2019, Vol. 46
临床上, 由于各种疾病的影响, 孕产妇和婴幼儿常常需要接受全身麻醉。常用的全麻药容易透过胎盘进入胎儿体内, 由于胎儿或者婴幼儿的大脑发育不完善, 麻醉药极易通过血脑屏障对发育大脑产生影响[1]。目前, 大量基础研究表明, 全麻药无论是吸入麻醉药还是静脉麻醉药, 均会损伤发育中的大脑, 表现在多个脑区[2-3]或同一脑区的不同类型细胞[4], 并且这种幼年时期由麻醉药所致的神经毒性会延续到成年, 表现为学习记忆等行为的改变[5-6]。2017年美国FDA发出警告, 称反复或长时间暴露于麻醉药或镇痛药会损伤胎儿及3岁以下儿童的大脑发育[7]。尽管目前还没有高质量的临床研究支持这一结论, 但这一问题已引起广泛关注, 改善麻醉药对发育大脑的影响也成为研究的热点。
神经炎症被认为是全麻药神经毒性机制之一。异氟醚可使细胞膜、线粒体膜及内质网上的钙通道发生改变, 增加细胞内钙离子浓度。钙离子浓度的增加导致胞质内的NF-κB活化, 进入细胞核识别目的基因, 促进炎症因子的进一步转录[8-9]。适当的炎症反应对机体修复是有利的, 过度的炎症反应就会对机体造成损伤。瑞芬太尼作为一种短效的阿片受体激动药, 因其独特的药代动力学特性广泛应用于临床, 近年来在婴幼儿中的应用也逐渐增多[10]。有研究发现瑞芬太尼可改善由脂蛋白引起的中性粒细胞激活[11], 并且在肝损伤[12]及肺缺血再灌注损伤[13]等模型中发现有抑制外周炎症的作用。因此, 我们用切口痛模型模拟临床手术操作, 探究在创伤刺激条件下, 瑞芬太尼能否改善新生大鼠多次异氟醚暴露引起的神经毒性。
材料和方法实验动物及分组 孕16~18天的SD大鼠购于上海斯莱克实验动物有限公司。12 h明暗循环, 环境温度20~22 ℃, 自由饮食, 提供充足的食物和水。记录自然分娩的时间。将出生后第7天(postnatal day 7, P7)的同一窝大鼠(12~16 g)随机分为4组:空白组(Sham组)吸入30%空氧混合气体; 异氟醚组(Iso组)吸入1.8%异氟醚; 异氟醚+切开组(Iso+Ⅰ组)吸入1.8%异氟醚同时脚掌切开; 异氟醚+切开+瑞芬太尼(中国宜昌人福药业公司, 批号:6170904)组(Ref组)吸入1.8%异氟醚并皮下输注瑞芬太尼(10 μg·kg-1·h-1), 脚掌切开。所有的实验操作都遵守复旦大学实验动物伦理委员会的相关规定。每组6只用于Western blot和q-RT-PCR实验, 4只用于免疫组化, 10只用于被动回避实验。
麻醉与手术 除Sham组外, 吸入麻醉均采用吸入1.8%异氟醚每天2 h连续3天的方法。碘酒消毒颈部皮肤后, 将24号静脉套管针置于颈部皮下, 并用敷贴固定。每只幼鼠所需瑞芬太尼的剂量根据10 μg·kg-1·h-1计算。自麻醉开始以0.2 mL/h的速度持续泵入, 直至麻醉结束。创伤模型采用Brennan切口痛模型[14]。脚掌切开前先涂碘酒消毒, 再涂丁卡因凝胶进行局麻, 按切口痛模型操作。手术结束后用碘酒再次消毒, 并涂抹丁卡因明胶。第1天切开左侧后脚掌, 第2天切开右侧后脚掌, 第3天将两侧缝合线拆除后, 重新缝合。手术操作结束后, 平均15 min用尖头镊子夹脚掌给予疼痛刺激。每次麻醉暴露结束后, 待翻正反射恢复后再放回到母鼠身边。在每次麻醉之前测量幼鼠的体重, 麻醉过程中观察皮肤黏膜颜色变化及监测呼吸频率。一部分幼鼠在第3天麻醉结束后6 h取海马组织用于Western blot和q-RT-PCR, 灌注取脑用于免疫荧光。另一部分幼鼠麻醉结束后在母鼠的喂养下至第21天断奶, 在第65天进行被动回避实验。
Western blot检测 各组幼鼠在第3天麻醉结束后6 h取材。各组幼鼠直接断头在冰上迅速分离海马组织。将双侧海马组织放入清洁的EP管中, 加入300 μL 4 mmol/L HEPS (40 mmol/L HEPS 5 mL+5.48 g葡萄糖+1片cocktail溶于50 mL蒸馏水中), 冰浴上用匀浆器低速匀浆, 至液体浑浊组织完全裂解; 置于4 ℃离心机(1 000 g×10 min), 取出上清即为胞质蛋白, 沉淀为膜蛋白; 在沉淀里加入150 μL裂解液后超声震荡即可进行后续操作, 或储存于-80 ℃冰箱。用BCA法测量蛋白浓度。将计算好的样品与1×加样缓冲液混匀后, 在100 ℃金属浴中加热5 min, 然后放到冰上冷却。