2023, Vol. 50
早在1993年Mclachlan等[1]在坐骨神经损伤模型中发现L5背根神经节（dorsal root ganglion，DRG）内支配血管的交感神经纤维在感觉神经元周围发生芽生并形成篮状结构，这一篮状结构被认为是神经损伤后引起的神经病理性疼痛的解剖学基础。有研究表明DRG处交感节后纤维的芽生与感觉神经元异位放电存在一定程度的平行关系，均集中于中、大直径的神经元[2]。异位电活动与交感神经纤维芽生之间还可能存在相互促进的关系，Xie等[3]在脊神经腹支结扎模型（spinal nerve ligation，SNL）中，电刺激背支发现可以增强自发放电活动，明显增加交感芽生，剪断背支可以显著减少SNL术后的交感芽生，并降低自发活动。
生长相关蛋白43（growth-associated protein 43，GAP43）是一种突触前膜磷酸蛋白，神经损伤早期GAP43的过度表达提示交感神经轴突生长，进而形成异常类突触结构，是构成中枢敏化和神经源性疼痛的重要因素之一。酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）是交感神经分泌神经递质转化为儿茶酚胺类物质的限速酶，是交感神经的标志之一。本研究将GAP43和TH两种蛋白作为交感神经芽生的指标。钠电流是异位电活动的基础，在DRG中存在Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9等钠离子通道亚型，是形成动作电位的基础，研究发现全身应用钠离子通道阻滞剂利多卡因可抑制DRG异位电活动从而减少交感芽生[4]；在神经损伤部位局部应用河豚鱼毒素（tetrodotoxin，TTX）也可以减少神经损伤后3天内交感芽生[5]。正常情况下Nav1.7、Nav1.8主要表达在中小直径神经元，当神经损伤时，外周大、中、小直径的感觉神经元中Nav1.7、Nav1.8表达上调，Nav1.7能耦合Nav1.8，降低感觉神经元中动作电位阈值，使得阈下刺激激活Nav1.8，从失活迅速恢复，并产生高频率的动作电位，从而增加神经元兴奋性，被认为与外周神经损伤后神经元胞体和外周轴突异位电活动相关[6-7]。但是，Nav1.7、Nav1.8与交感芽生之间的关系尚不清楚。我们研究了神经病理性疼痛形成的过程，特别是Nav1.7，Nav1.8与交感神经发芽在神经病理性疼痛形成过程不同时间点的变化特征。
材料和方法实验动物 实验方案经上海交通大学实验动物伦理委员会批准（批准号：20210106-01）并实施。雄性Sprague-Dawley大鼠，体质量180~200 g，由上海交通大学动物实验中心提供并饲养。所有大鼠在标准实验室条件下自由进食和饮水。2019年7月—2021年7月为预实验到正式实验结束。实验周期为21天，大鼠随机分为对照组（Control组）和手术组（SNI组），每组18只。
部分神经损伤模型 大鼠用1%的戊巴比妥钠（50 mg/kg）深麻醉后，根据Decosterd等[8]所用方法建立部分神经损伤（spared nerve injury，SNI）模型：大鼠俯卧位，左大腿外侧切开皮肤约1 cm，钝性分离肌肉，暴露坐骨神经及3个分支：胫神经、腓总神经和腓肠神经，将胫神经和腓总神经用4-0丝紧密结扎，并在结扎远端切开，除去2 mm的远端神经残端，丝线逐层缝合伤口，Control组大鼠仅暴露坐骨神经及其分支，不结扎，余操作同SNI组。
行为学观察 参照文献[9]，分别于术前1天，术后3、7、14、21天17∶00-22∶00，采用Von Frey纤维测痛方法测定机械痛阈（mechanical withdrawal threshold，MWT），使用一系列Von Frey纤维丝垂直刺激左后肢足底，每次持续6 s，同一强度5次，若后足出现快速抬足、抖足、舔足，则视为阳性反应。记录出现缩足反射时的刻度，根据Chaplan等[8]介绍的up-down方法，按照公式计算50%MWT（g）=（10[Xf+kδ]）/10 000。
Q-RT-PCR 术后第7、21天，每组取3只大鼠检测mRNA。大鼠深麻醉（50 mg/kg）后，迅速取出DRG，提取总RNA，引物如表 1，使用逆转录PCR试剂盒得到cDNA，RT-PCR试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）SYBR进行逆转录，得到每个基因CT值，根据2-∆∆CT，计算目的基因相对表达量。
| Gene | Primer sequence（5'-3'） | Product size（bp） |
| Nav1.7-F | CCAGTTGCGACTGTAGGGTT | 20 |
| Nav1.7-R | AGTCGCGAATCGTGGATACC | 20 |
| Nav1.8-F | TCCAGAGAAAGTCGAGTATGCC | 22 |
| Nav1.8-R | GTCATGAGGCGGAACAGTGA | 20 |
