2019, Vol. 46
胃癌是一种常见的恶性肿瘤, 在男性和女性中的发病率排名分别为第4和第5, 致死率排名分别为第3和第5[1]。2015年中国的胃癌死亡病例高达50万[2]。
谷氨酰胺是人体中含量最丰富的氨基酸, 可以为多种氨基酸、蛋白质、核苷酸及其他生物大分子的合成提供前体, 包括谷胱甘肽(glutathione, GSH)[3]。当谷氨酰胺转换为亮氨酸时能激活雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)通路, 对细胞生长造成显著影响[4]。研究表明谷氨酰胺能影响多种肿瘤生长, 如卵巢癌[5]、肝癌[6]和肺癌[7]。
氨基酸转运载体2(amino-acid transporter 2, ASCT2)是一种定位于细胞膜上的Na+依赖的中性氨基酸转运蛋白质, 介导细胞对于中性氨基酸(包括谷氨酰胺)的摄取[8]。ASCT2对细胞内谷氨酰胺水平的维持有重要的作用, 细胞内高水平谷氨酰胺对于维持mTOR信号通路的激活有关键作用。ASCT2被证明在多种癌症中通过控制谷氨酰胺的转运而调节细胞生长, 如前列腺癌[9]、三阴性基底样乳腺癌[10]和结肠直肠癌[11], 是潜在的治疗靶标。
本文通过体外实验探究ASCT2在胃癌细胞中的表达及其在胃癌细胞增殖过程中的作用, 以期为胃癌的诊断治疗提供证据。
材料和方法主要试验仪器 CO2细胞培养箱(NUAIRE US AutoFlow和Thermo Scientfic Forma), 细胞计数仪(Beckman), LAS-3000成像系统(FUJIFILM), 扫描仪(GE Healthcare Image scanner Ⅲ), 多功能酶标仪(BioTek), CKX41倒置显微镜、倒置荧光显微镜DP70、光学显微镜(Olympus), BT25S/BS2202S电子精密天平(Sartorius), 5810R型/5424型离心机(Eppendorf), IQ5定量PCR仪(Bio-Rad), PCR仪(杭州博日科技有限公司), 电泳仪(PowerPacTM Universal, Bio-Rad)。
材料和试剂 MGC803和HEK293FT细胞系购自上海中国科学院细胞库; SGC7901由上海交通大学于颖彦老师惠赠; AGS由上海芯片中心张庆华教授惠赠; PRMI1640培养基和DMEM/High glucose培养基(Gibco); 细胞培养皿/板(Corning); 胎牛血清、0.25%胰蛋白酶和青霉素链霉素溶液(Hyclone); Lipofectamine 2000转染试剂、Trizol、Alexa Fluor-488标记的抗兔IgG和Alexa Fluor-594标记的抗鼠IgG (Invitrogen); 限制性核酸内切酶和T4 DNA连接酶及PCR聚合酶(NEB); 感受态细胞DH5α(北京天根生化); pENTER载体(山东维真生物), PCR产物回收试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒及质粒小抽试剂盒(QIAGEN); PVDF膜(Millipore); DAPI和封片剂(碧云天); SYBR Premix Ex TaqTM (Roche); 氯仿和结晶紫(Amresco)。
细胞培养 MGC803、AGS和SGC7901细胞系使用PRMI1640培养基培养, HEK293FT用DMEM/高糖培养基培养。培养基使用前均加入10% FBS和1%青霉素/链霉素, 细胞置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。
稳定细胞系的建立 从Sigma官网(https://www.sigmaaldrich.com)下载shASCT2序列, 由上海捷瑞生物有限公司合成, 上游引物:5’-CCGGC-TGGATTATGAGGAATGGATACTCGAGTAT-CCATTCCTCATAATCCAGTTTTTG-3’, 下游引物5’-AATTCAAAAACTGGATTATGAGGAA-TGGATACTCGAGTATCCATTCCTCATAATC-CAG-3’。构建含有shASCT2序列的质粒, 用pLKO.1-shLuciferase与质粒分别转化DH5α感受态细胞, 扩增之后平板涂布, 挑选测序正确的转化子扩大培养, 利用质粒试剂盒抽提。利用HEK293FT细胞包装含有pLKO.1-shLuciferase和shASCT2质粒的病毒, 测试病毒滴度, 把病毒加入到每孔含有3×105个细胞的6孔板中, 同时每孔加入6 μg/mL聚凝胺, 8 h后更换完全培养基, 36 h后用含嘌呤霉素的完全培养基筛选48 h; 更换成正常的完全培养基, 直至有克隆株形成, 用Western blot或RT-PCR鉴定稳定细胞系建立情况。