配制12%的分离胶及5%的浓缩胶, 每孔加30 μL配制好的样品, 浓缩胶的电压为60 V, 恒流, 待溴酚蓝跑成一条直线将电压调至100 V, 直至到达距离玻璃板下缘0.5 cm处, 关掉电源。在冰浴中, 100 V恒流电压90 min条件下转膜。用5%脱脂牛奶室温封闭1 h。将PVDF膜放入用含1%脱脂牛奶的TBST稀释的NF-κB p65抗体(美国CST公司, 9 661 s, 1:1 000)与GAPDH抗体(美国Bioworld公司, 1:1 000), β-actin抗体(美国Abcam公司, 1:1 000)摇床室温1 h, 然后置于4 ℃摇床过夜。TBST洗膜4次, 每次15 min。将PVDF膜放入含1%脱脂牛奶的TBST稀释的HRP偶联的二抗室温1 h, 洗膜后化学发光。用Image J 1.50软件进行分析条带。
q-RT-PCR检测 将左侧的海马组织加入0.5 mL Trizol中, 用电动匀浆器充分匀浆, 然后再加入0.5 mL Trizol, 室温下充分裂解5 min, 使核蛋白完全解离; 向1中200 μL三氯甲烷, 剧烈震荡1s, 静止3 min; 4 ℃下10 000×g离心15 min, 取上清。加入等体积的异丙醇, 颠倒混匀, 室温放置10 min; 4 ℃下10 000×g离心10 min, 除去上清液。加入DEPC配制的75%乙醇1 mL, 充分洗涤管壁和管盖, 轻弹管底让沉淀悬浮起来; 4 ℃下10 000×g离心3 min, 弃上清, 超净台中晾干; 加入20 mL DEPC溶解沉淀。对提取的RNA进行定量与定性分析, 随后进行逆转录。
免疫荧光 腹腔注射水合氯醛0.3 mL/kg麻醉, 固定四肢, 暴露胸腔, 将头皮针置入左心室, 剪开右心耳, 灌注生理盐水50 mL后继续灌注4%多聚甲醛50 mL。取出大脑, 用4%多聚甲醛固定24 h, 再分别用20%及30%蔗糖溶液进行梯度脱水。用OCT包埋后置于横冷冰冻切片机内。做冠状切片(30 μm)并收集在24孔板内, 置于原位杂交保护液中-20 ℃保存。清洗脑片:PBS 10 min×2次, 0.3% PBST 10 min×2次; 破胞膜:1% PBST 15 min, 0.3% PBST 5 min×2次; 封闭:10%羊血清封闭1 h; 一抗孵育:1%羊血清与IBA1一抗(美国Wako公司, 1:2 000)涡旋震荡混匀后室温孵育1 h, 置于4 ℃摇床过夜; 复温:37 ℃温箱30 min, 0.3%PBST 5 min×3次; 二抗孵育:1%羊血清与二抗(美国Sigma公司, 1:1 000)涡旋震荡混匀后室温避光孵育1 h, 0.3% PBST 5 min×3次; 贴片, 封片后置于荧光显微镜下观察。
被动回避实验 被动回避实验是经典的检测学习与记忆的行为学测试, 我们在大鼠出生后第65和66天进行被动回避实验。实验设备由明箱(20.3 cm×15.9 cm×21.3 cm)和暗箱(20.3 cm×15.9 cm×21.3 cm)构成, 中间由自动门将明箱与暗箱分隔开。被动回避实验由两部分构成, 一部分是电刺激训练阶段, 另一部分是潜伏期测试阶段。训练阶段是将大鼠从明箱的一侧放入, 10 s后电动门自动打开, 大鼠进入暗箱, 自动门1 min后关闭, 给予大鼠0.5 mA电刺激3 s, 3 min后取出大鼠。第2天进行潜伏期测试, 记录大鼠由明箱进入暗箱的时间。如果大鼠3 min后未进入暗箱, 记作“无反应”。每只大鼠测试完毕后, 清理排泄物并用酒精擦拭, 避免气味对后续大鼠造成影响。
统计学分析 新生大鼠大脑IBA1计数:同一大脑的海马取4个连续切面。用20倍镜观察海马CA1、CA3和DG区IBA1阳性细胞, 并采用相同曝光强度, 同一区域采用相同位置进行观察, Image J 1.50软件计数定量分析。Western blot用Image J 1.50软件作定量分析。所有数据均采用x±s表示, 并用SPSS 20.0.0软件和GraphPad Prism 5.01进行统计学分析。组间比较先行正态性检验和方差齐性检验, 再用One-way ANOVA统计方法。P < 0.05为差异有统计学意义。