| GAP43-F | CCTGTGGGAGTCCACTTTCC | 20 |
| GAP43-R | GGACTCCTCAGAACGGAACA | 20 |
| TH-F | TGTCACGTCCCCAAGGTTCA | 20 |
| TH-R | GCAGGTTGAGAACAGCATTCC | 21 |
| β-actin-F | GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA | 23 |
| β-actin-R | GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG | 24 |
| Nav1.7：Voltage-gated sodium channel 1.7；Nav1.8：Voltage-gated sodium channel 1.8；GAP43：Growth-associated protein 43；TH：Tyrosine hydroxylase. | ||
Western blot 术后7天、21天取DRG组织，强RAPI（RIPA Lysis Buffer）裂解组织蛋白，组织破碎仪破碎组织，4 ℃，16 000×g离心20 min，取上清液，BCA法定量，40 μg蛋白加入7.5%聚丙烯酰胺进行凝胶电泳：80 V 30 min，120 V 60 min，PVDF（polyvinylidene fluoride）膜湿转，200 mA 120 min；5%脱脂牛奶，室温封闭2 h，孵育一抗，兔抗Nav1.7（1∶200）、兔抗Nav1.8（1∶200）、兔抗GAP43（1∶200），均购自以色列Alomone公司，鼠抗TH（1∶1 000，美国Santa公司），4 ℃过夜，TBST摇床洗，室温孵育二抗2h，TBST洗15 min×3次，将PVDF膜放置在洁净的曝光平板上，使用ECL曝光液进行显影，并记录相应实验结果。使用Image J计算灰度值，并在GraphPad Prism中做出柱状图比较蛋白表达的统计学差异。
免疫荧光 术后第7、21天每组取2只大鼠深麻醉，暴露心脏，心尖插管，剪开右心耳，心脏依次灌注生理盐水和预冷的4%多聚甲醛，先快后慢，当尾部出现抽动时停止，取出L5DRG，4%多聚甲醛固定2~4 h，25%蔗糖脱水至沉底；冰冻切片机连续切片，厚度10 μm，防脱载玻片直接贴片后用PBS冲洗，山羊血清+0.5%Triton-X室温封闭30 min，PBS冲洗后分别敷于兔抗Nav1.7（1∶100）、兔抗Nav1.8（1∶100）、兔抗GAP43（1∶100），鼠抗TH（1∶100），4 ℃过夜；去除一抗后，PBS冲洗，室温下避光孵育二抗（山羊抗IgG Alexa Fluor 488标记二抗、山羊抗鼠IgG Alexa Fluor 568）2 h，PBS冲洗，DAPI（4'，6-diamidino-2-phenylindole）染色细胞核，用防荧光淬灭封片液封片，荧光显微镜设置相同曝光时间，伽马数值进行拍摄。
统计学方法 所得计数资料以x±s表示，采用统计软件GraphPad Prism进行数据分析，采用重复测量的多因素方差分析。免疫荧光图片按照Djouhri等[10]的免疫荧光染色的半定量分析法，采用Image J软件对DRG免疫荧光图片进行半定量分析，P < 0.05为差异有统计学意义。
结果大鼠行为学变化 实验过程中，观察到SNI组大鼠在术后第3天开始出现左后足跛行，左后足悬空，缩爪样，并伴有舔足现象；对照组大鼠活动正常。两组大鼠体重稳步增长，差异无统计学意义（图 1A）。两组大鼠机械痛阈变化具有显著统计学意义。两组时间因素F（4，118）=56.66（P < 0.000 1），SNI手术操作F（1，118）=680.1（P < 0.001），组间和组内比较差异均有统计学意义。与对照组相比，SNI组MWT明显降低（P < 0.000 1），且具有时间依赖性（图 1B）。
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| A: Body weight; B: MWT trend. MWT: Mechanical withdrawal threshold. vs. control group, (1)P < 0.000 1. 图 1 两组大鼠体重和机械痛阈变化 Fig 1 Changes of body weight and MWT in rats of the two groups |
Western blot 与Control组相比，SNI组的Nav1.7和Nav1.8自术后第7天开始增加，第21天有明显改变（n=3，P < 0.05，图 2）。GAP43和TH在术后也出现明显增加（n=3，P < 0.05），此时与Nav1.7及Nav1.8都表现为同步增加的趋势。
