2019, Vol. 46
2. 复旦大学附属中山医院内分泌科 上海 200032
2. Department of Clinical Laboratory, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China
中国高血压患者总人数已突破3.3亿, 按病因可分为原发性和继发性高血压。其中原发性醛固酮增多症(primary aldosteronism, PA)是继发性高血压中最常见的病因, 在年轻高血压人群中约占10%[1-4]。PA临床表现为高血压和(或)低血钾的临床综合征, 其作为一种“可治愈的高血压”, 若能早期诊断, 可通过手术或药物治疗使血压回到正常水平[5], 可降低患者心血管事件的发生率, 改善患者预后[6]。
肾素是由肾小球旁器释放的一种蛋白水解酶, 能催化肝脏分泌进入血浆中的血管紧张素原转变成血管紧张素Ⅰ (angiotensin Ⅰ, Ang Ⅰ), 从而增加醛固酮的生成。醛固酮是由肾上腺皮质球状带分泌的盐皮质激素, 主要生理功能是保钠排钾, 通过调节血容量维持体液水盐平衡[7]。临床上推荐使用醛固酮/肾素活性比值(aldosterone to renin ratio, ARR)作为PA的初筛方法, 再使用生理盐水抑制试验、开博通试验等作为确认试验, 最后使用肾上腺静脉取样检测醛固酮(AVS试验)进行术前定位[8]。在这些临床实验中, 准确检测肾素活性-醛固酮浓度至关重要。
血浆肾素活性(plasma renin activity, PRA)水平非常低, 仅为ng级, 因此对检测方法的灵敏度要求很高。19世纪70年代起使用放射免疫法(radioimmunoassay, RIA)检测[9], 之后也开发出化学发光法检测直接肾素浓度[10-11], 这两种方法是目前临床常用的肾素检测方法。免疫法可实现自动化操作, 检测快速、成本低, 但单次仅能检测一种靶标激素, 特异性差、尤其是女性患者易出现交叉反应[12-13]。内分泌激素水平在机体病理状态下波动范围大, 易出现极高/低值, 而免疫分析法在此类情况下准确性与重复性的不足, 令其在功能性试验中无法正确反映患者的激素水平动态波动, 从而影响临床诊断的灵敏度及特异性。因此迫切需要寻找更灵敏、更准确的方法检测PRA。
本文旨在建立质谱技术检测PRA的方法, 并结合多重反应监测(multiple reaction monitoring, MRM)技术, 利用质谱平台的高敏感性和高特异性准确定量PRA, 早期快速筛查PA, 从而更好地为临床提供有效、准确的信息, 为快速筛查诊断PA创造条件。
资料和方法仪器和试剂 AB SCIEX® Triple Quad 6500+LC-MS/MS系统, 标准品为人血管紧张素Ⅰ乙酸盐水合物(5 mg, 上海市圆创生物科技有限公司); 内标品为Ang Ⅰ稳定同位素内标arginine 13C 15N (5 mg, Anaspec, Fremont, 成都康普尼生物科技有限公司); 无激素正常人混合血浆SeraConTMⅡ (美国SeraCare Life Sciences公司); 甲醇(德国Merck公司, 色谱级); 牛血清白蛋白(美国Sigma Life Science公司); 苯甲基磺酰氟(德国Roche诊断公司); Tris Base碱(德国Roche诊断公司); 甲酸(美国ROE scientific公司, 高效液相色谱级)。
患者入组 本研究纳入2017年12月至2018年1月就诊于复旦大学附属中山医院门诊内分泌科并获得医嘱检测PRA的360名高血压患者及同期在我院体检中心体检的296名表面健康人群。所有样本获取及使用过程均获复旦大学附属中山医院伦理委员会批准及患者知情同意。
高血压患者纳入标准:原发性高血压诊断依据为2010年中国高血压防治指南。其中27例PA的诊断依据为2016年中国制定的《原发性醛固酮增多症诊断治疗的专家共识》。
体检表面健康人群纳入标准:年龄≥18岁; BMI为18.0~35.0 kg/m2; 血压无异常(＜130/80 mmHg, 1 mmHg=0.133 kPa); 血钾无异常(2.8~6.2 mmol/L); 未服用降压药物或经过激素治疗; 无吸烟嗜酒; 无严重器质性心脏病; 无心功能3级及以上的心功能不全; 无肝、肾功能不全; 非妊娠、哺乳期妇女。