构建及扩增瞬时过表达载体 使用pENTER (维真生物)构建ASCT2过表达载体。转化DH5α感受态细胞, 涂板培养并进行菌落PCR, 挑选阳性菌落测序验证, 测序正确后扩大培养, 利用质粒试剂盒抽提备用。
抗体 p70S6K、Phospho-P70S6K、GSK3、Phospho-GSK3、mTOR、Phospho-mTOR(CST); GAPDH(CWBIO); β-actin(PTG); 羊抗鼠(二抗)、羊抗兔(二抗)(Santa Cruz)。
细胞荧光免疫 取生长状态良好的细胞, 用胰蛋白酶消化, 进行细胞计数。在24孔板中放入细胞爬片, 每孔接种1×105个细胞, 培养箱中培养过夜, 用1×PBS浸洗玻片3次, 每次3 min; 弃1×PBS, 加入固定液(4%多聚甲醛, 用1×PBS配制), 室温放置15 min; 1×PBS浸洗玻片3次, 每次3 min, 每孔加入0.5% Triton X-100(用1×PBS配制), 室温放置30 min; 1×PBS浸洗玻片3次, 每次3 min, 每孔加入500 mL 5% BSA(用1×PBS配制)溶液, 室温放置1 h; 弃去封闭液, 每一细胞爬片上滴加ASCT2和Ki67一抗, 4 ℃孵育过夜; 1×PBS浸洗玻片3次, 每次3 min, 弃1×PBS后分别滴加荧光标记的二抗, 室温避光孵育1 h; 1×PBS浸洗玻片3次, 每次3 min; 每孔加入DAPI, 室温避光染核1 min; 1×PBS浸洗玻片3次, 每次3 min。封片后在荧光显微镜下观察采集图像, 使用ImageJ合并图像, 使用Image-Pro 10软件进行半定量计算荧光值。
RNA提取和qRT-PCR检测 使用Trizol法提取细胞内的总RNA, 逆转录为cDNA。qRT-PCR 10 μL反应体系为:cDNA模板1 μL, SYBR Premix Ex TaqTM (2×) 5 μL, 上下游引物共1 μL (引物浓度为10 μmol/L), ddH2O 3 μL。PCR反应条件为:95 ℃、10 s; 95 ℃、5 s, 60 ℃、20 s, 72 ℃、15 s, 40个循环; 60~95 ℃、15 s。
MTT法检测 取生长状态良好的对数期细胞, 进行消化计数, 根据细胞大小调节细胞数目, 按每孔1 000个细胞接种于96孔板中, 周边孔加入1×PBS, 共5块板, 置于细胞培养箱中培养; 24 h后取出1块板, 每孔加入20 μL MTT溶液(0.5 g/mL, 0.45 μm滤膜过滤, 锡箔纸避光保存), 4 h后去除培养液, 每孔加入200 μL DMSO, 震荡5 min, 使细胞内的结晶充分溶解; 酶标仪于490 nm波长下测定吸光度(D)值, 绘制细胞生长曲线, 重复步骤5次。
Western blot 检测 将经过定量的蛋白质与蛋白上样缓冲液按比例混合, 置于沸水浴中5 min, 12 000×g离心5 min, 将管壁上蒸发的水离心至管底, 震荡混匀后上样。以恒压90 V进行电泳, 直到溴酚蓝指示剂到达分离胶底部时停止。将PVDF膜用甲醇活化1 min, 连同滤纸、电转夹板浸泡在电转液中; 将电转夹板取出, 从正极到负极按照白板、海绵垫、2层滤纸、PVDF膜、分离胶、2层滤纸、海绵垫和黑板的顺序将电转夹板固定好, 放入电转槽中, 恒压100 V 2 h后, 将PVDF膜用5%BCA封闭, 室温上摇床1 h, 一抗孵育, 4 ℃过夜, 回收一抗, TBST洗膜, 室温下用二抗孵育1 h, 弃二抗, TBST洗膜, 用LAS-3000成像系统曝光。Western blot实验重复3次, 使用Image-Pro 10软件计算灰度值。
平板克隆形成实验 取生长状态良好的对数期细胞, 消化后计数, 以每孔250个细胞数接种于6孔板中。细胞培养箱中持续培养, 3~4天更换一次抗生素, 去除培养基, 1×PBS洗涤3次, 固定液固定细胞15 min, 去除固定液, 1×PBS清洗3次, 用0.05%结晶紫溶液染色15 min, 1×PBS洗涤后风干, 拍照记录, 使用Image J软件计算形成的细胞克隆数目。
统计学方法 所有数据采用SPSS 11.0软件进行统计处理。对照组与实验组间采用t检验, 差异显著性检验水平设为双尾, P < 0.05为差异有统计学意义。
结果ASCT2在胃癌细胞系中的表达 在人类胃癌细胞系和胃黏膜上皮细胞系GES1中检测ASCT2的mRNA和蛋白质水平, 结果显示相比于GES1细胞系, ASCT2在所有胃癌细胞系中均有高转录水平以及蛋白质表达水平(图 1)。