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| A-B: Western blot analysis of protein expression changes C: Relative protein expression levels D: Relative mRNA expression levels of NAV1.7, Nav1.8, GAP43 and TH. Compared with pre-operation, (1)P < 0.05, (2)P < 0.01, (3)P < 0.001. 图 2 SNI手术对大鼠Nav1.7，Nav1.8及交感神经相关分子转录及蛋白水平的影响 Fig 2 Effects of SNI on the transcription and protein levels of Nav1.7, Nav1.8, GAP43 and TH in rats |
Q-RT-PCR 与对照组相比，SNI组术后第7天GAP43 mRNA、TH mRNA增加，21天最明显；Nav1.7、Nav1.8与GAP43，TH在术后21天均表现出增加趋势（图 2C）。
免疫荧光染色 免疫荧光染色显示Nav1.7、Nav1.8、GAP43在DRG主要分布在神经元细胞胞膜及胞质（正常情况下主要分布在小直径神经元细胞），在神经损伤后，在大、中、小直径神经元上有不同程度的表达增加，在术后21天最明显（n=3，P < 0.05，图 3）。
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| A: Immunofluorescence pictures of different proteins; B-D: Semiquantitative immunofluorescence of Nav1.7, Nav1.8 and GAP43. Compared with the control group, (1)P < 0.05, (2)P < 0.01, (3)P < 0.000 1. Green represents Nav1.7, Nav1.8 and GAP43 (200×), respectively. 图 3 SNI术后大鼠DRG中Nav1.7，Nav1.8，GAP43在不同直径神经元表达 Fig 3 Expression of Nav1.7, Nav1.8 and GAP43 in neurons of different diameters DRG after SNI |
免疫荧光：TH术前基本没有表达，仅在神经元周边观察到细小的纤维，在神经损伤后，TH明显增多，提示交感神经纤维广泛增加，尤其表达在Nav1.7、Nav1.8阳性的神经元周围，形成经典的异常“篮状结构”（图 4），显示术后21天与Nav1.7、Nav1.8同步增加明显。
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| A: TH was co-located with Nav1.7 positive neurons (basket structure) in SNI 21st day; B: TH was co-located with Nav1.7 positive neurons (basket structure) in SNI 21st day. Green represents the expression of Nav1.7 and Nav1.8 positive neurons, red represents sympathetic sprouting, and yellow arrow indicates the basket structure (200×). 图 4 SNI术后大鼠DRG中异常的“篮状结构” Fig 4 Abnormal "basket-like structure" after SNI in DRG of rats |
SNI诱发大鼠机械痛敏感化 在目前对于神经病理性疼痛的研究中，SNI模型可以观察未损伤的腓肠神经支配区域的疼痛反应，疼痛效应具有时间依赖性，能够准确反映临床上神经病理性通透所具有的特征，被认为是神经病理性疼痛模型中最可靠的模型[11-14]。我们建立了大鼠SNI模型，发现与对照组相比，SNI组大鼠出现左后足跛行、拖步、缩爪样、舔足、自发抬脚、自噬等现象，MWT明显下降，发生了机械痛敏感化，且具有时间依赖性（P < 0.000 1，图 1B），此结果与Decosterd等[9]建立经典SNI模型的表现一致，提示建模成功。
神经病理性疼痛形成的过程中，Nav1.7、Nav1.8与交感神经表现出同步增加的趋势神经病理性疼痛形成的外周敏化机制中，DRG起到关键作用[15]。围绕DRG的中大直径神经元周围形成异常的交感-感觉耦联是神经病理性疼痛形成交感神经异常支配机制的结构基础[10]，GAP43、TH异常增生可能是交感神经芽生所形成的篮状结构的原因，异常的篮状结构是疼痛过敏的基础[16-17]，我们将其作为交感芽生的指标之一。既往研究发现，交感芽生和钠离子通道均是外周机制的主要因素，DRG中异常电位与交感芽生相辅相成[18-19, 3, 5-6]，但作为动作电位关键因素的Nav1.7和Nav1.8与交感芽生之间的关系尚不清楚。
