2019, Vol. 46
肝癌在全球常见肿瘤中排名第六位, 而在肿瘤相关死因排名中位居第四, 每年有841 000例新发病例和782 000例死亡病例, 其中75%~85%为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC) [1]。尽管越来越多的分子靶向药物和免疫治疗药物被证实可使部分晚期HCC患者获益, 但其价格昂贵、客观反应率低[2]; 在传统化疗方面, 含有奥沙利铂的FOLFOX4方案治疗晚期HCC(亚洲)的缓解率为8.15%, 疾病控制率为53.2%[3], 然而反复化疗后出现的耐药问题也逐渐成为HCC系统化疗失败的主要原因, 晚期HCC的治疗仍是一大难题。
炎症与肿瘤密不可分, 在众多炎症因子中, Th17细胞及其分泌的IL-17A在多种动物模型和人类肿瘤研究中均被证实影响肿瘤的发生、发展及患者预后[4]。IL-17RA作为IL-17A的主要作用受体, 在非小细胞肺癌[5]、胆管癌[6]等多种肿瘤中高表达, 与患者不良预后相关。慢性炎症对HCC的发生、发展亦起到至关重要的作用, 然而IL-17A/IL-17RA轴在HCC中发挥了何种作用仍不明确。本研究旨在明确IL-17RA在HCC患者中的表达及预后意义, 及其对HCC细胞株生物学特征的影响。
资料和方法患者样本收集与随访 筛选2008年1—12月因原发性肝癌至复旦大学附属中山医院行肝肿瘤切除术且病理诊断为HCC的患者163例, 术前未接受其他抗肿瘤治疗且未发现肿瘤有远处转移。收集患者术前基本信息及临床信息, 术后每隔3个月随访患者生存情况, 统计患者的总生存期(overall survival, OS), 末次随访时间为2016年4月。
组织芯片制作及免疫组化染色 由中山医院病理科提供患者原位癌组织的石蜡标本, 每个病例的石蜡块上取2个位点制成组织芯片阵列蜡块, 每张组织芯片切片的厚度为4 μm。针对IL-17RA使用二步法进行免疫组化染色(IL-17A受体抗体, 美国Abcam公司, 1:150), 在高倍镜下观察肿瘤细胞胞质或胞膜染为棕黄色为阳性, 根据着色面积(0:0分; 1%~15%:1分; 16%~50%:2分; >50%:3分)和着色强度(阴性:0分; 弱阳性:1分; 阳性:2分; 强阳性:3分)计算免疫组化积分, 取2个位点的平均值为该患者的免疫组化积分, 积分＞4分为高表达组, ≤4分为低表达组(图 1)。
|
| A:Negative; B:Weak; C:Positive; D:Strong.Scale bar:50μm. 图 1 肝癌组织芯片IL-17RA免疫组化染色 Fig 1 Immunohistochemical staining of IL-17RA in HCC specimens tissue microarray |
细胞瞬时转染处理及转染效率验证 高侵袭性HCC细胞系MHCC-97H和Huh7由复旦大学附属中山医院肝癌研究所提供。siRNA由吉马基因公司设计, 序列为:5’-GCGUCAGGUUUGAGUU-UCUTT-3’。转染前一天在6孔板中铺板, 24 h后用Lipo2000进行转染, 培养箱中转染4~6 h后更换新鲜培养基。用qRT-PCR检测干扰组和对照组IL-17RA mRNA水平(上游引物:5’-CTGGTTCA-TCACGGGCATCTCC-3’; 下游引物:5’-GGTGG-TCGGCTGAGTAGATGATC-3’), 用Western blot检测干扰前后IL-17RA蛋白质水平(一抗:IL-17A受体抗体, 美国Abcam公司, 1:1 000)。
划痕实验 当细胞密度达到80%时, 用200 μL无菌枪头在培养板中央轻轻划痕, 48 h后显微镜下观察细胞向划痕区的生长情况并拍照, 重复3次, 每次设3个复孔, 取平均值为实验结果。
侵袭实验 使用Transwell侵袭小室, 将基质胶于4 ℃化为液态, 预冷实验所需枪头和培养基, 将工作浓度基质胶100 μL加于小室上室后放入培养箱凝固2 h。细胞消化后计数并调整细胞浓度, 上室接种5×105个细胞悬液100μL(无血清DMEM培养基), 下室加入含20%FBS的DMEM高糖培养基600 μL, 培养24~48 h后, 取出小室, 用棉签擦去上室面细胞, 漂洗、固定、结晶紫染色, 显微镜下拍照观察并计数肿瘤细胞侵袭情况。实验重复3次, 取其平均数作为实验结果。
奥沙利铂抑制率的检测 细胞铺于96孔板, 每孔5×103个细胞, 按10、20、40、80 μmol/L浓度递增加入奥沙利铂, 每组设3个复孔, 培养48 h后加入CCK8试剂并测定OD值, 重复3次, 比较不同浓度奥沙利铂对肿瘤细胞增殖的抑制作用。