结果海马内炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA的相对表达量变化 与Sham组相比, Iso组与Iso+I组IL-1β与TNF-α的mRNA显著增加, 但两组间差异无统计学意义(IL-1β:3.27±0.63 vs.3.32±0.32, P=1.00;TNF-α:3.18±0.64 vs.2.90±0.48, P=1.00), IL-6在各组间表达无明显变化(Sham vs.Iso:1.00±0.00 vs.2.11±0.56, P=1.00;Sham vs.Iso+I:1.00±0.00 vs.3.20±1.15, P=0.367)。然而, 瑞芬太尼显著下调IL-1β和TNF-α的mRNA水平(IL-1β:1.68±0.21 vs.3.32±0.42, P=0.047;TNF-α:1.15±0.20 vs.2.90±0.48, P=0.043), 详见图 1。
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| Sham:Inhaled 30% oxygen and air mixture; Iso:Inhaled 1.8% isoflurane; Iso + I:Inhaled 1.8% isoflurane with plantar incision; Ref:Inhaled 1.8% isoflurane and subcutaneously pump remifentanil (10 μg·kg-1·h-1) with plantar incision.Date were shown as x±s (n=6).(1)P < 0.05, (2)P < 0.005. 图 1 海马炎症因子的mRNA相对表达量 Fig 1 mRNA relative expression of hippocampal inflammatory cytokines |
海马内NF-κB p65蛋白入核比例变化 Western blot结果显示(图 2), Iso+I组海马内胞核和胞质的NF-κB p65比值较Sham组明显升高(1.00±0.00 vs.1.75±0.21, P=0.003), 说明NF-κB p65入核较多。瑞芬太尼能下调NF-κB p65入核量(1.75±0.21 vs. 1.19±0.07, P=0.039)。
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| Date were shown as x±s (n=6). (1)P < 0.05, (2)P < 0.005. 图 2 NF-κB p65蛋白入核比例变化 Fig 2 Ratio of nuclear and cytosolic NF-κB p65 protein |
海马CA1、CA3和DG区IBA1阳性细胞数变化 在海马CA1、CA3和DG区, Iso+I组较Sham组出现较多的IBA1阳性细胞(CA1:54.73±4.79 vs.95.64±5.02, P < 0.005;CA3:36.20±4.25 vs. 67.91±5.51, P < 0.001;DG:32.00±4.26 vs.62.55±5.04, P < 0.001)。Iso+I组与Ref组相比, 瑞芬太尼在CA1和CA3显著减少由异氟醚所致的IBA1数量的增加(CA1:95.64±5.02 vs.70.49±3.84, P=0.008;CA3:67.91±5.51 vs.47.99±4.29, P=0.019), 而在DG区两组之间差异无统计学意义(图 3)。
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| Date were shown as x±s (n=4).(1)P < 0.05, (2)P < 0.005, (3)P < 0.001. 图 3 海马CA1、CA3和DG区IBA1阳性细胞数变化 Fig 3 Change of IBA1 positive cells number in hippocampal CA1, CA3 and DG area |
被动回避实验 与Sham组相比, Iso+I组潜伏期(s)明显缩短(96.50±20.24 vs.30.22±8.97, P=0.03)。在创伤条件下, 与Ref组相比, Iso+I组瑞芬太尼能改善异氟醚所致的潜伏期(s)缩短(118.18±20.74 vs.30.22±8.97, P=0.03)。Iso组与Iso+I组之间潜伏期(s)差异无统计学意义(31.93±11.00 vs.30.22±8.97, P=1.00), 详见图 4。