标本采集 使用EDTA抗凝真空管采集患者静脉血。尽快(2 h内)离心分离血浆, 并分装到尖底离心管内, -80 ℃冻存。
标准品配制 在2 mL无激素正常人混合血浆中准确溶解10 μg Ang Ⅰ, 配制成5 000 ng/mL的标准储备液。将储备液按照一定比例稀释为0.337 5 (S1)、0.675 0 (S2)、1.350 0 (S3)、2.700 0 (S4)、9.000 0 (S5)及30.0000 ng/mL (S6)标准品。分装后-80 ℃保存备用, 不能反复使用。
质控品配制 在无激素正常人混合血浆中准确溶解10 μg Ang Ⅰ, 配制成5 000 ng/mL的标准储备液。将储备液按照一定比例稀释为2.0、4.0及8.0 ng/mL质控品。分装后-80 ℃保存备用, 不能反复使用。
内标品配制 在含有2 mL 1% BSA的0.1 mol/L Tris (pH=6)工作缓冲液中准确溶解10 μg arginine 13C 15N, 配制成5 000 ng/mL的内标储备液。将Ang Ⅰ内标储备液用10%甲酸水溶液稀释至10 ng/mL。
样本前处理 将血浆、标准品、质控品和内标品取出平衡至室温。(1)孵育反应[14]:分别取250 μL标准品、质控品和患者血浆, 加入50 μL孵育缓冲液, 震荡混匀后37 ℃孵育3 h。孵育结束后加入300 μL Ang Ⅰ SIS震荡混匀后终止酶促反应。孵育缓冲液的配置:分别取121.1 g Tris Base与74.0 g EDTA, 加入900 mL去离子水后超声30 min, 直至完全溶解后再用去离子水定容至1 000 mL。最后用冰醋酸调节pH至5.45~5.50, 2~8 ℃保存。(2)固相萃取:使用Waters OASIS HLB uElution 96孔板进行抽提和萃取。每孔预先使用甲醇和5%甲酸水溶液1 mL对填料进行平衡和活化, 加入孵育反应后的600 μL样本(血浆或标准品)进行抽提和萃取, 依次加入5%甲酸水溶液和20%甲醇水溶液各1 mL进行淋洗, 分别将不同极性的杂质洗脱。最后使用250 μL甲醇将目标分析物以及稳定同位素内标洗脱入样本收集板。
色谱分析条件与质谱条件 色谱柱为Phenomenex Kinetex C18 (2.6 μm×100 mm×3.0 mm), 柱温55 ℃。流动相A为0.2%的甲醇水溶液, 流动相B为0.2%的甲酸甲醇溶液, 流速0.5 mL/min。按浓度梯度洗脱(表 1)。将萃取得到的样品上机检测, 每次进样量为5 μL。质谱条件为Ang Ⅰ定量的转换离子对(m/z)为433.1→647.5, 锥孔电压为46 V, 碰撞能量为22 V; Ang Ⅰ SIS定量的转换离子对(m/z)为436.4→657.5, 锥孔电压为46 V, 碰撞能量为22 V, 质谱裂解信息见图 1。
| Time (min) |
Flow rate (mL/min) |
A (%) | B (%) |
| 0.0 | 0.5 | 90 | 10 |
| 0.5 | 0.5 | 90 | 10 |
| 1.5 | 0.5 | 5 | 95 |
| 3.5 | 0.5 | 5 | 95 |
| 3.6 | 0.5 | 90 | 10 |
| 6.0 | 0.5 | 90 | 10 |
| A:0.2% aqueous methanol solution; B:0.2% formic acid methanol solution. | |||
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| 图 1 质谱裂解信息 Fig 1 The mass spectrometry cleavage information |
方法学考察
