硬皮病，又称系统性硬化症（systemic sclerosis，SSc），是以皮肤和内脏器官结缔组织的纤维化或硬化、萎缩为特点的系统性自身免疫病，与炎症、血管病变和免疫失调有关^[1]。目前硬皮病的治疗仍以糖皮质激素、免疫抑制剂为主，毒副作用和并发症比较严重^[2-3]；生物制剂如Rituximab（利妥昔单抗）^[4]、Tocilizumab（托珠单抗）^[5]等，虽有一定的近期疗效，但远期疗效和不良反应尚不明确。丹归活血合剂（沪药制字：Z05170927）是复旦大学附属中山医院院内制剂，由丹参、黄芪、鸡血藤、牡丹皮、当归和赤芍等六味天然中药经过水煎法提取而得。在我院已有40余年的临床应用，对改善硬皮病疗效确切，未发现明显毒副作用^[6-7]。然而，其不足之处在于储存时间短、含糖、不易携带，因此有必要对其进行剂型改造。我们建立了博来霉素诱导的硬皮病小鼠模型，采用3种不同工艺提取的制剂治疗硬皮病小鼠，通过观察皮肤和肺组织的炎症和纤维化变化，优选出“丹归活血制剂”药材的最佳提取方法。

材料和方法

实验药物和实验动物  制备工艺1：丹参、黄芪、鸡血藤、牡丹皮、当归和赤芍水煎酒沉法；制备工艺2：丹参、黄芪和鸡血藤水煎酒沉，牡丹皮、当归和赤芍乙醇回流法；制备工艺3：丹参、黄芪、鸡血藤、牡丹皮、当归和赤芍乙醇回流法。由我院药学研究室完成制备，提取物加入蒸馏水制成混悬液。三七通舒胶囊水混悬液由三七通舒胶囊（国药准字Z20030109，成都泰合健康科技集团股份有限公司）溶解于生理盐水配置而成。注射用盐酸博来霉素（15 mg/瓶，日本化药株式会社）溶于0.01 mol/L PBS（pH=7.2），制成浓度为1 mg/mL缓冲液，过滤除菌后分装于EP管中，4 ℃保存备用。

SPF级BALB/c小鼠，6周龄，雌性，体质量约20 g，购自江苏集萃药康生物科技有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（苏）2018-0008。小鼠分笼饲养于我院动物实验中心，实验动物使用许可证号：SYXK（沪）2016-0006。

动物建模、分组与给药  参照文献^[8]，64只BALB/c小鼠背部中央区相同部位剃除被毛（约2.0 cm×2.0 cm），各组均注射浓度为1 mg/mL的盐酸博来霉素缓冲液，0.1 mL/次，1次/天，连续注射28天。造模完成后随机分为8组，每组8只；另设正常对照（F）组8只，皮下注射0.01 mol/L PBS（pH=7.2）。根据小鼠与人折算系数表和医用动物实验学药物干预的高、低剂量设计要求，高剂量设定为低剂量的3.3倍^[9]。计算出丹归活血制剂的使用剂量：工艺1高剂量（AH）组为0.921 g/d，低剂量（AL）组为0.279 g/d；工艺2高剂量（BH）组为1.164 g/d，低剂量（BL）组为0.353 g/d；工艺3高剂量（CH）组为1.105 g/d，低剂量（CL）组为0.308 g/d。模型阳性（D）组三七通舒胶囊剂量为2.48 mg/d。灌胃前，将丹归活血制剂浸膏研磨，加水混匀，现配现用；将三七通舒胶囊溶于蒸馏水制成浓度为12.4 mg/mL的混悬液，现配现用。中药各高剂量组给予溶液0.66 mL/d灌胃，其余各组给予溶液0.2 mL/d灌胃；模型阴性（E）组给予等量生理盐水。连续给药12周，实验结束时获取皮肤和肺组织。本次实验获得复旦大学附属中山医院动物伦理批准（2020-126）。

观察和检测指标

动物一般情况观察  干预过程中观察各组小鼠活动度、皮肤、毛发、体质量、死亡等情况。

组织病理学观察  皮肤和肺部组织用4%多聚甲醛灌注固定，石蜡包埋，切片厚约3 μm。

皮肤厚度检测  HE染色后，每张切片随机取5个部位，测量表皮与皮下组织之间的真皮垂直距离，取5个随机部位的测量均值进行统计分析。

炎症评分  HE染色后，选取皮肤病理切片5个点进行炎症等级评分（半定量分析）^[10]：0级，正常皮肤组织无炎症；1级，皮肤组织少量炎症细胞浸润；2级，皮肤组织轻度炎症细胞浸润；3级，皮肤组织中度炎症细胞浸润；4级，皮肤组织重度炎症细胞浸润。

