]
|
| [5] |
BROWN S, INSKIP H, BARRACLOUGH B. Causes of the excess mortality of schizophrenia[J]. Br J Psychiatry, 2000, 177: 212-217.
[DOI]
|
| [6] |
SPOIDA K, MASSECK OA, DENERIS ES, et al. Gq/5-HT2c receptor signals activate a local GABAergic inhibitory feedback circuit to modulate serotonergic firing and anxiety in mice[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2014, 111(17): 6479-6484.
[DOI]
|
| [7] |
PALACIOS JM, PAZOS A, HOYER D. A short history of the 5-HT2C receptor:from the choroid plexus to depression, obesity and addiction treatment[J]. Psychopharmacology (Berl), 2017, 234(9-10): 1395-1418.
[DOI]
|
| [8] |
LORD CC, WYLER SC, WAN R, et al. The atypical antipsychotic olanzapine causes weight gain by targeting serotonin receptor 2C[J]. J Clin Invest, 2017, 127(9): 3402-3406.
[DOI]
|
| [9] |
LAIKA B, LEUCHT S, HERES S, et al. Pharmacogenetics and olanzapine treatment:CYP1A2*1F and serotonergic polymorphisms influence therapeutic outcome[J]. Pharmacogenomics J, 2010, 10(1): 20-29.
[DOI]
|
| [10] |
汪晓晖, 郭向晴, 鲍晨曦, 等. 精神分裂症患者5-羟色胺2C受体基因多态性与2型糖尿病共病的关联研究[J]. 临床精神医学杂志, 2017, 27(3): 153-156. [DOI]
|
| [11] |
郭向晴.5-HTR_(2C)基因多态性与精神分裂症伴发2型糖尿病的关联分析[D].上海交通大学, 2016.
|
| [12] |
TANG WK, TANG N, LIAO CD, et al. Serotonin receptor 2C gene polymorphism associated with post-stroke depression in Chinese patients[J]. Genet Mol Res, 2013, 12(2): 1546-1553.
[DOI]
|
| [13] |
JACOB AG, SMITH CWJ. Intron retention as a component of regulated gene expression programs[J]. Hum Genet, 2017, 136(9): 1043-1057.
[DOI]
|
| [14] |
CHEN Y, WANG Y, FANG X, et al. Association of the HTR2C-759C/T polymorphism and antipsychotic-induced weight gain:a meta-analysis[J]. Gen Psychiatr, 2020, 33(3): e100192.
[DOI]
|
| [15] |
DARAY FM, RODANTE D, CAROSELLA LG, et al. -759C > T polymorphism of the HTR2C gene is associated with second generation antipsychotic-induced weight gain in female patients with schizophrenia[J]. Pharmacopsy-chiatry, 2017, 50(1): 14-18.
|
| [16] |
BAI YM, CHEN TT, LIOU YJ, et al. Association between HTR2C polymorphisms and metabolic syndrome in patients with schizophrenia treated with atypical antipsychotics[J]. Schizoph Res, 2011, 125(2): 179-186.
|
| [17] |
MAMAKOU V, THANOPOUIOU A, GONIDAKIS F, et al. Schizophrenia and type 2 diabetesmellitus[J]. Psychiatriki, 2018, 29(1): 64-73.
[DOI]
|
| [18] |
HACKINGER S, PRINS B, MAMAKOU V, et al. Evidence for genetic contribution to the increased risk of type 2 diabetes in schizophrenia[J]. Transl Psychiatry, 2018, 8(1): 252.
[DOI]
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