预验证 (1)特异性:使用无激素正常人混合血浆作为双空白样本, 经前处理后重复进样检测5次, 比较背景峰面积与定量检测下限(lower limit of measuring interval, LLMI)峰面积, 验证该方法的特异性。背景峰面积/LLMI峰面积＜20%即判断为可接受。(2)基质效应:选取正常人混合空白血浆和流动相, 经前处理后加入25 μL 9 ng/mL和100 ng/mL的标准品(标准品被稀释10倍), 4份标本分别进样检测5次, 比较血浆基质和纯溶液下的信号比值(ME%), ME%＜100%±15%即判断为可接受。(3)携带污染:在250 μL甲醇中加入25 μL浓度为100.0 ng/mL的标准品S7作为高值标本(10.0 ng/mL); 在250 μL甲醇中加入25 μL 9.0 ng/mL标准品S5作为低值标本(0.9 ng/mL), 低值标本进样5次, 高-低进样反复5个循环。高-低值转换样品均值与低-低值转换样品均值之差小于低-低值转换样品的3倍标准差(standard deviation, SD)即判断为可接受。(4)重复性:将标准品稀释至110% LLMI (0.372 ng/mL)、90% LLMI (27.000 ng/mL)和50% [(LLMI+ULMI)15.169 ng/mL, ULMI:upper limit of measuring interval (定量检测上限)]作为待测样品。经前处理后每种浓度的样本重复进样20次, 计算SD和CV, CV＜15%即判断为可接受。
性能验证
定量下限 稀释标准品, 当标准品浓度为0.337 5、0.084 4和0.042 2 ng/mL, 每个浓度重复检测10次, 将同时满足CV＜15%、检测偏倚(deviation, Dev)＜10%且信噪比＞20:1的最低浓度值定为定量检出限。
线性评价 将浓度为100 ng/mL的标准品稀释为6个浓度(30.000 0、9.000 0、2.700 0、1.350 0、0.675 0、0.337 5 ng/mL), 重复检测3次取均值。各浓度的Dev＜10%, CV＜15%且曲线的回归系数(r2)＞0.99可判断为呈线性。
不精密度评价 使用高(8.0 ng/mL)、中(4.0 ng/mL)、低(0.25 ng/mL) 3个浓度水平的质控品作为待测样品, 分别同时检测20次, 评价批内不精密度; 将混合血浆分装于-20 ℃保存, 连续检测3天, 每天重复3次, 评价批间不精密度。LLMI浓度3倍附近低值CV < 20%, 其余CV < 15%即判断为可接受。
准确度评价 在3个浓度水平的质控品(2.0、4.0和8.0 ng/mL)中同时添加标准品S4 (2.7 ng/mL), 每份样本重复检测5次取均值, 并与理论值进行比较计算Dev。准确度Dev < 15%且低浓度Dev < 20%即判断为可接受。回收率需满足80%~120%。
稀释一致性 将浓度为100 ng/mL的标准品S7稀释至3个浓度(20、10、5 ng/mL), 经前处理后每个浓度进样检测5次, 当满足浓度>3倍LLMI时, 回收率在100.0%±15.0%, CV < 15%即判断为可接受。
样本稳定性及储存稳定性 选取低、高各2组混合血浆样本分别置于25、4、-80 ℃保存15 h后进行检测, 每组检测4次, 计算均值与CV%, CV < 15%即判断为可接受。血液样本采集后处理稳定性:采用随机数表法(不重复抽样)在360例高血压患者标本中随机选取20例血样, 按3种不同处理要求进行血浆分离, 分别检测3种处理后的PRA计算均值与CV%, CV < 15%即判断为可接受。标本采集后立即分离血浆, 于37 ℃孵育3 h; 标本采集后立即分离血浆, 于4 ℃放置5 h后于37 ℃孵育3 h; 标本采集后静置5 h, 随后分离血浆, 于37 ℃孵育3 h。
临床评估 建立生物参考区间:表面健康人群根据性别进行分组, 并统计分析是否存在性别差异, 如有差异则分组建立参考区间; 通过相关性分析判断年龄和检测值之间是否存在相关性, 如存在相关性则根据年龄分段建立参考区间。判断健康人群结果是否为正态分布, 非正态分布使用2.5%与97.5%百分位数作为参考区间上下限。方法学比较:与RIA检测所得PRA结果进行一致性与偏倚评价。临床应用评估:使用LC-MS/MS和RIA法所得结果计算ARR, 评价两者比值对PA诊断的灵敏度和特异性, 综合评价诊断性能。
