2019, Vol. 46
2017年上海市报告发现的人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)感染者中, 经性传播占96.3%, 其中男男同性传播为57.7%, 异性传播为38.6%, 同性传播已成为上海市HIV-1的主要传播途径[1]。男男性行为(men who have sex with men, MSM)人群HIV-1感染率高、隐匿性较强, 是HIV-1防治的重点目标人群, 相关措施也应根据其独有特征来开展。随着我国抗病毒治疗的逐渐深入, 在巨大的药物选择压力下, HIV-1耐药问题已引起广泛关注[2]。由于MSM的多性伴、高流动性, 该人群的HIV-1分子亚型及原发性耐药监测显得至关重要。本研究从MSM感染者与一般男性感染者的相关特征比较来探讨可能更适宜该人群的防控措施, 对HIV-1亚型及耐药进行分析, 为该人群的抗病毒治疗策略提供依据。
资料和方法研究对象 2014年上海市闵行区疾病预防控制中心艾滋病实验室新确认的男性HIV感染者中经同性感染97名, 异性感染26名。对两者做相关特征比较, 从经同性途径感染的样本中随机抽出55份进行HIV-1亚型及原发性耐药分析。
HIV核酸提取 使用德国QIAGEN公司生产的QIAcube HT cador Pathogen 96 QIAcube HT kit和QIAcube HT Plastic ware及200 μL血浆按照说明书要求提取核酸。
HIV序列扩增 使用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及巢式PCR方法扩增HIV的pol基因的蛋白酶编码区及逆转录酶编码区, 扩增试剂盒使用Takara One Step RNA PCR kit(AMV)和Takara EX Taq [宝生物工程(大连)有限公司], 扩增引物由上海英潍捷基贸易有限公司合成, 引物详见表 1。反应条件为:第一轮PCR, 50 ℃、30 min, 94 ℃、2 min, 94 ℃、30 s, 55 ℃、30 s, 72 ℃、1 min 30 s, 30个循环; 72 ℃、10 min, 4 ℃保温; 第二轮PCR, 94 ℃、1 min, 94 ℃、1 min, 63 ℃、1 min, 72 ℃、2 min, 3个循环; 94 ℃、30 s, 63 ℃、30 s, 72 ℃、1 min 20 s, 30个循环, 72 ℃、10 min, 4 ℃保温。
| Primer | Sequences (5’-3’) | Location (HXB2) |
| Amplification | ||
| MAW-26 | TGGAAATGTGGAAAGGAAGGAC | 2 027-2 050 |
| RT-21 | CTGTATTTCTGCTATTAAGTCTTTTGA | 3 509-3 539 |
| PRO-1 | CAGAGCCAACAGCCCCACCA | 2 147-2 166 |
| RT-20 | CTGCCAGTTCTAGCTCTGCTTC | 3 441-3 462 |
| Sequencing | ||
| PROS3 | GCCAACAGCCCCACCA | 2 151-2 166 |
| RTAS-qian | GGACCTACACCTGTCAAC | 2 484-2 501 |
| RTB | CCTAGTATAAACAATGAGACAC | 2 946-2 968 |
| PROC1S | GCTGGGTGTGGTATTCC | 2 826-2 842 |
| RT20S3 | GTTCTAGCTCTGCTTC | 3 441-3 456 |
PCR产物电泳 使用毛细管电泳仪QIAxcel DNA及QIAxcel DNA Screening kit对扩增产物电泳, 目的片段约1.2 kb。PCR产物纯化和测序委托上海殴易生物科技有限公司完成。
序列整理及分析 使用Squencer 4.9软件对原始序列进行拼接和编辑。将整理好的序列用Treemaker工具建立系统进化树并提交至美国拉莫斯国家实验室HIV核酸序列库(http://www.hiv.lanl.gov)及美国斯坦福大学的HIV耐药数据库(http://hivdb.stanford.edu)进行HIV亚型判定及耐药性分析。本研究对出现潜在低度耐药及以上水平的耐药突变进行了统计, 判断依据2009年WHO的耐药监测突变列表。
统计学分析 应用SPSS 18.0软件, 对数据采用χ2检验进行比较, 检验水准α=0.05。
结果MSM感染者与一般男性感染者相关特征比较 2014年闵行区新发现的MSM HIV感染者最小17岁, 最大74岁, 平均年龄(30.6±9.7)岁。一般男性感染者最小24岁, 最大77岁, 平均年龄(44.1±15.0)岁。将年龄分层后发现, MSM感染者主要集中在25~34岁年龄层(55.7%), 一般男性感染者主要集中在≥35岁年龄层(65.4%), 差异有统计学意义(χ2=15.84, P=0.001);MSM人群婚姻状况以未婚为主(69.1%), 一般男性感染者以已婚为主(57.7%), 差异有统计学意义(χ2=13.54, P=0.001);MSM人群文化程度以大专及以上为主(54.6%), 一般男性感染者以初、高中为主(69.2%), 差异有统计学意义(χ2=12.32, P=0.006);MSM感染者样本主要来源于检测咨询(60.8%), 一般男性感染者主要来源于医疗机构(50.0%), 差异有统计学意义(χ2=12.03, P=0.002), 具体见表 2。