HE染色后，选取肺组织病理切片5个点进行炎症等级评分（半定量分析）^[11]：0级，正常肺组织无炎症；1级，少量肺泡炎症（+），炎症细胞渗出致肺泡壁增宽，炎症浸润面积 < 20%；2级，中度肺泡炎症（++），炎症浸润面积占20%~50%；3级，严重肺泡炎症（+++），炎症浸润面积 > 50%。

纤维化评分  对皮肤和肺组织切片进行Masson三色染色。采取Image J计算胶原容积分数（collagen volume fraction，CVF），每张切片随机取3处视野（×200），以胶原纤维呈蓝色为阳性，胶原面积百分比=胶原面积/组织总面积×100%。

胶原蛋白含量测定  采用羟脯氨酸试剂盒检测（南京建成生物工程研究所）皮肤和肺组织的胶原蛋白含量。

统计学分析  采用R Studio（版本：3.6）和GraphPad Prism 9软件进行数据统计分析，以α=0.10为方差齐性的检验水准。组间比较满足正态分布和方差齐性的定量资料采用t检验，不满足则采用非参数检验Wilcoxon秩和检验，多重比较采用Bonferroni法进行校正。P < 0.05为差异有统计学意义。

结果

一般情况观察  模型组小鼠精神差，反应迟钝，明显消瘦，皮肤外观硬化增厚、被毛脱失；药物干预过程中，相比于D组，丹归活血制剂组小鼠整体状态均不活跃，以CH组、BH组明显，推测可能与小鼠胃肠道负担过重有关；F组小鼠一般状态良好，反应灵敏，未见消瘦。E组死亡2只，AH组死亡2只，BH组死亡1只，CH组死亡1只，其余各组无死亡。

皮肤的改变

皮肤病理学观察  E组小鼠HE染色结果显示，真皮层显著增厚，胶原纤维束数量增多，形状增粗，排列紧密，向深部扩展至部分替代皮下脂肪组织；Masson染色结果显示，在真皮深部可见典型的血管壁增厚、纤维化（图 1）。F组小鼠皮肤组织无明显病理改变。丹归活血制剂干预硬皮病模型小鼠12周后，皮肤出现明显改善，表现为皮肤炎症减轻、真皮厚度减小及胶原蛋白含量降低（图 2）。

皮肤炎症与纤维化指标观察 E组皮肤炎症（1.33±0.47）较F组（0.44±0.39）明显严重（P=0.006），提示造模成功。丹归活血制剂干预12周后，AH组、AL组和CL组的皮肤组织炎症较E组均明显减轻（P=0.001、0.004和0.039）；各组的皮肤组织胶原纤维均有不同程度减轻，但与E组相比差异均无统计学意义。E组皮肤组织胶原蛋白含量[（4 453.26±1 099.18）μg/g]较F组[（2 810.11±458.45）μg/g]明显增加（P=0.019）；干预后AL组、BH组和CL组的皮肤胶原蛋白含量较E组均明显减少（P=0.034、0.046和0.030）；干预后AL和AH组的皮肤厚度较E组均明显减小（P < 0.001，P=0.006）（表 1）。

肺组织的改变

肺组织病理学观察  E组小鼠HE染色结果显示，肺泡间隔增宽伴炎症细胞淋巴细胞渗出及浸润，肺泡结构破坏，可见肺组织血管增生、扩张；Masson染色可见典型的血管壁增厚、肺间质纤维化；F组小鼠肺泡结构正常；丹归活血制剂干预硬皮病模型小鼠12周后，肺组织出现明显改善，表现为炎症减轻及胶原蛋白含量降低（图 3、图 4）。

肺部炎症和纤维化指标观察  E组小鼠肺部炎症（1.33±0.47）较F组（0.69±0.35）更严重（P=0.030），提示造模成功。丹归活血制剂干预12周后，仅AH组肺部炎症较E组有所减轻（P=0.006），其余各组肺部纤维化均有不同程度减轻，但与E组相比，差异均无统计学意义；E组肺部胶原蛋白含量[（349.22±49.65）μg/g]较F组[（229.30±65.93）μg/g]明显增加（P=0.004）；BH组、CH组、CL组肺部胶原蛋白含量较E组均明显减少（P=0.002、0.016和0.044）（表 2）。