统计学分析 患者数据采用SPSS 19.0统计分析软件, 单因素生存分析采用Kaplan-Meier法, 多因素生存分析采用Cox回归模型。实验数据采用GraphPad 6.0软件进行统计分析。采用t检验或χ2检验, P < 0.05为差异有统计学意义。
结果IL-17RA高表达影响HCC患者术后生存期 163例患者年龄最小19岁, 最大79岁, 平均(52.32±12.29)岁, 其中男性137例, 女性26例。术后1年、3年、5年生存率分别为80%、60%和51%, 平均生存期为(64.87±3.39)个月。IL-17RA高表达组和IL-17RA低表达组患者在人口统计学信息、血清胆红素、白蛋白、凝血酶原时间、术前甲胎蛋白、乙肝表面抗原、肿瘤直径、个数、有无肉眼或镜下癌栓等因素差异均无统计学意义(表 1)。
| (n) | |||
| Factors | IL-17RA low (n=99) |
IL-17RA high (n=64) |
P |
| Age (y) | |||
| ＞65 | 18 | 10 | |
| ≤65 | 81 | 54 | 0.673 |
| Gender | |||
| Male | 82 | 55 | |
| Female | 17 | 9 | 0.597 |
| Total bilirubin (μmol/L) | |||
| ≤17.1 | 80 | 54 | |
| ＞17.1 | 19 | 10 | 0.651 |
| Albumin (g/L) | |||
| ≥35 | 91 | 60 | |
| ＜35 | 8 | 4 | 0.662 |
| Prothrombin time (s) | |||
| ≤14 | 91 | 55 | |
| ＞14 | 8 | 9 | 0.222 |
| AFP (ng/mL) | |||
| ≤20 | 45 | 20 | |
| ＞20 | 54 | 44 | 0.071 |
| HbsAg | |||
| Negative | 15 | 8 | |
| Positive | 84 | 56 | 0.635 |
| Tumor diameter (cm) | |||
| ≤10 | 83 | 49 | |
| ＞10 | 16 | 15 | 0.333 |
| Tumor numbers | |||
| Single | 81 | 56 | |
| Multiple | 18 | 8 | 0.387 |
| Thrombus | |||
| No | 64 | 34 | |
| Yes | 35 | 30 | 0.642 |
进一步分析上述因素及IL-17RA的表达对患者术后OS的影响。单因素分析结果显示, 术前AFP ≤20 ng/mL组和AFP>20 ng/mL组的平均生存时间分别为68.83个月和59.60个月(P=0.043), 肿瘤直径≤10 cm和＞10 cm组的平均生存时间分别为71.45个月和35.02个月(P＜0.001), 未合并癌栓和合并癌栓组的平均生存时间分别为76.63个月和44.64个月(P＜0.001), IL-17RA低表达组和高表达组的平均生存时间分别为68.37个月和53.36个月(P=0.009), 以上各组之间差异均有统计学意义。多因素分析显示, 肿瘤直径＞10 cm (HR=1.820, P=0.028)、合并癌栓(HR=2.087, P=0.003)以及IL-17RA高表达(HR=1.579, P=0.042)是影响肝癌患者术后总生存期的独立危险因素(图 2, 表 2)。
|
| 图 2 肝癌患者术后生存曲线 Fig 2 Survival curve of HCC underwent resection |
| Factors | n | Univariate | Multivariate | |||
| OS (mo) | P | HR (95%CI) | P | |||
| Age (y) | ||||||
| ＞65 | 28 | 66.38 | ||||
| ≤65 | 135 | 54.77 | 0.321 | |||
| Gender | ||||||
| Male | 137 | 63.31 | ||||
| Female | 26 | 55.73 | 0.121 | |||
| Total bilirubin (μmol/L) | ||||||
| ≤17.1 | 134 | 66.10 | ||||
| ＞17.1 | 29 | 56.13 | 0.455 | |||
| Albumin (g/L) | ||||||
