2021, Vol. 48
结核病（tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）导致的慢性传染性疾病。早期、快速、准确地诊断TB是全球公共卫生领域的重大挑战。TB的传统病原学检测多依赖于涂片法和培养法，但是由于涂片在标本中含有5 000~10 000条抗酸杆菌/mL时才会报阳[1]，灵敏度仅为30%~50%[1-2]；培养作为TB诊断的金标准，虽然灵敏度更高，但是检测耗时（4~8周）[2]、实验室要求高[1]、容易污染[3]。核酸检测技术的出现在一定程度上弥补了传统实验室检测的缺点，其主要包括TB-PCR法、Xpert MTB/RIF（Xpert）、Xpert MTB/RIF Ultra（Ultra）、环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）等。
LAMP在2016年被WHO推荐用于肺结核（pulmonary tuberculosis，PTB）检测[4]，其原理是针对两种靶基因（gyrB、IS6110）上的6个区段设计4个不同的引物，利用链置换反应在一定温度下进行高效特异性扩增反应。这种核酸检测技术操作简单，耗时短，肉眼可见检测结果，适宜在检测条件有限的区域推广。国外研究表明LAMP在检测PTB患者痰标本时的灵敏度为86.0%~99.0%，特异度为94.0%~98.4%[5-6]；而在中国研究相对较少，灵敏度为96.19%~100%[7-8]，这与国外数据相近，且有研究认为对于涂阴痰标本的检测和诊断，LAMP法优于Xpert[9]，以上研究均仅以培养作为诊断标准。虽然已有研究用于评估LAMP法在肺外结核病（extra pulmonary tuberculosis，EPTB）中的诊断价值，但是明显少于痰标本的研究，且结果差异较大，国内相关的临床应用评价则更少。
本研究全面评估LAMP在TB（PTB和EPTB）诊断中的应用价值，同时将其与传统TB诊断检测技术和Xpert进行比较。
资料和方法研究对象 本研究以2018年8月至2019年10月在上海市公共卫生临床中心结核科住院治疗的疑似活动性TB患者为研究对象。纳入标准：（1）有TB的临床表现，咳嗽咳痰≥2周，或痰中带血或咯血等；（2）有相应的影像学证据，如粟粒、斑片、结节、条索影等；（3）近12个月内有活动性TB密切接触史；（4）有免疫学证据支持，PPD或γ-干扰素释放实验（interferon-γ release assay，IGRA）阳性。排除标准：（1）没有完成本研究涉及的检测，或未获得有效的检测结果；（2）缺少明确的临床诊断。本研究以BACTEC MGIT 960液体培养为诊断活动性TB的金标准。确诊TB患者为液体培养阳性且MPB64阳性。TB临床诊断标准参照《肺结核诊断标准（WS 288—2017）》[10]和综合参考标准（composite reference standards，CRS）[11]，若均不符合则为非结核病病例。非结核分枝杆菌（Nontuberculous Mycobacterium，NTM）病指BACTEC MGIT 960液体培养基上有菌落生长，MPB64阴性，且菌种鉴定明确菌种类型的。抗结核活性药物暴露史指有任何一种抗结核活性药物暴露史。
所有患者均记录年龄、性别等基本信息，行胸片或胸部CT、免疫学检测，询问发病情况及是否有抗结核活性药物暴露史。本研究通过上海市公共卫生临床中心伦理委员会审核同意（伦理号：2018-S013-02）。
实验标本与方法
标本采集 呼吸道标本：留取喉咙深部痰或诱导痰；电子荧光气管镜检查后灌洗液、支刷物。肺外标本：胸腹水、穿刺液、尿液、脑脊液等。