讨论

硬皮病的病因和发病机制不明，临床防治手段有限。根据欧洲硬皮病试验和研究（EUSTAR）数据库数据显示，35%的硬皮病患者因为肺纤维化而死亡，约占总死亡率的20%，是硬皮病最为常见的并发症和首要的死亡原因^[12]。因此，对于硬皮病的早期干预显得尤为重要；硬皮病的治疗目标主要是控制症状，保护皮肤和肺功能，减少疾病的复发和进展，预防治疗相关的并发症，并最终减少其死亡率；因此寻求降低西药不良反应、提高临床疗效、改善患者生存质量的治疗方法和药物，是系统性硬化症研究的重点，中医药占有一定地位。

硬皮病属中医“痹症”范畴，中医学认为，本病多由寒凝血瘀，痰瘀痹阻于皮肤肌肉，皮肉失养所致^[13]。因此，符合中医应用“活血化瘀”治则的指征，我们科根据硬皮病的“血瘀发病论”，曾研制了丹参的各类复方制剂治疗各型硬皮病，对335例各型硬皮病患者采用“益气活血、理气活血、活血化瘀”等治则进行分组治疗，效果满意，疗效均在94.2%以上^[7]。

丹归活血制剂由丹参、黄芪、鸡血藤、牡丹皮、当归及赤芍六味中药组方。君药丹参，入心肝两经，具有活血化瘀、镇静安神的作用。古人有“丹参一味，功同四物”之说，历来被视为活血、养血的要药。现代药理研究表明丹参的化学成分具有广泛的药理活性：能显著抑制硬皮病患者的皮肤成纤维细胞的增殖和胶原合成^[14]；抑制皮肤和内脏器官成纤维细胞增生，防止组织硬化^[15]；抑制炎症细胞浸润和炎症细胞因子的表达，消除创伤皮肤中过量的活性氧簇，改善微循环^[16]等。丹参、黄芪^[17]、赤芍^[18]、当归^[19]、鸡血藤^[20]具有双向调节机体细胞及体液免疫功能的作用；当归、赤芍和牡丹皮^[21]具有抗炎、抗忧郁及镇静、解热、解痉等中枢镇静作用；黄芪、当归、鸡血藤、赤芍和牡丹皮还具有抗氧化、抗肿瘤、抗肺纤维化、清除自由基等作用，为临床治疗硬皮病提供药理依据。

丹归活血合剂是水煎剂，制剂中含有一定的糖类物质，储存时间短，不易携带。因此有必要对其剂型进行改造、探讨和研究。本研究利用盐酸博来霉素诱导BALB/c小鼠构建硬皮病模型，对3种工艺提取的丹归活血制剂对其皮肤和肺组织的炎症与纤维化改变进行观察。结果显示造模组皮肤和肺组织炎症改变较正常对照组明显更严重，提示造模成功，也为进一步的药物观察提供了实验基础。给予不同工艺和剂量的丹归活血制剂干预，并选择三七通舒胶囊作为阳性对照药物。三七通舒胶囊的主要成分三七具有活血化瘀、抗血小板聚集、抗炎等功效^[22]，还被证实具有抗纤维化的作用。结果显示，丹归活血制剂组、三七通舒胶囊组的皮肤和肺组织炎症细胞浸润程度均较模型组减轻，胶原纤维含量减少、真皮厚度、羟脯氨酸含量均降低，丹归活血制剂组上述指标改善情况均优于三七通舒胶囊组。

本研究首次证实丹归活血制剂可改善硬皮病小鼠肺和皮肤的炎症与纤维化，且效果优于三七通舒胶囊，对于皮肤的炎症与纤维化的改善优于肺组织；其中以水煎酒沉法（工艺1）的效果最佳，而低剂量组稍好些，与临床上治疗硬皮病患者的剂量相当；这可能与丹参中水溶性成分（如丹参素、原儿茶醛）起到主要的抗炎以及抗纤维化作用有关。

本研究首次尝试以博来霉素诱导小鼠构建硬皮病模型观察丹归活血制剂的疗效，尚存不足：首先，根据给药组的各指标平均数，提示有改善作用，但有些组未达到统计学意义，应增加每组小鼠数量再进一步观察；其次，药物改善硬皮病模型小鼠皮肤和肺组织炎症和纤维化的具体作用机制仍需要探索，找到其作用的靶点；再次，三七脉通胶囊组对硬皮病的改善作用并不显著，可能因为三七脉通胶囊为肠溶型药物，灌胃后胃酸会影响其药效发挥，可从给药剂量和方式等方面调整。后续研究将探索水煎酒沉法的最佳剂量以及是否具有剂量依赖性，以期为批量生产提供依据。

作者贡献声明  严悦梅，杨荞榕  论文构思和撰写，数据整理，制图，动物模型观察。梁健，杨春欣，沈雄  中药鉴定和制备。秦万章  研究指导。王强  论文构思、指导、修改和审核。

利益冲突声明  所有作者均声明不存在利益冲突。