| ≥35 | 151 | 66.04 | ||||
| ＜35 | 12 | 46.13 | 0.285 | |||
| Prothrombin time (s) | ||||||
| ≤14 | 146 | 65.86 | ||||
| ＞14 | 17 | 52.89 | 0.504 | |||
| AFP (ng/mL) | ||||||
| ≤20 | 65 | 68.83 | ||||
| ＞20 | 98 | 59.60 | 0.043 | 1.061 (0.647-1.741) | 0.814 | |
| HbsAg | ||||||
| Negative | 23 | 62.39 | ||||
| Positive | 140 | 64.52 | 0.657 | |||
| Tumor diameter (cm) | ||||||
| ≤10 | 132 | 71.45 | ||||
| ＞10 | 31 | 35.02 | 0.000 | 1.820 (1.065-3.109) | 0.028 | |
| Tumor numbers | ||||||
| Single | 137 | 67.51 | ||||
| Multiple | 26 | 48.56 | 0.063 | |||
| Thrombus | ||||||
| No | 98 | 76.63 | ||||
| Yes | 65 | 44.64 | 0.000 | 2.087 (1.275-3.414) | 0.003 | |
| IL-17RA | ||||||
| Low | 99 | 68.37 | ||||
| High | 64 | 53.36 | 0.009 | 1.579 (1.016-2.452) | 0.042 | |
下调IL-17RA表达后HCC细胞体外迁移和侵袭能力下降 用siRNA瞬时转染人HCC细胞株MHCC-97H和Huh7, 下调IL-17RA表达后, 分别采用qRT-PCR和Western blot方法检测干扰效率。结果显示, 与对照组相比, 干扰组细胞在IL-17RA的mRNA和蛋白质水平均明显下降(P < 0.05, 图 3)。瞬时转染siRNA后, 用划痕实验观察下调IL-17RA对MHCC-97H和Huh7细胞迁移能力的影响, 结果显示干扰组细胞迁移能力较对照组明显下降; 用Tranwell侵袭实验观察下调IL-17RA对MHCC-97H和Huh7细胞侵袭能力的影响, 结果显示干扰组细胞侵袭能力较对照组明显下降(P < 0.05, 图 4)。可见下调IL-17RA表达可以抑制MHCC-97H和Huh7细胞的迁移和侵袭能力。
|
| A:IL-17RA protein level was decreased in MHCC-97H or Huh7 with siRNA compared with control cells detected by Western blot; B:IL-17RA mRNA level was decreased in MHCC-97H or Huh7 with siRNA compared with control cells detected by qRT-PCR. 图 3 siRNA瞬时转染MHCC-97H和Huh7细胞株后IL-17RA表达 Fig 3 IL-17RA expression in MHCC-97H and Huh7 after down-regulated IL-17RA by siRNA |
|
| A:The migration rate of MHCC-97H and Huh7 was decreased with siRNA compared with control cells; B:The number of invasion cells of MHCC-97H and Huh7 was decreased with siRNA compared with control cells.(1)vs.control group, P < 0.05. 图 4 siRNA瞬时转染下调HCC细胞IL-17RA表达后MHCC-97H和Huh7细胞的迁移和侵袭能力下降 Fig 4 The abilities of migration and invasive of MHCC-97H and Huh7 were decreased after down-regulated the expression of IL-17RA |