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| RT-PCR and Western blot were used to detect ASCT2 mRNA (A) and protein (B) expression. 图 1 在胃癌细胞系和胃上皮细胞系(GES1)中ASCT2的mRNA (A)和蛋白质(B)表达情况 Fig 1 ASCT2 mRNA (A) and protein (B) expression in gastric cancer cell lines and gastric mucosal epithelial cell line (GES1) |
ASCT2在胃癌细胞系中的RNA干扰与过表达 使用ASCT2 shRNA慢病毒及过表达载体转染胃癌细胞系AGS、MGC803和SGC7901。结果表明, 相对于shRNA-NC转染的细胞, ASCT2 shRNA质粒显著抑制ASCT2在AGS、MGC803和SGC7901中的蛋白质水平; 相对于pENTER-NC转染的AGS、MGC803和SGC7901, pENTER-ASCT2质粒转染后ASCT2蛋白质水平显著上升。结果表明ASCT2 RNA干扰与过表达技术有效(图 2), 图中数字为ASCT2蛋白质表达的相对灰度值。
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| Western blot was used to verify the over-expression (A) and silencing (B) of ASCT2 in gastric cancer cells. 图 2 在胃癌细胞系中过表达及稳定沉默ASCT2 Fig 2 Over-expression and stable silencing of ASCT2 in gastric cancer cell lines |
在AGS和SGC7901中ASCT2对Ki67表达的影响 Ki67是细胞增殖所必需的核蛋白, 与核糖体RNA的转录相关, 灭活Ki67能导致核糖体RNA合成受到抑制, 在G0期中不存在, 在细胞周期的所有活动阶段(G1, S, G2)都存在, 特别是在细胞周期中最活跃的S期, 细胞内的Ki67蛋白质大量增加[12]。相比于对照组(转染pENTER-NC), 实验组(转染pENTER-ASCT2)Ki67+细胞比例明显增多(图 3)。
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| Using Ki67 staining in SGC7901 (A) and AGS (B) after the up-regulation of ASCT2 (pENTER-ASCT2) was detected by cellular immunofluorescence assay. 图 3 上调ASCT2增加Ki67+细胞的比例(×100, ×400) Fig 3 Up-regulation of ASCT2 raise Ki67+ cell percentage (×100, ×400) |
ASCT2对MGC803和SGC7901增殖和克隆形成的影响 由于ASCT2能显著影响胃癌细胞中Ki67蛋白质的表达水平, 我们推测ASCT2也会影响胃癌细胞的增殖与克隆形成能力。用shRNA敲低ASCT2基因表达后, 通过MTT实验连续5天检测转染的MGC803与SGC7901的增殖情况。结果发现转染ASCT2 shRNA MGC803和SGC7901的增殖比转染shRNA NC的细胞显著降低(图 4A)。克隆形成结果表明, 用ASCT2 shRNA转染的MGC803和SGC7901胃癌细胞比来自shRNA-NC组的细胞形成的克隆数目更少(图 4C)。而相对于使用pENTER-NC质粒转染的MGC803与SGC7901细胞, 使用pENTER-ASCT2质粒转染后的细胞无论增殖还是克隆形成都具有显著的优势(图 4B和4D)。这些结果表明ASCT2能显著影响胃癌细胞MGC803和SGC7901的增殖与克隆形成能力。
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| A:Cell growth of SGC7901 was inhibited after ASCT2 silencing (P=0.008);while it was promoted after ASCT2 over-expression (P < 0.001);B:Cell growth of MGC803 was inhibited after ASCT2 silencing (P < 0.001), while it was promoted after ASCT2 over-expression (P=0.002);C:Cell clonal formation of SGC7901 was inhibited after ASCT2 silencing (P=0.001), while it was promoted after ASCT2 over-expression (P=0.003);D:Cell clonal formation of MGC803 was inhibited after ASCT2 silencing (P=0.067), while it was promoted after ASCT2 over-expression (P=0.014). 