我们实验中观察到了芽生和Nav1.7、Nav1.8在不同时间点的变化，不论是术后第7天还是21天，Nav1.7、Nav1.8与交感芽生相关的GAP43和TH在蛋白和转录水平上出现同步增加趋势（P < 0.05，图 2）。可以解释Nav1.7、Nav1.8异常表达增加产生异常动作电位的神经元周围出现交感芽生，两者可能同时或前后出现，相互促进，在我们的实验中仅观察到两者同步。推测Nav1.7、Nav1.8可能作为异位电活动的主要因素和交感神经芽生共同作用，从而促进痛觉异常。
神经病理性疼痛形成的过程中，Nav1.7、Nav1.8和交感神经在DRG内中、大直径同步异常表达正常情况下，Nav1.7优先表达中、小直径神经元及交感神经元，Nav1.8在中、小直径神经元特异性表达[20]。中、大直径神经元主要是Aβ、Aδ纤维，小直径神经元主要是C类纤维，对应不同的感觉类型。我们通过免疫荧光实验，平均荧光强度半定量统计发现，术前Nav1.7、Nav1.8在小直径的神经元上有表达，神经损伤后在中、大直径神经元上出现异常表达，GAP43在中、大直径的神经元上也出现异常表达，除了Nav1.7、Nav1.8与交感芽生同步之外，还发现这种同步现象可能发生在DRG中的中、大直径神经元上（图 4）。同时免疫荧光共定位也发现，手术后Nav1.7与TH共染、Nav1.8与TH共染情况也明显同时增加（图 4），这与之前的蛋白和转录水平结果一致。由于中、大直径神经元主要传导皮肤机械感受器的触压觉等感觉，当神经损伤后DRG上的中、大神经元上异常表达Nav1.7、Nav1.8，并与交感神经形成篮状结构，由此产生的异常细胞膜电位可能是形成异常疼痛的原因之一，即在正常情况下不会引起疼痛的轻触觉引起了疼痛的反应。
我们在实验中发现，NP形成过程中交感神经芽生与Nav1.7、Nav1.8发生了同步变化的现象，且发生在中、大直径神经元附近。因此我们猜想神经损伤后，中、大直径DRG神经元异常表达Nav1.7和Nav1.8，产生异常高频电流，吸引交感神经纤维包裹该神经元，在该位置形成异常的突触连接，芽生的交感神经释放的儿茶酚胺递质通过激活α-肾上腺素受体可能进一步促进神经元中钠通道异常表达，出现高频和/或爆发式放电，进而使得神经元兴奋性增高，产生正反馈作用，放大疼痛信号并向中枢传递，可能是引起痛觉超敏的原因。
本文有一定的局限性：作为前期研究，我们仅对Nav1.7、Nav1.8与交感芽生在神经损伤后不同时间点的变化进行了分析，发现在术后不同时间点出现两者同步增加的趋势。若需进一步证实两者之间的具体关系，后续可分别使用Nav1.7、Nav1.8特异性抑制剂和交感神经阻断技术治疗神经损伤大鼠，并使用膜片钳技术来探究离子通道的功能。
本研究建立了大鼠坐骨神经部分损伤模型，发现Nav1.7、Nav1.8的异常表达和交感神经芽生与神经病理性疼痛有着密切的关系。神经损伤后，交感神经芽生到异常表达Nav1.7、Nav1.8的中、大神经元周围形成的篮状结构可能是疼痛异常的原因。
致谢 上海交通大学李胜天教授及其团队对本次研究设计和实验工作给予了帮助。
作者贡献声明 李笑笑 实验实施，数据整理，论文撰写。陈涵 实验设计与实施，数据整理。李妍妍，朱玉静，张谭 实验实施。唐俊 实验指导，论文审核与修改。
利益冲突声明 所有作者均声明不存在利益冲突。
| [1] |
MCLACHLAN EM, JÄNIG W, DEVOR M, et al. Peripheral nerve injury triggers noradrenergic sprouting within dorsal root ganglia[J]. Nature, 1993, 363(6429): 543-546.
[DOI]
|
| [2] |
XIE W, STRONG JA, MAO J, et al. Highly localized interactions between sensory neurons and sprouting sympathetic fibers observed in a transgenic tyrosine hydroxylase reporter mouse[J]. Mol Pain, 2011, 7: 53.
|
| [3] |
XIE W, STRONG JA, ZHANG JM. Increased excitability and spontaneous activity of rat sensory neurons following in vitro stimulation of sympathetic fiber sprouts in the isolated dorsal root ganglion[J]. Pain, 2010, 151(2): 447-459.
