2019, Vol. 46
2. 上海市静安区中心医院普外科 上海 200040
2. Department of General Surgery, Jing'an District Central Hospital, Shanghai 200040, China
胃癌是常见的恶性肿瘤, 是癌症死亡的第二大原因。随着诊断技术和治疗手段的进步, 胃癌的死亡人数在一定程度上有所下降, 但仍是威胁人类生命健康的严重疾病[1]。据统计我国每年胃癌新发病例中, 大多数患者处于胃癌晚期, 5年生存率不足20%[2]。因此, 寻找胃癌早期诊断和治疗方法, 是提高生存率的关键。胃癌的发生、发展和转移等过程相当复杂, 涉及到癌基因, 抑癌基因和非编码基因等, 而非编码基因现已经被逐步认识, 并在癌症的发生、发展中具有重要作用[3]。微小RNA(miRNA)是一种非编码RNA家族, 长度为20~22个核苷酸不等, 并且发现其参与调节多种生物学过程, 包括细胞增殖, 分化, 迁移和凋亡等, 其参考肿瘤发生、发展的生物学过程备受关注[4-5]。miR-128在肿瘤中的表达与肿瘤发生、发展有密切关系。我们通过研究miRNA-128a和miRNA-128b在胃癌组织中的表达, 发现其可作为早期诊断和预后的指标, 现报告如下。
资料和方法临床资料 选择2015年1月至2017年1月在复旦大学附属华山医院就诊且经病理确诊的胃癌患者118例, 为胃癌组。其中男性75例, 女性43例, 年龄45~79岁, 平均(61.56±13.54)岁。根据美国癌症联盟委员会(AJCC)第七版胃癌肿瘤TNM分期:Ⅰ期21例, Ⅱ期26例, Ⅲ期60例, Ⅳ期11例; 根据分化程度分为低分化81例, 中、高分化37例。纳入标准:均经胃镜检查, 并活检确证为胃癌; 均知情同意, 签署知情同意书。排除标准:合并其他肿瘤; 有免疫性疾病或者血液性疾病; 合并肝炎, 结核和肺部感染等感染性疾病; 不能耐受手术、围手术期死亡或者不愿意接受随访; 术前采取化疗和放疗等措施; 临床资料不完整。选择同期在我院病理诊断为胃息肉的患者75例, 为胃息肉组, 男性48例, 女性27例, 年龄45~79岁, 平均(61.86±11.38)岁。另外选择同期在我院行健康体检者45例, 为健康对照组, 男性27例, 女性18例, 年龄45~79岁, 平均(60.67±15.37)岁。3组年龄、性别等一般资料匹配。本研究经复旦大学附属中山医院伦理委员会批准通过。
血液标本的抽取 患者入院及手术后2周取清晨空腹肘静脉血约10 mL, 在4 ℃的条件下放置30 min, 低速离心20 min (1 800 r/min, r=15 cm), 去上清液, 将其放置于-70 ℃冰箱中保存。
qRT-PCR检测 根据GenBank中的miRNA-128a、miRNA-128b和U6的序列号, 并用Premier Primer5.0软件进行引物设计。miRNA-128a引物序列, 上游:5’-ACACTCCAGCTGGGTCACAGT-GAACCG-3’, 下游:5’-CCCAAGCTTATGAAGC-CAAATGATGCAAAAT-3’; miRNA-128b引物序列, 上游:5’-TGTTCTTAAGGCTAGGGAACCA-3’, 下游:5’-CCGGAATTCCGGCCGTCAGGCAG-TCTTCAGC-3’; U6引物序列, 上游:5’-CTCGCT-TCGGCAGCACA-3’, 下游:5’-AACGCTTCACG-AATTTGCGT-3’。反向引物为试剂盒自带。qRT-PCR的总反应体系为25 μL, 包括上下游引物各1.0 μL(其浓度为10 μmmol/L), cDNA为0.8 μL, RNaseH2O为12.2 μL和SYBRPPrimix Ex TaqTM 10 mL。反应条件为:预变性95 ℃ 10 min, 95 ℃ 5 s和60 ℃ 60 s, 共40个循环。在60 ℃下用ABI7700软件收集荧光信号进行溶解曲线分析, 每个样品进行3个平行复孔, 采用绝对定量法进行测定, 用1 mol/L的人工合成miRNA分别稀释成浓度106、105、104、103和102 fmol/L作为标准品, 以浓度对数为X轴, 以对应的Ct值为Y轴, 绘制成标准曲线, 并根据标准曲线计算出miRNA-128a和miRNA-128b的绝对含量。
观察指标 比较胃癌组与健康对照组血清miRNA-128a和miRNA-128b水平的变化及术前术后的变化, 胃癌患者血清miRNA-128a和miRNA-128b水平与临床病理指标和预后的关系, 及其在诊断早期胃癌的灵敏度和特异性。