下调IL-17RA表达后奥沙利铂对HCC细胞增殖的抑制率提高 用siRNA瞬时转染HCC细胞株MHCC-97H和Huh7下调IL-17RA表达后, 分别用不同浓度的奥沙利铂作用于干扰组和对照组细胞, 用CCK8方法检测奥沙利铂对肿瘤细胞增殖的抑制率。结果显示当奥沙利铂作用浓度为40 μmol/L及80 μmol/L时, 对干扰组细胞的抑制率明显高于对照组(P < 0.05, 图 5)。可见下调IL-17RA的表达可以提高奥沙利铂对肝癌细胞增殖的抑制率。
|
| 图 5 siRNA瞬时转染下调HCC细胞IL-17RA表达后奥沙利铂对肝癌细胞的抑制率较对照组显著提高 Fig 5 The inhibition rate of oxaliplatin on tumor cells was increased with siRNA compared with control cells |
IL-17细胞因子家族包括IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E(IL-25)和IL-17F, 其中Th17细胞分泌的IL-17A和IL-17F形成二聚体, 通过激活效应细胞上的含有IL-17RA和IL-17RC受体复合物发挥效应[7]。IL-17A/IL-17RA轴在结肠癌、宫颈癌、肺癌等肿瘤的发生、转移以及化疗耐药等方面都发挥了重要作用[8]。IL-17A既能直接活化肿瘤细胞STAT3信号通路促进肿瘤的生长转移[9], 也通过微环境中的其他细胞(如CD8+T细胞、MDSC等)起作用。例如IL-17可以促进肿瘤血管形成, 可以通过NF-κB和ERK信号途径诱导G-CSF的表达, 促使未成熟的髓系细胞在肿瘤局部积聚, 进而降低了肿瘤对VEGF抑制剂的敏感性[10]。IL-17可以调节G-CSF进而上调TANs表面NOS2、BV8、S100a8、S100a9的表达而使其促进乳腺癌转移[11]。IL-17RA是IL-17A作用的主要受体, 表达于肿瘤微环境中的上皮细胞、造血细胞、成纤维细胞等多种细胞表面[12], 在胃癌[13]、在非小细胞肺癌[5]、胆管癌[6]等实体肿瘤中高表达并且与不良预后相关。本研究通过肝癌患者组织芯片免疫组化染色及预后分析证实, IL-17RA高表达的患者较低表达患者术后生存期短, IL-17RA高表达是影响HCC患者术后生存期的预后因素, 由此为研究IL-17A/IL-17RA轴在HCC中的作用机制提供了基础和依据。本研究进一步通过siRNA瞬时转染下调HCC细胞株IL-17RA表达后, 通过迁移、侵袭实验证实下调IL-17RA可以降低HCC细胞株的迁移、侵袭能力, 证明IL-17RA对于HCC细胞株的恶性生物学行为有着重要的影响作用, 再一次回应了IL-17RA高表达影响HCC患者生存的临床研究结果, 当然其具体的作用途径及相关信号通路有待进一步研究。
既往多项研究证实, IL-17A/IL-17RA轴在肿瘤的化疗耐药中也发挥了重要作用。IL-17A通过上调磷酸化ERK1/2促进乳腺癌的增殖及对多西他赛治疗的耐药[14]。在结肠癌小鼠模型中证实, 化疗可以促进IL-17A的分泌, 而使用IL-17A抗体联合5-FU治疗可以明显减少小鼠的肿瘤负荷, 其机制可能是下调了肿瘤组织IL-6的表达[15]。奥沙利铂是肝癌常用全身化疗药物及局部灌注化疗药物之一, 目前国内外仍有许多关于奥沙利铂化疗疗效的临床研究正在进行[16-17], 如何提高其疗效仍是我们面临的主要问题。本研究证实下调HCC细胞株IL-17RA的表达可以提高奥沙利铂对HCC细胞株的抑制率, 再一次提示了靶向IL-17A/IL-17RA轴的治疗, 尤其是联合化疗, 将可能使肝癌患者获益。
| [1] |
BRAY F, FERLAY J, SOERJOMATARAM I, et al. Global cancer statistics 2018:GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J]. CA Cancer J Clin, 2018, 68(6): 394-424.
[DOI]
|
| [2] |
EL-KHOUEIRY AB, SANGRO B, YAU T, et al. Nivolumab in patients with advanced hepatocellular carcinoma (CheckMate 040):an open-label, non-comparative, phase 1/2 dose escalation and expansion trial[J]. Lancet, 2017, 389(10088): 2492-2502.