[DOI]
|
| [4] |
ZHANG JM, LI H, MUNIR MA. Decreasing sympathetic sprouting in pathologic sensory ganglia: a new mechanism for treating neuropathic pain using lidocaine[J]. Pain, 2004, 109(1-2): 143-149.
|
| [5] |
XIE W, STRONG JA, LI H, et al. Sympathetic sprouting near sensory neurons after nerve injury occurs preferentially on spontaneously active cells and is reduced by early nerve block[J]. J Neurophysiol, 2007, 97(1): 492-502.
[DOI]
|
| [6] |
MINETT MS, FALK S, SANTANA-VARELA S, et al. Pain without nociceptors?Nav1.7-independent pain mechanisms[J]. Cell Rep, 2014, 6(2): 301-312.
[DOI]
|
| [7] |
KLEINSCHNITZ C, BRINKHOFF J, ZELENKA M, et al. The extent of cytokine induction in peripheral nerve lesions depends on the mode of injury and NMDA receptor signaling[J]. J Neuroimmunol, 2004, 149(1-2): 77-83.
[DOI]
|
| [8] |
DECOSTERD I, WOOLF CJ. Spared nerve injury: an animal model of persistent peripheral neuropathic pain[J]. Pain, 2000, 87(2): 149-158.
[DOI]
|
| [9] |
CHAPLAN SR, BACH FW, POGREL JW, et al. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw[J]. J Neurosci Methods, 1994, 53(1): 55-63.
[DOI]
|
| [10] |
DJOUHRI L, FANG X, OKUSE K, et al. The TTX-resistant sodium channel Nav1.8 (SNS/PN3): expression and correlation with membrane properties in rat nociceptive primary afferent neurons[J]. J Physiol, 2003, 550(Pt 3): 739-752.
|
| [11] |
BOURQUIN AF, SUVEGES M, PERTIN M, et al. Assessment and analysis of mechanical allodynia-like behavior induced by spared nerve injury (SNI) in the mouse[J]. Pain, 2006, 122(1-2): 14.e1-14.
|
| [12] |
WANG X, ZHANG G, QIAO Y, et al. Crocetin attenuates spared nerve injury-induced neuropathic pain in mice[J]. J Pharmacol Sci, 2017, 135(4): 141-147.
[DOI]
|
| [13] |
HAYASHIDA K, EISENACH JC. A Tropomyosine receptor kinase inhibitor blocks spinal neuroplasticity essential for the anti-hypersensitivity effects of gabapentin and clonidine in rats with peripheral nerve injury[J]. J Pain, 2011, 12(1): 94-100.
[DOI]
|
| [14] |
GUIDA F, DE GREGORIO D, PALAZZO E, et al. Behavioral, biochemical and electrophysiological changes in spared nerve injury model of neuropathic pain[J]. Int J Mol Sci, 2020, 21(9): 3396.
[DOI]
|
| [15] |
BERGER AA, LIU Y, POSSOIT H, et al. Dorsal root ganglion (DRG) and chronic pain[J]. Anesth Pain Med, 2021, 11(2): e113020.
|
| [16] |
NOVOTNA I, SLOVINSKA L, VANICKY I, et al. IT delivery of ChABC modulates NG2 and promotes GAP-43 axonal regrowth after spinal cord injury[J]. Cell Mol Neurobiol, 2011, 31(8): 1129-1139.
[DOI]
|
| [17] |
BENOWITZ LI, ROUTTENBERG A. GAP-43: an intrinsic determinant of neuronal development and plasticity[J]. Trends Neurosci, 1997, 20(2): 84-91.
[DOI]
|
| [18] |
董承海, 谢作磊, 樊继云, 等. 异位电活动促使背根神经节交感节后纤维的芽生[J]. 中国科学(C辑: 生命科学), 2001, 31(6): 529-536. [CNKI]
|
| [19] |
DONG C, XIE Z, FAN J, et al. Ectopic discharges trigger sympathetic sprouting in rat dorsal root ganglia following peripheral nerve injury[J]. Sci China C Life Sci, 2002, 45(2): 191-200.
[DOI]
|
| [20] |
DIB-HAJJ SD, CUMMINS TR, BLACK JA, et al. Sodium channels in normal and pathological pain[J]. Annu Rev Neurosci, 2010, 33: 325-347.
[DOI]
|