统计学分析 使用SPSS 17.0软件计算均值、SD、CV、Dev和回收率。使用Skewness-Kurtosis检验程序判断数据正态性; 使用Stem-and-Leaf&Box Plots程序剔除离群值; 使用非参数秩和检验统计分析是否存在性别差异; 使用Spearman相关性分析判断年龄和检测值之间是否存在相关性。方法间结果比较使用两独立样本的t检验进行分析, P < 0.05为差异有统计学意义。ROC曲线评价自建质谱方法与RIA所得结果对于PA诊断的灵敏度和特异性。
结果方法学验证
预验证
LC-MS/MS检测 标准品S3和血浆标本Ang Ⅰ (m/z:433.1→647.5)及其内标物Ang Ⅰ-IS (m/z:436.4→657.5)的色谱图见图 2, 保留时间分别为2.06和2.05 min。
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| A and B:The chromatogram of the standard S3 Ang Ⅰ and Ang Ⅰ-IS; C and D:The chromatogram of the plasma sample Ang Ⅰ and Ang Ⅰ-IS. 图 2 LC-MS/MS检测PRA的色谱图 Fig 2 Chromatograms of PRA detected by LC-MS/MS |
特异性 双空白血浆重复进样5次所得到背景峰面积/LLMI峰面积分别为3.61%、3.02%、4.14%、2.43%和0.99%, 均小于20%。另外, 背景峰面积/预期IS峰面积分别为0.11%、0.18%、0.18%、0.09%和0.09%, 均小于5%。以此验证该方法的特异性满足要求。
基质效应 添加低、高值(9 ng/mL、100 ng/mL)标准品的血浆基质和纯溶液下的信号比值(ME%)分别为93.88%(低浓度)和103.02%, 说明血浆基质对低、高浓度样本的影响分别表现为离子抑制和离子增强, 影响幅度在15%之内则满足建议要求。
携带污染 高-低值转换样品均值与低-低值转换样品均值分别为0.353和0.372, 两者的差值(0.019)小于3倍低-低值转换样品SD, 判断为可接受。
重复性 110% LLMI (0.372 ng/mL)、90%LLMI (27.000 ng/mL)和50%(LLMI+ULMI)(15.169 ng/mL) 3种浓度稀释标准品的CV分别为5.17%、2.00%和7.93%, 均＜15%即判断为可接受。
性能验证
定量下限 稀释标准品, 当标准品浓度为0.337 5、0.084 4和0.042 2 ng/mL, 每个浓度重复检测10次, 0.337 5和0.0844 ng/mL浓度下的CV分别为5.36%和11.76% (均＜15%), 且Dev＜10%, 信噪比＞20:1, 因此LLMI为0.084 4 ng·mL-1·h-1。而浓度在0.042 0 ng/mL时, 信噪比满足至少3:1, CV和Dev满足应用建议检测限(limit of detection, LoD)要求, 但不能满足LIMI的要求, 故0.042 0 ng/mL为肾素质谱检测方法的LoD。
线性评价 将浓度为100 ng/mL的标准品稀释为6个浓度(30.000 0、9.000 0、2.700 0、1.350 0、0.675 0、0.337 5 ng/mL), 重复检测3次取均值。LLMI浓度点及其余浓度点的Dev＜10%且CV＜15%则满足建议要求。PRA的回归方程是y=0.091 7x+0.010 3, 相关系数r2=0.99, PRA的线性范围为0.084 4~30.000 0 ng/mL。
不精密度评价 低(0.25 ng/mL)、中(4.0 ng/mL)、和高(8.0 ng/mL) 3个浓度水平的PRA溶液(质控品)批内不精密度分别为3.54%、1.32%和1.88%, 日间不精密度分别为5.69%、2.22%和1.92%。实验结果显示3浓度水平质控品的批内和日间CV均 < 15%, 满足应用建议要求。
准确度评价 实验结果显示低、中、高3个浓度水平质控品的Dev分别为-8.81%、2.18%和2.62%, Dev均 < 15%, 满足应用建议的要求。回收率为91.28%~102.62%, 符合80%~120%的标准。