实验方法 本研究中采集的实验标本每份都分成4份，分别行以下检测，（1）涂片：按照《中国结核病防治规划痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》中的标准化操作程序检测。涂片阳性指荧光染色结果分级达1+及以上。（2）BACTEC MGIT 960液体培养：将经NaOH前处理过的呼吸道标本加入MGIT 960液体培养管或罗氏改良中培养4~8周。培养基上生长的菌落进行初步胶体金检测，即分枝杆菌蛋白64（mycobacterial protein 64，MPB64）检测。（3）Xpert：按照MTB GeneXpert试剂盒中的说明书进行操作。（4）LAMP：采用日本荣研公司试剂盒。用移液器吸取痰标本或阴性对照40~60 μL加入样本处理管，混合后加热至90 ℃，5 min，再将其旋转安装在吸附剂管上，充分混匀后将样本溶液滴加入扩增反应管，在67 ℃下进行扩增反应40 min，最后通过荧光目视判断结果。
统计学分析 如果样本未进行涂片、培养、LAMP、Xpert中的任一检测，则不被纳入分析。灵敏度（sensitivity，Se）指实际患病人群中某一检测方法的阳性率，特异度（specificity，Sp）指实际未患病人群中某一检测方法的阴性率。阳性预测值（positive predictive value，PPV）、阴性预测值（negative predictive value，NPV）也作为分析指标，95%CI作为总体参数估计指标也一起计算。独立样本的计量资料比较采用t检验，计数资料比较采用χ2检验，P < 0.05为差异有统计学意义。一致性分析采用Kappa（κ）检验。本文主要分析以痰液为标本时不同检测方法间的比较，采用SPSS Statistics 25软件和GraphPad Prism 8软件进行统计分析。
结果研究共入组315例疑似TB患者，包括261例疑似活动性PTB，其中46例提供非痰标本，54例为疑似活动性EPTB患者。
LAMP在痰标本检测中的应用 本研究中有215例疑似活动性PTB患者提供痰标本（图 1），其中31例因检测不全而未被纳入检测，9例患者重复采样而未被纳入统计分析，最终175例纳入分析。男性患者有115人，占65.7%，15岁及以上患者占97.8%，40岁及以上占66.3%。175例中有124例（70.9%）临床诊断PTB，51例（29.1%）为其他呼吸道疾病（包括15例NTM），71例（40.6%）确诊PTB。具有咳嗽和（或）咳痰≥2周患者有73例（41.7%），发热34例（19.4%），咯血或痰中带血27例（15.4%）；影像学检查提示结核可能有119例（68.0%），其中82例呈现典型改变。在124例临床诊断PTB患者中有65例（52.4%）有抗结核活性药物暴露史，59例（47.6%）无抗结核活性药物暴露史。
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| TB:Tuberculosis. 图 1 患者入组及分析流程图 Fig 1 Flow chart of patient enrollment and the results of the diagnostic tests |
LAMP的检测效能及与其他检测方法的比较 175例患者中有86例（49.1%）患者的痰标本培养阳性，其中71例MPB64阳性（确诊PTB），15例MPB64阴性且菌种鉴定证实为NTM菌株。在确诊PTB患者中，LAMP、Xpert及涂片的灵敏度为78.9%（95%CI：68.3~87.1）、84.5%（95%CI：74.8~91.5）和70.4%（95%CI：59.2~80.1），差异无统计学意义。但是，当以采集标本前是否有抗结核活性药物暴露史进行分层时，发现其对这3种灵敏度均有影响。在无抗结核活性药物暴露亚组，LAMP的灵敏度为71.1%（95%CI：56.9~82.7），仍位居第二；在有抗结核药物暴露亚组，LAMP的灵敏度为92.3%，高于Xpert（88.5%）及涂片（73.1%）（表 1）。
| Methods | Se%（95%CI） | Sp%（95%CI） | PPV%（95%CI） | NPV（95%CI） | P（Se） | |||||||||