| [n (%)] | |||||
| Variables | Route of infection | χ2 | P | ||
| Overall (n=123) | Homosexual (n=97) | Hetersexual (n=26) | |||
| Age (y) | 15.84 | 0.001 | |||
| ＜18 | 1 (0.8) | 1 (1.0) | 0 (0) | ||
| 18-24 | 22 (17.9) | 20 (20.6) | 2 (7.7) | ||
| 25-34 | 61 (49.6) | 54 (55.7) | 7 (26.9) | ||
| ≥35 | 39 (31.7) | 22 (22.7) | 17 (65.4) | ||
| Census register | 1.93 | 0.165 | |||
| Shanghai | 34 (27.6) | 24 (24.7) | 10 (38.5) | ||
| Other province | 89 (72.4) | 73 (75.3) | 16 (61.5) | ||
| Ethnicity | - | 1.000 | |||
| Han | 120 (97.6) | 94 (96.9) | 26 (100.0) | ||
| Others | 3 (2.4) | 3 (3.1) | 0 (0) | ||
| Marital status | 13.54 | 0.001 | |||
| Never married | 75 (61) | 67 (69.1) | 8 (30.8) | ||
| Currently married | 37 (30.1) | 22 (22.7) | 15 (57.7) | ||
| Divorced/widowed | 11 (8.9) | 8 (8.2) | 3 (11.5) | ||
| Education | 12.32 | 0.006 | |||
| Primary school and below | 5 (4.1) | 3 (3.1) | 2 (7.7) | ||
| Middle school | 26 (21.1) | 15 (15.5) | 11 (42.3) | ||
| High school or equal | 33 (26.8) | 26 (26.8) | 7 (26.9) | ||
| College or above | 59 (48) | 53 (54.6) | 6 (23.1) | ||
| Sample source | 12.03 | 0.002 | |||
| VCT | 65 (52.8) | 59 (60.8) | 6 (23.1) | ||
| Medical institution | 40 (32.5) | 27 (27.8) | 13 (50.0) | ||
| Others | 18 (14.6) | 11 (11.3) | 7 (26.9) | ||
| VCT:HIV voluntary counseling and testing. | |||||
HIV-1亚型分析 55例样本共扩增出48条序列, 扩增率87.3%。以CRF01_AE亚型为主, 共28例(58.3%), 其次为CRF07_BC亚型, 共10例(20.8%), URF_0107亚型3例(6.3%), B亚型和CRF55_01B各2例, CRF08_BC, URF BC及CRF68_01B各1例。将序列构建进化树如图 1所示。
|
| 图 1 上海市闵行区48例MSM HIV阳性感染者系统进化树 Fig 1 Phylogenetic tree analysis of 48 HIV positive MSM from Minhang District, Shanghai |
HIV-1原发性耐药 48条序列中有12条出现耐药突变位点, 其中10条出现潜在低度耐药, 2条出现低度及以上耐药。NRTI突变位点2个, 为V75L和K70R, 前者引起D4T、DDI潜在低度耐药, 后者引起AZT中度耐药, D4T低度耐药, BC、DDI、TDF潜在低度耐药; NNRTI突变位点11个, 其中V179D/E位点10个, E138G位点1个, 前者引起对EFV、ETR、NVP、RPV的潜在低度耐药, 后者引起对EFV、ETR、NVP、RPV的低度耐药, PIs突变位点1个, 为K20I, 引起NFV的潜在低度耐药。按WHO的耐药标准, 本次耐药率为4.2%。具体如表 3所示。