图 4 ASCT2对胃癌细胞MGC803和SGC7901增殖及克隆形成的影响 Fig 4 The effect of ASCT2 on cell proliferation and clonal formation of gastric cancer cell line MGC803 and SGC7901 |
ASCT2调控激活胃癌细胞的mTOR/p70S6K1通路 在AGS、MGC803和SGC7901细胞中过表达ASCT2将激活细胞mTOR/p70S6K1信号通路, mTOR和PDK1的磷酸化显著增高, 进而促进下游基因p70S6K1与P21的表达; 稳定沉默ASCT2后, mTOR和PDK1的磷酸化显著降低, 下游基因p70S6K1和P21的蛋白质表达受到抑制(图 5)。
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| Western blot was used to detect the protein expression of mTOR signaling pathway and its downstream genes in AGS, SGC7901 and MGC803 after silencing (A) and over-expression (B) of ASCT2. 图 5 ASCT2激活胃癌细胞的mTOR信号通路 Fig 5 ASCT2 activates the mTOR signaling pathway in gastric cancer cells |
幽门螺杆菌是胃癌最重要的环境风险因素, 被世界卫生组织认定为Ⅰ类致癌物, 据统计全球约90%的非贲门胃癌新病例归因于这种细菌[13]。研究表明胃癌的发生是因为多基因表达异常和多途径导致[14]。胃癌的早期诊断率不足10%, 细胞表面膜蛋白在肿瘤的发生发展过程中举足轻重。ASCT2作为氨基酸转运受体定位于细胞膜上, 对中性氨基酸(如L-丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-半胱氨酸以及L-谷氨酰胺)的Na+依赖性摄取呈现出高亲和力[15]。有研究表明ASCT2通过谷氨酰胺转运从而对mTOR信号通路进行调节。在肝癌中, ASCT2的沉默能减弱谷氨酰胺的摄入, 抑制mTORC1, 从而影响细胞的生长[16]。ASCT2在多种癌症中都高表达, 并对癌细胞生长有重要影响, 如肺癌[17]、前列腺癌和三阴性基底样乳腺癌等。
本文利用shRNA和pENTER控制ASCT2在胃癌细胞系中的表达, 利用RT-PCR、Western blot、细胞免疫荧光、克隆形成以及MTT试验研究ASCT2对胃癌发生发展的影响及其潜在调控分子机制。我们发现ASCT2能调控胃癌细胞的生长, 当过表达ASCT2时胃癌细胞系的生长增殖、克隆形成能力都大大增强, 反之当干扰ASCT2的表达时则表现出相反的结果。
mTOR是mTORC1和mTORC2复合物的主要组成分子, 也是mTOR信号通路的关键分子, 该信号通路对营养物质吸收、生长因子刺激和细胞能量代谢等进行整合, 促进细胞代谢及细胞生长[18], 还控制细胞周期进展[19]。此外, p70S6K1(mTOR的通路的下游分子)的磷酸化能促进细胞生长和细胞周期相关蛋白质的生物合成[20]。我们发现ASCT2过表达或沉默之后能显著影响在AGS、MGC803和SGC7901细胞内mTOR/p70S6K1信号通路的磷酸化, Western blot检测mTOR信号通路发现, 当过表达ASCT2时, 在AGS、MGC803和SGC7901细胞内mTOR和PDK1的磷酸化水平大大增加, 下游分子p70S6K1的磷酸化水平也相应增加, 同时调控生长关键因子P21的表达上升。相比于对照组, 使用shRNA稳定干扰ASCT2的细胞系中, ASCT2的表达显著下降, mTOR和PDK1的磷酸化水平减弱。
ASCT2过表达能激活mTOR信号通路, 促进p70S6K1磷酸化, 从而促进胃癌细胞的生长和增殖; 反之, 抑制ASCT2的表达能抑制mTOR信号通路, 导致胃癌细胞的生长和增殖都受到抑制。结果表明, ASCT2能够通过调控mTOR信号通路对胃癌细胞的生长和增殖产生影响。
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