| Confirmed PTB | Clinical PTB | Confirmed PTB | Clinical PTB | Confirmed PTB | Clinical PTB | Confirmed PTB | Clinical PTB | Confirmed PTB | Clinical PTB | |||||
| LAMP | 78.9（68.3-87.1） | 58.9（50.1-67.2） | 82.7（74.6-89.0） | 98.0（91.2-99.8） | 75.7（65.0-84.3） | 98.6（93.9-99.9） | 85.1（77.3-91.1） | 49.5（39.9-59.2） | - | - | ||||
| AFBsmear | 70.4（59.2-80.1） | 46.0（37.4-54.7） | 82.7（74.6-89.0） | 78.8（65.8-88.0） | 73.5（62.2-82.9） | 83.8（73.8-91.1） | 80.4（72.1-87.0） | 37.4（28.7-46.8） | 0.238 | 0.004 | ||||
| Culture | - | 57.3（48.5-65.7） | - | 70.6（57.2-81.7） | - | 82.6（73.5-89.4） | - | 40.4（30.7-50.8） | - | 0.860 | ||||
| Xpert | 84.5（74.8-91.5） | 61.3（52.5-69.5） | 84.6 (76.8-90.6) | 100 | 78.9（68.8-86.9） | 100 | 88.9（81.6-94.0） | 51.5（41.7-61.2） | 0.388 | 0.629 | ||||
| Se:Sensitivity; Sp:Specificity; PPV:Positive predictive value; NPV:Negative predictive value; Confirmed PTB:Confirmed pulmonary tuberculosis; Clinical PTB: Clinical pulmonary tuberculosis. | ||||||||||||||
LAMP（82.7%，95%CI：74.6~89.0）、Xpert（84.6%，95%CI：76.8~90.6）和涂片（82.7%，95%CI：74.6~89.0）的特异度均相近。阳性预测值方面，LAMP也与Xpert相近。阴性预测值以Xpert最高，LAMP次之。
对于确诊PTB患者的检测，我们发现LAMP与Xpert的一致性中等（κ=0.438）；与涂片的一致性一般（κ=0.336）。
在124例临床诊断PTB中，涂片的灵敏度（46.0%）最低（表 2），且与LAMP、Xpert的灵敏度差异有统计学意义（涂片vs. LAMP，P=0.004；vs.Xpert，P=0.001）。LAMP的灵敏度为58.9%（95%CI：50.1~67.2），Xpert为61.3%（95%CI：52.5~69.5），培养为57.3%（95%CI：48.5~65.7），这3种检测方法灵敏度的差异均无统计学意义。由分层分析（表 2）可知，在无抗结核活性药物暴露亚组，LAMP（54.8%，95%CI：43.4~65.8）的灵敏度位居第三，但与培养、Xpert相近，差异无统计学意义；在有抗结核活性药物暴露亚组，LAMP的灵敏度（64.7%，95%CI：51.1~76.7）最高，明显高于涂片的灵敏度（49.0%，95%CI：35.7~62.5，P=0.008），培养的灵敏度降至51.0%（95%CI：37.5~64.3），Xpert的灵敏度为62.7%（95%CI：49.1~75.0）。
| Methods | Confirmed PTB | Clinical PTB | |||||||
| Without exposure history（n=45） | With exposure history（n=26） | Pa | Pb | Without exposure history（n=73） | With exposure history（n=51） | Pa | Pb | ||