| Sample | Age(y) | Censusregister | Subtype | Mutations | Primary drug resistance | ||
| PIs | NRTI | NNRTI | |||||
| SF140321 | 30 | Anhui | CRF01_AE | V179D | EFV(PLL) ETR(PLL) NVP(PLL) RPV(PLL) | ||
| SF140704 | 45 | Liaoning | CRF079_0107 | V179D | EFV(PLL) ETR(PLL) NVP(PLL) RPV(PLL) | ||
| SF141251 | 25 | Jiangsu | CRF01_AE | V75L | V179D | D4T(PLL)DDI(PLL)EFV(PLL) ETR(PLL) NVP(PLL) RPV(PLL) | |
| SF141390 | 24 | Shandong | CRF01_AE | V179D | EFV(PLL) ETR(PLL) NVP(PLL) RPV(PLL) | ||
| SF140191 | 46 | Shanghai | CRF01_AE | V179D | EFV(PLL) ETR(PLL) NVP(PLL) RPV(PLL) | ||
| SF140199 | 46 | Sichuan | CRF 55_01B | V179E | EFV(PLL) ETR(PLL) NVP(PLL) RPV(PLL) | ||
| SF141023 | 29 | Jilin | CRF01_AE | K20I | NFV(PLL) | ||
| SF140858 | 27 | Anhui | CRF079_0107 | V179D | EFV(PLL) ETR(PLL) NVP(PLL) RPV(PLL) | ||
| SF140611 | 46 | Henan | B | K70R | ABC(PLL)AZT(IL)D4T(LL)DDI(PLL)TDF(PLL) | ||
| SF140957 | 28 | Jiangsu | CRF01_AE | V179D | EFV(PLL) ETR(PLL) NVP(PLL) RPV(PLL) | ||
| SF141300 | 37 | Shanghai | CRF 55_01B | E138G, V179E | EFV(PLL) ETR(PLL) NVP(PLL) RPV(LL) | ||
| SF141557 | 34 | Shanghai | CRF01_AE | V179D | EFV(PLL) ETR(PLL) NVP(PLL) RPV(PLL) | ||
MSM人群在我国沿海及北部地区早已经成为艾滋病流行的三大核心人群之一[3]。2014年上海市闵行区男性新发HIV感染者中, 经同性感染占75.2%, 为HIV感染的主要途径。本研究中30.9%的MSM感染者有过婚姻, 其高感染率及作为传播给异性的桥梁人群, 使其成为艾滋病防治的重要目标人群。相比一般男性感染者, MSM感染者具有更年轻、文化程度更高、自我检测意识较强的特点。提示针对MSM的艾滋病防治可以尝试使用针对性更强的防控措施, 如利用互联网+促进MSM感染者检测HIV; 通过他们常用的聊天网站传递HIV防治信息, 进行HIV相关知识互动, 定位附近检测点、治疗机构和医疗服务机构等信息[4-7]; 使用暴露前、后预防性用药等[8-9]。
本研究中MSM感染者HIV-1亚型仍以CRF_01AE为主, 其次为CRF07_BC, 这与一些研究[10-12]结果一致。本研究还扩增出3例URF_0107亚型, 2例CRF55_01B。URF_0107亚型为CRF_01AE与CRF07_BC亚型的第二代组合亚型, 在Li等[13]研究中有发现该亚型, CRF55_01B在2012年首次报道, 已广泛散布于我国南部和西北部多个省份[14], 为MSM感染者中发现的一种重组流行亚型[15], 说明MSM感染HIV毒株的重组速度快, 并可能会陆续出现多种新的重组毒株, 这将导致不同耐药进化模式的出现[16]。
本研究发现HIV感染者的潜在耐药突变位点, 主要以V179D/E为主, 可引起EFV、ETR、NVP及RPV的潜在耐药, 与其他国内外未治疗HIV感染者突变位点相似[17]。针对NRTI和NNRTI的耐药位点各1例, 为K70R和E138G, 分别出现在B亚型和CRF01_AE亚型, 未发现PI相关耐药位点, 耐药率为4.2%, 目前呈现低度耐药, 这与王绪琴等[11]的研究结果一致。这可能与我国一线药物主要以NRTI和NNRTI类为主, PI主要作为二线药物使用等因素相关。说明目前抗病毒治疗方案对新发现感染者仍然适用。但本研究结果略高于闵行区2013年86例HIV阳性样本的耐药研究(耐药率1.2%)[18]。MSM人群具有高感染率、广泛扩散及多性伴等特点, 应继续加强对该人群的HIV分子流行病学监测, 以及时了解疫情发展方向, 为临床治疗提供相关的客观依据。
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