统计学分析 采用SPSS 11.0统计软件进行数据分析, 正态分布的计量资料采用x±s表示, 多组比较采用方差分析, 多组两两比较采用SNK-q检验, 两组治疗前后比较采用配对t检验, 两组比较采用t检验。计数资料采用率进行表示, 率的比较采用χ2检验。采用Logistic二元回归分析得出miRNA-128a和miRNA-128b水平联合变量诊断胃癌和2年内死亡发生情况, 绘制出受试者曲线(ROC)评价诊断的灵敏度和特异性。检验水准α=0.05。
结果各组血清miRNA-128a和miRNA-128b表达的变化 从表 1可知, 胃癌组血清miRNA-128a表达水平明显高于胃息肉组(q=26.388, P < 0.01)和健康对照组(q=32.195, P < 0.01), 手术后较术前明显降低(t=14.321, P < 0.01), 胃息肉组明显高于健康对照组(q=7.198, P < 0.01);而胃癌组血清miRNA-128b表达水平明显低于胃息肉组(q=211.148, P < 0.01)和健康对照组(q=249.984, P < 0.01), 手术后较术前明显升高(t=15.139, P < 0.01), 胃息肉组明显低于健康对照组(q=38.232, P < 0.01)。
| Groups | Cases (n) |
miRNA-128a (fmol/L) |
miRNA-128b (fmol/L) |
| Healthy control | 45 | 55.34±12.98 | 248.35±80.70 |
| Gastric polyp group | 75 | 62.71±9.73 | 210.30±42.38 |
| Gastric cancer group | 118 | 88.45±23.71 | 122.84±52.36 |
| Gastric cancer after surgery | 118 | 52.37±13.67 | 238.49±64.38 |
血清miRNA-128a和miRNA-128b诊断胃癌的效能 从表 2和图 1可知, 血清miRNA-128a和miRNA-128b表达水平对诊断胃癌具有较高的灵敏度和特异性, 两指标进行二元回归得方程Y=0.078×XmiRNA-128a -0.042×XmiRNA-128b+2.294, 联合检测的灵敏度为78.8%, 特异性为97.3%, 曲线下面积明显高于单个指标miRNA-128a(Z=3.436, P < 0.01)和miRNA-128b(Z=2.658, P < 0.01), 而miRNA-128a和miRNA-128b之间差异无统计学意义。
| Detection | Optimal cut off | Sensitivity (%) | Specificity (%) | AUC | 95%CI |
| miRNA-128a (fmol/L) | ＞76.83 | 70.3 | 96.0 | 0.864 | 0.807-0.909 |
| miRNA-128b (fmol/L) | ≤170.35 | 78.0 | 86.7 | 0.904 | 0.853-0.941 |
| Combined detection | - | 78.8 | 97.3 | 0.946 | 0.904-0.973 |
|
| 图 1 血清miRNA-128a和miRNA-128b诊断胃癌的ROC曲线 Fig 1 ROC curve of serum miRNA-128a and miRNA-128b expression in the diagnosis of gastric cancer |
胃癌患者血清miRNA-128a和miRNA-128b与临床指标的关系 从表 3可知胃癌患者血清miRNA-128a和miRNA-128b表达水平与性别、年龄和肿瘤直径无明显相关性, 而与肿瘤细胞分化程度、TNM分期、淋巴结转移和浸润深度具有显著相关性(P < 0.01)。
| Clinical parameters | Cases (n) | miRNA-128a (fmol/L) | miRNA-128b (fmol/L) | |||||
| x±s | t | P | x±s | t | P | |||
| Gender | 0.804 | 0.423 | 0.274 | 0.784 | ||||
| Male | 75 | 87.38±18.36 | 123.65±43.68 | |||||