| LAMP | 71.1（56.9-82.7） | 92.3（77.5-98.4） | - | - | 54.8（43.4-65.8） | 64.7（51.1-76.7） | - | - | |
| AFB smear | 68.9（54.5-80.9） | 73.1（54.3-87.1） | 1.000 | 0.063 | 43.8（32.9-55.3） | 49.0（35.7-62.5） | 0.115 | 0.008 | |
| Culture | - | - | - | - | 61.6（50.2-72.2） | 51.0（37.5-64.3） | 0.383 | 0.065 | |
| Xpert | 82.2（69.2-91.2） | 88.5（72.3-96.6） | 0.125 | 1.000 | 60.3（48.8-70.9） | 62.7（49.1-75.0） | 0.344 | 1.000 | |
| Se: Sensitivity; Confirmed PTB: Confirmed pulmonary tuberculosis; Clinical PTB: Clinical pulmonary tuberculosis.a:Without exposure history; b:With exposure history. | |||||||||
结合临床症状分析发现，在咳嗽和（或）咳痰≥2周的52例PTB患者中，LAMP的阳性率为75.0%（39/52），而在其他72例患者中的阳性率为47.2%（34/72），Xpert（71.1% vs. 51.4%）、涂片（57.7% vs. 37.5%）、培养（69.2% vs. 48.6%）在两组的阳性率比较仍有待进一步验证；在17例咯血或痰中带血的PTB患者中，LAMP、Xpert、涂片、培养的阳性例数分别为8、8、6、6例；在24例发热PTB患者中，LAMP、Xpert、涂片、培养的灵敏度为分别75.0%（18/25）、70.8%（17/24）、66.7%（16/24）、54.2%（13/24）。
LAMP的特异度为98.0%，阳性预测值为98.6%，低于Xpert，特异度、阳性预测值均为100%。而涂片和培养由于NTM的影响，特异度及阳性预测值均不高，培养的特异度仅70.6%。在阴性预测值方面，LAMP高于涂片和培养，略低于Xpert。
一致性检验发现：LAMP与Xpert的一致性较强（κ=0.714）；LAMP与涂片、培养的一致性中等（LAMP vs.涂片，k=0.555；LAMP vs.培养，κ=0.470）。
LAMP、Xpert、培养检测效能与样本中MTB菌量的关系 根据涂片结果，样本可分为5个等级（0~4+）。124例临床诊断PTB患者的痰涂片阴性率为54.0%（67/124），此时培养、LAMP、Xpert的阳性率最低，但是差异无统计学意义（P=0.708）。各种检测技术的阳性检出率随着涂片等级增加而提高，在涂片3+及4+的样本中的检出率均为100%。在同一涂片等级时，各种方法的灵敏度虽有差异，但是差异均无统计学意义（表 3）。
| AFB smear（n） | LAMP | Culture | Xpert | |||||
| Se (%) | Case（n） | Se (%) | Case（n） | Se (%) | Case（n） | |||
| 0（67） | 32.8 | 22 | 31.3 | 21 | 38.8 | 26 | ||
| 1+（9） | 66.7 | 6 | 66.7 | 6 | 44.4 | 4 | ||
| 2+（15） | 80.0 | 12 | 73.3 | 11 | 86.7 | 13 | ||
| 3+（8） | 100 | 8 | 100 | 8 | 100 | 8 | ||
| 4+（25） | 100 | 25 | 100 | 25 | 100 | 25 | ||