[DOI]
|
| [3] |
QIN S, BAI Y, LIM HY, et al. Randomized, multicenter, open-label study of oxaliplatin plus fluorouracil/leucovorin versus doxorubicin as palliative chemotherapy in patients with advanced hepatocellular carcinoma from Asia[J]. J Clin Oncol, 2013, 31(28): 3501-3508.
[DOI]
|
| [4] |
HURTADO CG, WAN F, HOUSSEAU F, et al. Roles for interleukin 17 and adaptive immunity in pathogenesis of colorectal cancer[J]. Gastroenterology, 2018, 155(6): 1706-1715.
[DOI]
|
| [5] |
HUANG Q, DU J, FAN J, et al. The effect of proinflammatory cytokines on IL-17RA expression in NSCLC[J]. Med Oncol, 2014, 31(9): 144.
[DOI]
|
| [6] |
ASUKAI K, KAWAMOTO K, EGUCHI H, et al. Prognostic impact of peritumoral IL-17-positive cells and IL-17 axis in patients with intrahepatic cholangiocarcinoma[J]. Ann Surg Oncol, 2015, 22(Suppl 3): S1524-S1531.
[URI]
|
| [7] |
GU C, WU L, LI X. IL-17 family:cytokines, receptors and signaling[J]. Cytokine, 2013, 64(2): 477-485.
[DOI]
|
| [8] |
FABRE J, GIUSTINIANI J, GARBAR C, et al. Targeting the tumor microenvironment:the protumor effects of IL-17 related to cancer type[J]. Int J Mol Sci, 2016, 17(9): E1433.
[DOI]
|
| [9] |
DE SIMONE V, FRANZE E, RONCHETTI G, et al. Th17-type cytokines, IL-6 and TNF-alpha synergistically activate STAT3 and NF-kB to promote colorectal cancer cell growth[J]. Oncogene, 2015, 34(27): 3493-3503.
[DOI]
|
| [10] |
CHUNG AS, WU X, ZHUANG G, et al. An interleukin-17-mediated paracrine network promotes tumor resistance to anti-angiogenic therapy[J]. Nat Med, 2013, 19(9): 1114-1123.
[DOI]
|
| [11] |
COFFELT S B, KERSTEN K, DOORNEBAL C W, et al. IL-17-producing gammadelta T cells and neutrophils conspire to promote breast cancer metastasis[J]. Nature, 2015, 522(7556): 345-348.
[DOI]
|
| [12] |
IWAKURA Y, ISHIGAME H, SAIJO S, et al. Functional specialization of interleukin-17 family members[J]. Immunity, 2011, 34(2): 149-162.
[DOI]
|
| [13] |
JIANG YX, LI PA, YANG SW, et al. Increased chemokine receptor IL-17RA expression is associated with poor survival in gastric cancer patients[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015, 8(6): 7002-7008.
[PubMed]
|
| [14] |
COCHAUD S, GIUSTINIANI J, THOMAS C, et al. IL-17A is produced by breast cancer TILs and promotes chemoresistance and proliferation through ERK1/2[J]. Sci Rep, 2013, 3: 3456.
[DOI]
|
| [15] |
WANG K, KIM MK, DI CARO G, et al. Interleukin-17 receptor a signaling in transformed enterocytes promotes early colorectal tumorigenesis[J]. Immunity, 2014, 41(6): 1052-1063.
[DOI]
|
| [16] |
HE MK, ZOU RH, LI QJ, et al. Phase Ⅱ study of sorafenib combined with concurrent hepatic arterial infusion of oxaliplatin, 5-fluorouracil and leucovorin for unresectable hepatocellular carcinoma with major portal vein thrombosis[J]. Cardiovasc Intervent Radiol, 2018, 41(5): 734-743.
|
| [17] |
PATT YZ, MURAD W, FEKRAZAD MH, et al. INST OX-05-024:first line gemcitabine, oxaliplatin, and erlotinib for primary hepatocellular carcinoma and bile duct cancers:a multicenter phase Ⅱ trial[J]. Cancer Med, 2017, 6(9): 2042-2051.
[DOI]
|