稀释一致性 将浓度为100 ng/mL的标准品稀释至3个浓度(20、10、5 ng/mL), 经前处理后每个浓度进样检测5次(表 3)。100 ng/mL (33.3 ng·mL-1·h-1)样本1:20稀释后回收率和CV均满足要求。
| Theoretical concentration | Level 1 (1:5) | Level 2 (1:10) | Level 3 (1:20) |
| 1 | 19.10 | 8.70 | 5.28 |
| 2 | 18.80 | 8.51 | 5.22 |
| 3 | 19.40 | 8.46 | 5.15 |
| 4 | 18.80 | 8.41 | 5.23 |
| 5 | 19.00 | 8.61 | 5.18 |
| Recovery (%) | 95.10 | 86.00 | 104.24 |
| CV (%) | 1.31 | 0.98 | 0.95 |
| Level 1:20 ng/mL; Level 2:10 ng/mL; Level 3:5 ng/mL. | |||
样本稳定性 储存稳定性:低、高各2组混合血浆样本在25、4、-80 ℃保存15 h后, 4次检测结果差异无统计学意义(P=0.14)。血浆样本采集后处理稳定性:20例随机血样按A1、A2和B方案进行血浆分离, 3种样本处理后的PRA差异无统计学意义(P＞0.05), 以A1为100%, 换算为A2和B组的百分比绘制图 3。
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| Using random number table method, Specimen selected from blood samples of 360 patients with hypertension. 图 3 血浆样本采集后处理稳定性 Fig 3 The treatment stability after the plasma sample colletion |
临床评估 296名表面健康人群(男性153例, 女性143例), 均为立位, 无离群值, 年龄为48 (23~82)岁, BMI为(22.55±2.21) kg/m2, 收缩压为(112±17) mmHg, 舒张压为(75±11) mmHg, 血钾为(3.77±0.5) mmol/L。男女分组后人口学资料差异无统计学意义, ALD结果与年龄无相关性(r=0.06)。采用非参数排序法, 将生物参考区间定义为2.5%~97.5%, 得到结果为0.25~5.12 ng·mL-1·h-1(立位)。
方法学比较 360例高血压样本中临床确诊为PA的样本为27例。比较分析LC-MS/MS和RIA结果之间的相关性, Spearman相关检验结果显示r2=0.81, P < 0.05, 两者结果一致性较好(图 4)。Bland-Altman plot图横坐标为两方法所得结果的均值, 纵坐标为两方法之间的相对偏差。与RIA结果相比, LC-MS/MS方法的检测结果的平均偏差为-18.5%。
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| Solid lines represented the mean negative bias.Dotted lines represented 95% limits of agreement. 图 4 LC-MS/MS和RIA检测PRA的BA图 Fig 4 Bland-Altman analysis between LC-MS/MS and RIA for PRA |
临床应用评估 根据两方法检测结果计算ARR, 绘制两种方法的ROC曲线(图 5), 曲线下面积LC-MS/MS为0.983(P < 0.05), RIA为0.894 (P < 0.05)。LC-MS/MS所得PRA计算的ARR对PA的诊断性能更佳。以30作为ARR的切点, LC-MS/MS的灵敏度和特异性分别为96.3%和91.0%, 虽然RIA的诊断特异性(99.4%)较好, 但灵敏度(33.3%)损失严重。