| Total（124） | 58.9 | 73 | 57.3 | 71 | 61.3 | 76 | ||
| Se: Sensitivity. | ||||||||
在临床诊断PTB的培阴样本中，LAMP与Xpert的检出率相似（P=1.000），且两者的检出率均明显高于涂片（P < 0.05）；虽然在21例培阳涂阴样本中，LAMP仅检出12例，低于Xpert的16例，但是在4种类型标本中，两者的检出率差异均无统计学意义。而且LAMP与Xpert检测结果的一致性较强（κ=0.778），与涂片的一致性中等（κ=0.485）。
LAMP在非痰标本中的应用研究 共有100例患者提供了非痰标本，其中20例因检测不全而被排除，最终80份样本数据纳入分析。具有相应器官或部位临床症状及体征者有64例（80.0%）；影像学检查异常者有72例（90.0%）。80例中有47例（58.75%）临床诊断TB，其中18例诊断为PTB，标本类型为灌洗液、支刷物、胃液，29例标本类型为尿液、脑脊液等，诊断为EPTB；有13例（16.25%）确诊TB。在47例临床诊断TB中有19例（40.4%）有抗结核活性药物暴露史，28例（59.6%）无抗结核活性药物暴露史。80份非痰标本中有25份（31.25%）胃液，16份（20.20%）灌洗液，10份（12.50%）脑脊液，10份（12.50%）胸水，6份（7.50%）尿液，5份（6.25%）支刷物，4份（5.00%）穿刺液，2份（2.50%）粪便，腹水和组织各1份（1.25%）。
LAMP的检测效能及与其他检测方法的比较 LAMP的灵敏度为61.5%（8/13），Xpert的灵敏度为76.9%（10/13），均高于涂片（30.8%）。对于在采集样本前有抗活性结核药物暴露史的3例患者，Xpert均提示阳性且利福平耐药，而LAMP及涂片法检出2例；在无抗结核药物暴露史亚组的10例患者中，LAMP及Xpert阳性例数分别为6例和7例，涂片仅检出2例阳性，且涂片等级均为1+。
LAMP的特异度（92.5%，95%CI：84.4~97.1）高于Xpert（91.0%，95%CI：82.5~96.2），均低于涂片（98.5%，95%CI：93.2~99.8）。
LAMP与培养法的的灵敏度（27.7%，95%CI：16.5~41.5）一致，次于Xpert的灵敏度（34.0%，95%CI：21.8~48.2），三者差异无统计学意义，且明显高于涂片的灵敏度（10.6%，95%CI：4.2~-21.8）（P均 < 0.05）。以采集标本前患者是否有抗结核药物暴露史进行分组，分析发现在19例有抗结核活性药物暴露史亚组，LAMP的灵敏度与Xpert相同，均为26.3%（5/19），培养法检出3例阳性，涂片仅检出2例阳性；在28例无抗结核活性药物暴露史亚组，LAMP的灵敏度为28.6%（8/28），仅次于Xpert（39.3%，11/28）及培养（35.7%，10/28），涂片检出3例阳性。所有涂阳标本LAMP及Xpert检测均提示阳性；在33份培阴涂阴标本中，LAMP、Xpert分别检出4例（12.1%）、5例（15.2%）阳性；在9份培阳涂阴标本中，LAMP、Xpert分别检出4例（44.4%）、6例（66.7%）阳性。
讨论通过本研究发现，用于诊断TB时，相比传统的病原学检测方法，LAMP的灵敏度和特异度均有提高，这与文献报道一致[5, 12]，而且与Xpert的检测效能差异并不明显。一致性检验提示LAMP与Xpert一致性较强，与培养的一致性中等。可见在临床应用中，与传统病原学检测方法，尤其是涂片相比，LAMP的高灵敏度有助于快速、准确地诊断TB。