| Female | 43 | 90.32±20.38 | 121.43±39.76 | |||||
| Age (y) | 0.952 | 0.343 | 0.174 | 0.862 | ||||
| ＜60 | 50 | 86.64±19.38 | 123.62±46.35 | |||||
| ≥60 | 68 | 89.31±16.37 | 122.27±37.64 | |||||
| Cell differentiation | 8.416 | 0.000 | 2.991 | 0.003 | ||||
| Low | 81 | 98.34±17.65 | 115.36±39.67 | |||||
| Middle-high | 37 | 66.80±21.38 | 139.22±41.38 | |||||
| Tumor diameter (cm) | 1.560 | 0.122 | 0.397 | 0.692 | ||||
| ＜5 | 60 | 85.56±18.46 | 124.35±42.38 | |||||
| ≥5 | 58 | 91.44±22.37 | 121.28±41.67 | |||||
| TNM staging | 6.764 | 0.000 | 4.173 | 0.000 | ||||
| Ⅰ-Ⅱ | 47 | 73.68±17.39 | 142.26±38.68 | |||||
| Ⅲ-Ⅳ | 71 | 98.23±20.46 | 109.98±42.67 | |||||
| Lymph node metastasis | 14.447 | 0.000 | 6.860 | 0.000 | ||||
| + | 73 | 106.37±16.38 | 103.49±37.65 | |||||
| - | 45 | 59.38±18.37 | 154.23±41.18 | |||||
| Infiltration depth | 3.156 | 0.002 | 3.413 | 0.0010 | ||||
| Superficial muscle layer | 24 | 98.37±16.38 | 148.37±39.76 | |||||
| Deep muscle layer | 94 | 85.92±17.46 | 116.32±41.37 | |||||
血清miRNA-128a和miRNA-128b表达水平与2年内存活率的关系 胃癌患者术后随访2年, 19例出现死亡, 为死亡组; 99例存活, 为存活组。从表 4可知胃癌存活组血清miRNA-128a表达水平明显低于死亡组(P < 0.01), 而存活组的血清miRNA-128b水平明显高于死亡组(P < 0.01)。
| Outcome | Cases(n) | miRNA-128a (fmol/L) |
miRNA-128b (fmol/L) |
| Survival | 99 | 83.41±20.93 | 136.30±44.17 |
| Death | 19 | 114.74±20.02 | 59.88±27.83 |
| t | 6.016 | 7.256 | |
| P | ＜0.001 | ＜0.001 |
血清miRNA-128a和miRNA-128b表达水平预测2年内出现死亡的效能 从表 5和图 2可知胃癌患者血清miRNA-128a水平>98.47 fmol/L, 其预测2年内出现死亡的灵敏度为89.5%, 特异性为81.8%, 曲线面积为0.889;而当血清miRNA-128b≤94.86 fmol/L, 预测2年内死亡的灵敏度为94.7%, 特异性为81.8%, 曲线下面积为0.931;两者联合检测与单个指标检测比较并不能提高预测2年内死亡的诊断效能。
| Detection | Optimal cut off | Sensitivity (%) | Specificity (%) | AUC | 95%CI |
| miRNA-128a (fmol/L) | ＞98.47 | 89.5 | 81.8 | 0.889 | 0.818-0.940 |
| miRNA-128b (fmol/L) | ≤94.86 | 94.7 | 81.8 | 0.931 | 0.869-0.969 |
| Combined detection | - | 100.0 | 84.8 | 0.964 | 0.912-0.990 |
|