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| Latency:The time of from the bright box into the dark box.Date were shown as x±s (n=10). (1)P < 0.05, (2)P < 0.005. 图 4 被动回避实验的潜伏期变化 Fig 4 Latency of passive avoidance test |
在体外实验中, 瑞芬太尼被发现可以通过阿片受体和N-甲基-D-天冬氨酸(N-mcthyl-D-aspartic acid, NMDA)受体对发育中的大脑发挥抗凋亡的作用[15], 在我们之前的实验中也发现瑞芬太尼对新生鼠暴露4 h的异氟醚产生的神经毒性有抗凋亡的作用[16]。但瑞芬太尼改善异氟醚所致神经毒性的机制仍不明确。
出生7天的大鼠相当于人类的2~3岁, 此阶段又称“脑发育关键期”。在成熟大脑中, 麻醉药与镇痛药被认为是具有抗炎作用[17], 而对发育中的大脑可能产生促炎作用[18]。γ-氨基丁酸(γ-amino-butyric acid, GABA)受体在发育期被激活后产生神经兴奋作用, 到成年后转变为抑制状态, 由此可能导致从促炎状态转变为抑炎状态[19]。还有研究发现神经元的凋亡释放炎症因子, 这些炎症因子激活小胶质细胞, 促使小胶质细胞进一步分泌炎症因子, 这种恶性循环促使产生炎症瀑布反应[20]。我们的研究中发现多次暴露异氟醚可造成新生大鼠大脑神经炎症反应, 表现为海马炎症因子的mRNA及蛋白表达水平增加, 小胶质细胞活化, 并且这种神经损伤引起的后果会持续到成年, 瑞芬太尼复合异氟醚应用后能改善异氟醚所致的神经炎症与学习记忆障碍。
与以往基础实验不同的是, 我们选择了切口痛模型模拟临床的手术刺激, 切口痛模型被认为是向临床转化的一个较为合理的模型[21]。手术本身可能会引起炎症反应[22]。Shu等[23]发现P7大鼠暴露于70%一氧化氮与0.75%的异氟醚6 h后, 切口痛刺激都会导致皮层和脊髓神经元凋亡及炎症因子表达增加, 并通过条件恐惧实验发现影响了成年后的认知功能。但我们的实验中单纯异氟醚组与异氟醚加手术组相比, 海马炎症因子与小胶质细胞数量变化在两组中并无差异, 说明神经炎症和学习记忆损害更可能是暴露异氟醚而非手术刺激引起, 而瑞芬太尼改善的是异氟醚引起的神经炎症反应, 与切口痛关系可能并不大或者我们选择的这个切口痛模型不足以引起明显的中枢炎症。另外, 我们在切开脚掌前用丁卡因明胶作表面麻醉, 这也会减轻疼痛刺激从而可能会减轻或抑制切口痛的炎症反应。
小胶质细胞/巨噬细胞特异性蛋白抗体IBA1在巨噬细胞和小胶质细胞中表达, 并在这些细胞的活化过程中表达升高。在正常情况下, 小胶质细胞处于一种“静息”状态, 当被某些病理或者生理条件激活后, 在形态及数量上会发生明显变化。活化后的小胶质细胞会产生大量的炎症介质及细胞因子, 而这些炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α被认为参与了中枢炎症反应。当一些外界因素如感染、病毒等入侵时可通过多种信号途径激活NF-κB p65通路, 活化的NF-κB转入到核内与相关的DNA基序结合诱导靶基因的转录, 进而促进炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α等的释放。施庆余[24]发现新生大鼠暴露于1.5%异氟烷2 h后, 海马IL-1β和TNF-α的mRNA表达上调, 分别在麻醉4 h和6 h时达峰值, 并在麻醉停止12 h和24 h后恢复至正常水平; 暴露于1.5%异氟烷4~6 h时, 海马IL-6的mRNA表达上调, 在麻醉停止后恢复至正常水平。在我们的实验中, 麻醉结束后6 h, 海马内炎症因子IL-1β与TNF-α mRNA的表达显著增加, 但IL-6 mRNA的表达在各组中没有变化, 可能与炎症因子在脑损伤后表达出现的峰值时间有关。
本实验不足之处在于, 新生鼠太小而无法进行插管, 也无法记录生命体征相关指标, 但我们通过观察麻醉过程中皮肤黏膜颜色变化及呼吸频率的变化, 判断有无呼吸抑制现象。我们发现1.8%的异氟醚及瑞芬太尼无论是单独使用还是联合使用均不会造成明显呼吸抑制。
综上所述, 在创伤刺激条件, 瑞芬太尼改善异氟醚多次暴露所致新生鼠海马神经炎症可能通过NF-κB p65通路发挥作用。
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