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| 图 5 LC-MS/MS与RIA的ROC曲线 Fig 5 The receiver operating characteristic curve analysis between LC-MS/MS and RIA |
我们使用AB SCIEX® Triple Quad 6500+系统建立了LC-MS/MS检测PRA的方法。PRA的定量分为两个步骤:(1)经过孵育血浆中的血管紧张素原转换为Ang Ⅰ; (2)定量检测Ang Ⅰ。所以PRA的检测实际是Ang Ⅰ水平变化的检测。
PRA的检测在先前的研究中室间一致性结果较差, 这可能是由于标本的分析前和分析中因素等变量所造成。我们的方法在建立过程中不断优化反应条件, 对标本保存方式、孵育时间温度、SPE提取损失、样本吸附等方面进行多次实验, 尽可能减少实验条件对检测造成的分析前和分析中误差, 保证PRA定量的准确性。
在分析前误差分析中, 我们针对样本的采集后处理稳定性和储存稳定性进行了详尽的分析。PRA标本的标准采集转运流程应为:血样采集后30 min内冰浴送检并离心分离血浆, 但在实际操作中, 尤其在住院患者的采样中执行难度较大。在我们的实验中, 标本采集后即刻离心分离血浆, 与全血保存5 h后分离血浆进行检测, 差异无统计学意义, 这也保证了病房采集标本后未能及时送检不会带来结果偏差。在分离血浆后样本储存的稳定性实验中, 血浆标本可在室温、4℃冷藏和-20 ℃冷冻情况下稳定15 h。这也保证了非门诊时间段采样标本分离血浆后储存的稳定性。
该方法经过《液相色谱-质谱临床应用建议》验证及方法学评价, 证明准确可信。在预验证中, 我们评价了方法的特异性、重复性、基质效应和携带污染, 均符合应用建议要求。而在性能验证中, 我们建立的方法在定量下限、线性范围、回收率、不精密度和稀释一致性与多篇文献报道的水平相近。其中, 线性范围为0.084~30 ng·mL-1·h-1, LLMI为0.084 ng·mL-1·h-1, 该线性范围显著优于传统的RIA法, LLMI更是接近传统RIA的1/24, 满足临床PA的诊断需求。不精密度评估中低、中、高值的批内和日间精密度与Carter等[14]的研究结果基本一致。
传统的竞争性RIA所能检测的线性范围在0.2~12.0 ng·mL-1·h-1, 且特异性不佳, 已不能满足临床对于PA的鉴别诊断。化学发光法检测DRC的方法虽能满足临床高通量自动化检测的速率, 且易做到实验室室间不精密度的一致性, 但始终无法避免交叉反应带来的误差。我们建立的LC-MS/MS方法直接测定目标物本身, 同时监测两对离子对, 专属性强、灵敏度高, 有望成为未来的主流检测方法。与RIA结果相比, LC-MS/MS方法的检测结果的平均偏差为-18.5%, 与其他研究结果基本一致[14-15]。这种负偏差在免疫学方法与质谱方法中并不罕见, 主要是由于免疫法使用的抗体与其他类固醇类激素存在交叉反应或其他干扰物质, 缺乏特异性。进一步比较两种方法并绘制ROC曲线, LC-MS/MS的曲线下面积(AUC)大于RIA, 诊断性能更佳, 且在特异性相近的情况下, 灵敏度显著高于RIA, 较好地避免了假阴性所造成的漏诊, 适用于临床初诊高血压低血钾疑似患者的筛查。
鉴于两种方法结果存在的负偏差, 我们收集了296名表面健康人群标本以建立生物参考区间。由于数据为非正态分布, 且该检测项目的上下限均有相应的临床意义, 其中下限的临床意义与PA的诊断密切相关, 因此我们选择2.5%和97.5%作为参考范围上下限。年龄和性别构成对PRA并无影响, 无需分组建立生物参考区间, 最后得到PRA的生物参考区间为0.25~5.12 ng·mL-1·h-1。
综上所述, 本研究利用高灵敏度和高特异性的质谱平台准确定量PRA。该方法已在复旦大学附属中山医院应用于临床, 结果得到了认可。但质谱方法在临床的推广仍存在一定局限性。昂贵的仪器、较高的耗材成本、操作人员专业欠缺、实验室自建检测方法建立有待规范和无法与实验室信息系统对接等问题仍需进一步解决。
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