| 图 2 血清miRNA-128a和miRNA-128b水平在预测2年内出现死亡的ROC曲线 Fig 2 ROC curves of serum miRNA-128a and miRNA-128b expression levels in predicting death within 2 years' follow-up |
早期胃癌的预后较好, 晚期胃癌往往出现转移, 预后较差, 因此早期诊断是提高胃癌预后的关键。但是胃癌早期症状不典型, 很难被察觉, 胃镜能够提高确诊率, 但对临床医师和观察技巧均有一定的要求。胃镜下活检是一种侵入性手段, 存在取样误差, 从而影响疾病的诊断。随着分子生物学的进步和肿瘤机制研究的深入, 学者们发现异常表达的miRNA可能成为新型基因水平的诊断标记物, 为胃癌的诊断带来了新的希望[6-8]。组织标本中的miRNA为肿瘤诊断提供了精确的手段, 但取组织标本具有侵入性, 一定程度上限制其成为普遍、易获取的肿瘤标记物。血清标本易获得, 可以重复获取且稳定性较好, miRNA在室温下放置24 h, 在冷冻、煮沸的条件下表现稳定, 甚至在极酸和极碱的条件下仍然稳定[9-10]。miR-128在肿瘤中表达的缺失与肿瘤的发生、发展具有密切联系, 现已经证实miR-128在前列腺癌[11]、结肠癌[12]和乳腺癌[13]等实体肿瘤出现表达下调, 类似发挥抑癌基因的作用, 而在另一些肿瘤如骨肉瘤等[14]中存在高表达, 说明miR-128在不同的肿瘤中具有不同的功能, 这或与miR-128不同的分型有关。
本研究显示胃癌组血清miRNA-128a表达水平明显高于对照组, 手术后较术前明显降低; 而胃癌组血清miRNA-128b表达水平明显低于健康对照组, 手术后较术前明显升高, 说明两者均参与了胃癌的发生和发展过程, miRNA-128a作为促癌基因, miRNA-128b作为抑癌基因, 是否存在某种平衡需进一步研究。为进一步验证血清miRNA-128a和miRNA-128b表达水平能否成为胃癌早期诊断的指标, 本研究发现血清miRNA-128a＞76.68 fmol/L时, 其灵敏度为71.2%, 特异性为97.8%, 曲线下面积为0.884, 同样具有较高的诊断效能, 其特异性较好。血清miRNA-128b≤204.12 fmol/L时, 其灵敏度为96.6%, 特异性为68.9%, 曲线下面积为0.901, 具有较高的诊断效能, 其灵敏度较好。故我们将两指标进行二元回归得联合检测指标, 其灵敏度为93.3%, 特异性为81.4%, 曲线下面积0.943, 诊断效能明显提高, 在灵敏度和特异性均得到平衡。与文献报道miRNA-128b可能成为诊断胃癌的肿瘤指标相一致[15]。而目前尚未发现联合血清miRNA-128a和miRNA-128b检测诊断胃癌的相关报道。
本研究发现胃癌患者血清miRNA-128a和miRNA-128b表达水平与性别、年龄和肿瘤直径无明显相关性, 而与肿瘤细胞分化程度、TNM分期、淋巴结转移和浸润深度显著相关, 说明miRNA-128a和miRNA-128b与胃癌的恶性程度具有一定的联系。现已知miRNA-128a能够明显促进肝癌细胞增殖, 在白血病中促进癌细胞增殖, 敲除miRNA-128a后其增殖作用明显降低, 说明其具有促进肿瘤细胞生长的作用。而一些文献报道转染miRNA-128a到神经胶质瘤细胞内, 能够明显抑制细胞的增殖、浸润和迁移等, 并且抑制神经胶质瘤恶性生物学行为, 说明miRNA-128a在不同细胞系具有不同生物学作用。现已知miRNA-128b在胃癌细胞中为低表达, 与抑制胃癌细胞增殖、浸润和凋亡作用相一致, 并发现其通过激活Akt/NF-κB信号通路抑制胃癌细胞的增殖[16]。在急性淋巴细胞白血病中miRNA-128b出现低表达, 并且其表达水平的高低是评价疗效的重要指标[17]。本研究还发现胃癌存活组血清miRNA-128a表达水平明显低于死亡组, 而存活组的血清miRNA-128b水平明显高于死亡组, 说明胃癌血清miRNA-128a和miRNA-128b表达水平与胃癌患者2年内是否存活具有一定的联系。通过ROC曲线分析, 进一步发现miRNA-128a和miRNA-128b表达水平在预测2年内存活率具有较高的灵敏度和特异性, 但是联合检测并不能提高单个指标预测2年内是否出现死亡的效能。因此, 对于预测2年内可能出现死亡的胃癌患者, 采取更多的干预手段, 延长胃癌患者的生存期, 具有重要的临床价值。
总之, 联合检测血清miRNA-128a和miRNA-128b有助于胃癌诊断, 对2年内存活率预测具有重要参考价值。
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