本研究通过亚组分析发现抗结核活性药物的暴露对结核菌涂片、培养及分子生物学检测等方法均有影响，且对结核菌培养的影响大于对涂片及分子生物学检测的影响，培养的灵敏度在有抗结核活性药物暴露史后降低，而其他方法均有不同程度的提高。本研究的抗结核活性药物暴露亚组中12%的患者的痰标本为涂阳培阴，主要是由于抗结核活性药物的暴露降低了Mtb菌株活性，导致培养困难及灵敏度降低[5]，而死菌排出仍保留抗酸染色的特性[13]。另外，对于有抗结核活性药物暴露史的患者，LAMP的灵敏度优于结核菌培养，这与既往研究相符[5]，因为核酸在菌株死亡后仍能存留较长时间[14]。在临床工作中，患者在诊断TB前常会被按照社区获得性肺炎或院内获得性肺炎予以抗感染处理，常用的抗感染药物中氟喹诺酮类、碳青霉烯类等均有较强的抗结核活性[15]，这为结核菌的检出带来一定的挑战。鉴于喹诺酮等抗生素的广泛使用，对有抗结核活性药物暴露史的患者使用分子生物学方法检测结核菌优于结核菌培养法。同时，该研究也表明，在抗结核治疗的过程中，分子生物学方法不能替代结核菌培养用于疗效监测[13]。
此项研究还表明LAMP在菌量较多的PTB中有助于早期诊断，但是对少菌型PTB诊断的准确性都仍有待提高。另一新型核酸检测技术Ultra的出现可能解决目前常用检测方法对少菌型TB检出率低的问题[14]。研究中出现的1例LAMP假阴性患者在随访中被证实为TB合并NTM肺病，这可能与实验时吸取标本的部分有关，如未吸取脓痰部分而吸取稀薄部分。
本次研究中有15例NTM肺病，包括脓肿分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌等感染引起的肺病。由于受NTM影响，涂片和培养的特异度均不高，而LAMP与包括堪萨斯分枝杆菌等16种非结核分枝杆菌无交叉反应性。在本次研究中LAMP出现1例假阳性，这例NTM肺病患者既往有结核病史。关于同样以核酸检测为原理的Xpert检测法的研究指出，有7%的患者在治疗结束后的5~19个月可出现Xpert假阳性[16]，这是因为Xpert检测方法无法将不完整的、死细胞中的基因组DNA剔除[17]，且与宿主对其清除延迟有关[16]，免疫低下者更甚，本例的LAMP假阳性患者为老年女性，因此考虑为痰标本中含有Mtb死菌引起，但是在此次确诊前诊断性抗结核治疗3个月，因此也不排除患者同时患有TB合并NTM肺病的可能。
本研究发现，在非痰标本中，LAMP法的检测效能相比涂片法有所提高（61.5% vs.30.8%；27.7% vs. 10.6%），而相比Xpert差异无统计学意义（P=0.453）。LAMP检测方法能检出所有涂阳标本，即在培阳涂阳标本中的灵敏度为100%（4/4）。而且由于非痰标本含菌量少，无论是Mtb还是NTM，4种检测方法的特异度均较高。这说明LAMP法适用于非痰标本检测。
目前EPTB有增加趋势[18-19]，有调查显示中国EPTB约占33.4%[20]，目前仍需新型的、高效的的实验室检测技术，以期更早期、准确地检出活动性EPTB。本次研究中LAMP法用于非痰标本时，相对于传统检测病原学检测方法及其他核酸检测技术，并未显示出明显的优势：一是由于本项研究中所入组非痰标本的菌量低[21]；二是每项研究所入组标本类型及各类型标本数所占比例不同；三是由于非痰标本样本量少，培养阳性的样本数更少，结果并不具有代表性；四是非痰标本类型多但单一类型的标本数量极少。此项研究无法得出LAMP法在各种类型标本中的检测效能，因此并不能明确评估LAMP法在EPTB中的应用价值。
本研究的可取之处在于包括胃液、灌洗液、穿刺液等多种类型的非痰标本，但存在一定的局限性，主要为样本量的限制导致部分灵敏度差异并不显著，此外所有患者均为HIV检测阴性人群，未验证LAMP在HIV合并TB人群中的检测效能。
LAMP在TB的诊断中具有较好的灵敏度和特异度，与Xpert检测结果一致性较高，与培养一致性中等，优于结核菌涂片法；在有抗结核活性药物暴露史的患者中，LAMP有可靠的检出率。LAMP操作简单，可通过肉眼直接判定结果，操作人员即使没有专业的分子检测技术经验仍可独立完成检测，因此具有较高的应用前景。
作者贡献声明 林晶晶 收集样本，实验，数据统计分析及论文撰写。夏露，刘旭晖 样本收集，统计指导，论文修改。魏剑浩 参与实验。席秀红，黄威，李涛 样本收集。卢水华 实验设计和安排，论文指导及修改。
利益冲突声明 所有作者均声明不存在利益冲突。
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